細胞骨架樣基因的編碼蛋白特異性抗體的製作方法

2023-09-14 17:25:15

專利名稱：細胞骨架樣基因的編碼蛋白特異性抗體的製作方法
技術領域：
本發明屬於人類基因組技術領域。
本發明所述細胞骨架樣基因(JWA)是發明人在美國加州大學戴維斯(UCDavis)訪問研究期間(1996.3～1998.3)用DD-PCR，噬菌體篩選法，RACE-PCR等方法從人氣管支氣管上皮細胞構建的cDNA文庫中克隆的與細胞骨架有關的全新基因。該基因全長cDNA序列為2107bp，其開放讀框序列為564bp，共編碼188個胺基酸。進一步研究顯示JWA基因開放讀框序列中含有三個膜轉運區，每個區含有23個胺基酸，在三個膜轉運區的兩端有蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點。Northern雜交分析顯示該基因有兩個大小不同的mRNA轉錄物，經反向轉錄，3′-RACE-PCR,Southern雜交分析和Rnase Protection Assay等研究已確定兩個轉錄物的確切終止位置。用攜帶JWA基因開放讀框序列的表達載體(PCMV-2-Flag-JWA)轉染S-6和HBE細胞後的免疫螢光染色結果顯示JWA基因編碼的蛋白酷似細胞骨架微管。該蛋白明顯地受去聚合劑colchicine和nocodazole的影響但不受冷處理的影響。另外，該基因在幾種腫瘤細胞中的表達明顯地受去甲基化藥物5-azacytidin的影響。
由於JWA基因序列在GenBank資料庫中尚無同源性基因，故發明人對於JWA基因的結構和功能研究結果全部是開創性的。美國國家生物技術情報中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)已於最近正式接受JWA基因作為GenBank的新成員。該基因編號為「BankIt 200994,Accession Number:AF070523＂。GAATTCGGCACGAGCCGAGACAGAGCCGCTGTCAACTCTCCAACTCAGCTCAGCTGATCGGTTGCCGCCGCCGCCGCCGCCAGATTCTGGAGGCGAAGAACGCAAAGCTGAGAACATGGACGTTAATATCGCCCCACTCCGCGCCTGGGACGATTTCTTCCCGGGTTCCGATCGCTTTGCCCGGCCGGACTTCAGGGACATTTCCAAATGGAACAACCGCGTAGTGAGCAACCTGCTCTATTACCAGACCAACTACCTGGTGGTGGCTGCCATGATGATTTCCATTGTGGGGTTTCTGAGTCCCTTCAACATGATCCTGGGAGGAATCGTGGTGGTGCTGGTGTTCACAGGGTTTGTGTGGGCAGCCCACAATAAAGACGTCCTTCGCCGGATGAAGAAGCGCTACCCCACGACGTTCGTTATGGTGGTCATGTTGGCGAGCTATTTCCTTATCTCCATGTTTGGAGGAGTCATGGTCTTTGTGTTTGGCATTACTTTTCCTTTGCTGTTGATGTTTATCCATGCATCGTTGAGACTTCGGAACCTCAAGAACAAACTGGAGAATAAAATGGAAGGAATAGGTTTGAAGAGGACACCGATGGGCATTGTCCTGGATGCCCTAGAACAGCAGGAAGAAGGCATCAACAGACTCACTGACTATATCAGCAAAGTGAAGGAATAAACATAACTTACCTGAGCTAGGGTTGCAGCAGAAATTGAGTTGCAGCTTGCCCTTGTCCAGACCTATGTTCTGCTTGCGTTTTTGAAACAGGAGGTGCACGTACCACCCAATTATCTATGGCAGCATGCATGTATAGGCCGAACTATTATCAGCTCTGATGTTTCAGAGAGAAGACCTCAGAAACCGAAAGAAAACCACCACCCTCCTATTGTGTCTGAAGTTTCACGTGTGTTTATGAAATCTAATGGGAAATGGATCACACGATTTCTTTAAGGGAATTAAAAAAAATAAAAGAATTACGGCTTTTACAGCAACAATACGATTATCTTATAGGAAAAAAAAAAATCATTGTAAAGTATCAAGACAATACGAGTAAATGAAAAGGCTGTTAAAGTAGATGACATCATGTGTTAGCCTGTTCCTAAATCCCTAGAATTGTAATGTGTGGGATATAAATTAGTTTTTATTATTCTCTTAAAAATCAAAGATGATCTCTATCACTTTGCCACCTGTTTGATGTGCAGTGGAAACTGGTTAAGCCAGTTGTTCATACTTCCTTTACAAATATAAAGATAGCTGTTTAGGATATTTTGTTACATTTTTGTAAATTTTTGAAATGCTAGTAATGTGTTTTCACCAGCAAGTATTTGTTGCAAACTTAATGTCATTTTCCTTAAGATGGTTACAGCTATGTAACCTGTATTATTCTGGACGGACTTATTAAAATACAAACAGACAAAAAATAAAACAAAACTTGAGTTCTATTTACCTTGCACATTTTTTGTTGTTACAGTGAAAAAAATGGTCCAAGAAAATGTTTGCCATTTTTGCATTGTTTCGTTTTTAACTGGAACATTTAGAAAGAAGGAAATGAATGTGCATTTTATTAATTCCTTAGGGGCACAAGGAGGACAATAATAGCTGATCTTTTGAAATTTGAAAAACGTCTTTAGATGACCAAGCAAAAAGACTTTAAAAAATGGTAATGAAAATGGAATGCAGCTACTGCAGCTAATAAAAAATTTTAGATAGCAATTGTTACAACCATATGCCTTTATAGCTAGACATTAGAATTATGATAGCATGAGTTTATACATTCTATTATTTTTCCTCCCTTTCTCATGTTTTTATAAATAGGTAATAAAAAATGTTTTGCCTGCCAATTGAATGATTTCGTAGCTGAAGTAGAAACATTTAGGTTTCTGTAGCATTAAATTGTGAAGACAACTGGAGTGGTACTTACTGAAGAAACTCTCTGTATGTCCTAGAATAAGAAGCAATGATGTGCTGCTTCTGATTTTTCTTGCATTTTAAATTCTCAGCCAACCTACAGCCATGATCTTTAGCACAGTGATATCACCATGACTTCACAGACATGGTCTAGAATCTGTACCCTTACCCACATATGAAGAATAAAATTGATTAAAGGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAGJWA基因cDNA序列MDVNIAPLRAWDDFFPGSDRFARPDFRDISKWNNRVVSNLLYYQTNYLVV 50AAMMISIV(1)GFLSPFNMILGGIVVVLVFTGFVWAAHN(2)KDVLRRMKKRYPTT100FVMVVMLASYFLISMFGGVMVFVFGITFPL(3)LLMFIHASLRLRNLKNKLEN 150KMEGIGLKRTPMGIVLDALEQQEEGINRLTDYISKVKE 188JWA基因開放讀框胺基酸序列序列中(1),(2),(3)為三個膜轉運區，SDR和SLR為PKC磷酸化位點本發明的目的是鑑於JWA基因是本發明人發現的全新基因，目前人類對此基因的認識和了解僅限於本發明人所做的科學研究工作。本發明人用NorthernBlot,Western Blot，基因轉染和螢光免疫組織化學染色等方法研究證實，JWA基因表達一種新的細胞骨架蛋白。該基因廣泛存在於所研究的多種組織和細胞，其mRNA的表達受誘導分化劑維甲酸(Retinoid acids)，氧化劑過氧化氫(H2O2)，去甲基化藥物(5-Azacytidin)等的明顯影響該基因編碼蛋白的表達明顯地受去聚合劑秋水仙素(Colchicine)和Nocodazole的影響以及熱休克處理等的影響。JWA基因的進化保守，表達活躍的特徵提示該基因具有十分活躍的生物學功能。尤其是其作為一種新的細胞骨架蛋白，對細胞的增殖和分化都有非常重要的作用。進一步研究JWA基因編碼蛋白在細胞內的確切定位，有助於對該基因生物學功能的了解。而基因編碼蛋白特異性抗體則是研究基因結構和功能的不可缺少的重要工具。JWA基因編碼蛋白多克隆和單克隆特異性抗體，可用作免疫組織化學染色，ELISA，免疫電鏡，免疫沉澱等多種根據免疫學原理設計的檢測方法。可用於該基因編碼蛋白在組織細胞中的定位和定量研究，在各種生物樣本(如血液，尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質-蛋白質相互作用研究等。
本發明的技術方案是JWA基因全部開放讀框胺基酸序列(共188個胺基酸，見本申請所列)，特別是含有親水胺基酸區的C末端15個胺基酸，N末端30個胺基酸，第80～100個胺基酸和第135～155個胺基酸序列。選擇上述序列中的部分序列合成多肽，與KLH載體蛋白結合後，用完全和不完全佐劑混合，免疫紐西蘭兔(200ug/兔/次，每周激發注射一次)，製備多克隆抗體(anti-JWA IgG)；免疫Balb C鼠(100ug/鼠/次，每月激發注射一次)，分離脾臟B淋巴細胞並和骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，進一步用亞克隆方法，ELISA法和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，製備單克隆抗體(anti-JWA IgG)。
