一種假單胞菌脂肪酶基因及其應用的製作方法
2023-09-17 10:37:15
專利名稱：一種假單胞菌脂肪酶基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種編碼假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶WJLIPASE1的基因。本發 明還涉及所述基因在脂肪酸代謝和生產生物柴油方面的應用。
背景技術：
生物(酶)法生產生物柴油是以油脂為原料，在常溫常壓下利用脂酶(脂肪酶) 作為催化劑合成而得，具有條件溫和、甲醇用量少和能耗低、環保性能好等優點。
由於生物(酶)法生產生物柴油必須添加甲醇或乙醇，另外，在生物(酶)法合成 柴油的同時，會得到附產品甘油，而酶在甲醇或乙醇等中容易失活，並且甘油也會在一定程 度上影響酶活性。因此目前的脂肪酶活性較低。
所以需要開發能夠提高酶活性的脂肪酶。
在對現有技術文獻的分析中，至今尚未發現假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶在生 產生物柴油有關的任何報導。發明內容
本發明的目的是從假單胞菌I^seudomonas sp中克隆出一種脂肪酶蛋白基因。該 基因的核苷酸序列編碼的脂肪酶蛋白可用於生產生物柴油.
本發明從假單胞菌I^seudomonas sp獲得了如SEQ ID NO 1所示序列的DNA分 子，並經實驗證實由SEQ ID NO :1編碼的蛋白具有脂肪酶的功能。所述脂肪酶蛋白命名為 WJLIPASE1，其胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
從公共資料庫GenBank和Swissprot中已釋放的脂肪酶基因序列，用ClustalW進 行多序列比對，利用生物信息軟體分析脂肪酶的轉脂位點保守區和蛋白的穩定化和摺疊的 結構功能區域，選擇假單胞菌I3Seudomonas sp提取RNA，採用RACE方法(GibcoBRL試劑盒) 進行cDNA全長克隆，獲得脂肪酶蛋白基因，將脂肪酶基因轉化大腸桿菌(pET22 a/b系列表 達載體)，獲得高效產生脂肪酶的大腸桿菌菌株。使得其重組蛋白含量達到30%以上，發酵 液酶活達可達8620U/ml以上，純化後製得酶活可高達^K)00U/g的粉狀脂肪酶。利用該酶 生產生物柴油應用試驗，使可使生物柴油含量>98.5%，總回收率> 92.6%。
在本發明的一個方面，提供了 一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有 WJLIPASE1蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1中從 核苷酸第133-1980位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中 度嚴緊條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述 的序列編碼具有SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離出的W幾IPASEl相關蛋白質多肽，它包括 具有SEQ ID NO. 1胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生 物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO. 1序列的多肽。
在本發明還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞，它是原核或真核細胞。在實 例中該宿主細胞是大腸桿菌。
在本發明中，DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出 來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨 其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「WJLIPASE1蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有WJLIPASE1蛋 白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第133-1980位核苷酸序列及其簡併序列。 該簡併序列是指，位於SEQ ID NO. 3序列的編碼框第133-1980位核苷酸中，有一個或多個 密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所 以與SEQ ID NO. 3中第133-1980位核苷酸序列同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出 SEQ IDN0.3所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與 SEQ ID NO. 3中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括 與SEQ ID NO. 3中從核苷酸第133-1980位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少 80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶相同功能的 蛋白的SEQ ID N0. 3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若 幹個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插 入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內， 更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，術語「假單胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1蛋白或多肽」指具有 WJLIPASE1蛋白活性的SEQ ID N0. 3序列的多肽。該術語還包括具有與天然假單胞菌 Pseudomonas sp脂肪酶相關相同功能的、SEQ ID N0. 4序列的變異形式。這些變異形式包括 (但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個) 胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個 以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或 相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶相關蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的假單胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1多肽的變異形式包括同源序 列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與假單 胞桿菌脂肪酶相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗假單胞菌I^seudomonas sp W幾IPASEl多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發明中，「假單胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1保守性變異多肽」指與SEQ ID N0. 3的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質 相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產 生。
表1胺基酸替換表
權利要求
1.一種假單胞菌I^seudomonas sp脂肪酶基因，其鹼基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種脂肪酶基因，其鹼基序列中含有SEQ ID NO. 1所示序列中第133-1980位的核苷酸。
3.一種脂肪酶基因，其鹼基序列與SEQ ID NO. 1所示序列中第133-1980位的核苷酸至 少有70%的同源性；或者能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1中第133-1980位的核苷酸 序列雜交。
4.一種脂肪酶蛋白，其特徵是含有SEQ ID N0. 2所示胺基酸序列的多肽、或其保守性變 異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.權利要求1所述的脂肪酶基因轉化的宿主細胞，包括原核細胞或真核細胞。
6.權利要求1 3中任一所述基因在脂肪酸代謝中的應用。
7.權利要求1 3中任一所述基因在生產生物柴油中的應用。
全文摘要
本發明從假單胞菌Pseudomonas sp中獲得了如SEQ ID NO1所示序列的基因，並經實驗證實該基因編碼的蛋白具有脂肪酶的功能，可用於生產生物柴油。
文檔編號C12N15/63GK102031264SQ20101054860
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月17日 優先權日2010年11月17日
發明者王勁 申請人:西南科技大學