本發明實施例1．細胞骨架樣基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取合成的JWA基因編碼胺基酸C末端15個胺基酸多肽(序列為DALEQQEEGINRLTD，分子量1731)10mg，與載體蛋白KLH(Keyhole LimpetHymocyanin)結合，經透析後再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫紐西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發注射一次，於三個月後取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進一步用抗原作競爭抑制免疫試驗確定抗原的特異性。根據ELISA結果確定其用於免疫組織化學染色的稀釋倍增數為1∶200～500。細胞骨架樣基因編碼蛋白特異性多克隆抗體用於westem blot試驗(1)．用1640培養液(含10％胎牛血清)培養CHL/SMMC7723細胞於60mm培養皿中至100％覆蓋率(通常5～7天)，然後用/不用1～3mM的H2O2/10(-6)M的維甲酸/5～10ng/ml的5-Azacytin/10ng/ml的colchicine處理細胞3～24小時；(2)．用PBS洗細胞3次，吸去PBS，用100ul 2倍的SDS溶解和收集細胞，加入5％的β巰基乙醇，95℃加熱10分鐘，加入溴酚藍後用14.5％的聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白(70V 30min)，然後將蛋白轉移到尼龍膜上。(3)．用含5％脫脂奶粉和1/500正常羊血清的PBST先封閉尼龍膜(置搖床上30min)。然後加入1∶200的一抗(兔抗JWA IgG)，室溫1小時。(4)．用PBST洗滌五次，每次五分鐘。然後加入生物素標記的羊抗兔IgG(1∶1000)，室溫1小時。(5)．用PBST洗滌五次，每次五分鐘。加入ABC試劑，室溫30分鐘。(6)．用PBST洗滌五次，每次五分鐘。用DAB顯色。比較不同組細胞JWA基因編碼蛋白在不同處理條件下的變化。從而分析影響JWA蛋白表達因素。2．細胞骨架樣基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取合成的JWA基因編碼胺基酸C末端15個胺基酸多肽(序列為DALEQQEEGINRLTD，分子量1731)10mg，與載體蛋白KLH(Keyhole LimpetHymocyanin)結合，經透析後再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹部皮下注射)，每月激發注射一次，連續免疫四個月後取血分離血清，取脾臟分離B淋巴細胞，然後與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞。經多次亞克隆和用抗原(合成多肽)及IgG篩選獲得分泌抗JWA合成多肽IgG的雜交瘤細胞株。用ELISA確定抗體的滴度。
細胞骨架樣基因編碼蛋白特異性單克隆抗體用於培養細胞的螢光免疫組織化學染色試驗(1)．用1640培養液(含10％胎牛血清)培養CHL/SMMC7723細胞於35mm培養皿中至100％覆蓋率(通常5～7天)，然後用/不用1～3mm的H2O2/10(-6)M的維甲酸/5～10ng/ml的5-Azacytin/10ng/ml的colchicine處理細胞3～24小時；用甲醇固定細胞10min。(2)用PBS洗滌細胞2～3次，加入1∶500的正常羊血清封閉30min。再用PBS洗滌細胞2～3次後加入1∶1000的鼠抗JWA基因編碼蛋白單克隆抗體，37℃溫育1小時。(3)．用PBS洗滌細胞5次，加入1∶200的螢光素標記的羊抗鼠IgG 37℃溫育1小時。(4)用PBS洗滌細胞5次，製片後用螢光顯微鏡觀察JWA基因蛋白在細胞內的分布特徵。
權利要求
1.一種細胞骨架樣基因(JWA)編碼蛋白特異性抗體，其特徵是指JWA基因全部開放讀框胺基酸系列(共188個胺基酸，見本申請所列)，特別是含有親水胺基酸區的C末端15個胺基酸，N末端30個胺基酸，第80～100個胺基酸和第135～155個胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的胺基酸序列，其特徵是選擇188個胺基酸中部分序列合成多肽，與KLH載體蛋白結合後，用完全和不完全佐劑混合，免疫紐西蘭兔(200ug/兔/次，每周激發注射一次)，製備多克隆抗體(anti-JWA IgG)。
3.根據權利要求1所述的胺基酸序列，其特徵是選擇188個胺基酸中部分序列合成多肽，與KLH載體蛋白結合後，用完全和不完全佐劑混合，免疫Balb C鼠(100ug/鼠/次，每月激發注射一次)，分離脾臟B淋巴細胞並和骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，進一步用亞克隆方法，ELISA法和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，製備單克隆抗體(anti-JWA IgG)。
全文摘要
本發明屬於人類基因組技術領域,所述細胞骨架樣基因(JWA)全長cDNA序列為2107bp,其開放讀框序列為564bp,共編碼188個胺基酸。該基因在基因庫(GenBank)編號為「BankIt200994,Accession Number:AF070523」。本發明利用188個胺基酸中的部分序列合成多肽免疫動物製備多克隆和單克隆抗體。
文檔編號C07K16/18GK1208733SQ9811142
公開日1999年2月24日 申請日期1998年7月22日 優先權日1998年7月22日
發明者周建偉 申請人:南京醫科大學