一種2-甲基-l-色氨酸的酶法轉化製備方法
2023-09-14 01:11:15
一種2-甲基-l-色氨酸的酶法轉化製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，將具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養基中培養發酵，發酵液離心後得到含色氨酸合成酶的溼菌體；將上述溼菌體中加入轉化液，所述轉換液中包括：含L-絲氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一種；在20～50℃，pH5～12條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離得到2-甲基-L-色氨酸。本發明採用含色氨酸合成酶的特定菌株，在優選的培養基中培養可以高效表達色氨酸合成酶，使酶法合成2-甲基-L-色氨酸有較高的催化速率和轉化率，L-絲氨酸摩爾轉化率達到98％以上，酶法合成反應條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，適合工業化生產。
【專利說明】一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種2-甲基-L-色氨酸的轉化方法，尤其涉及的是一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法。
【背景技術】
[0002]2-甲基-L-色氨酸是一種非蛋白質組成的胺基酸，L-2-甲基色氨酸是抗菌素硫鏈絲菌肽合成中重要中間體，中國發明專利:CN101914605，N-芴甲氧羰基-2-甲基色氨酸的合成方法，公開了含有L-2-甲基色氨酸寡肽化合物可以使親軀體細胞(somatotrope)釋放生長素，哺乳動物服用能誘導生長激素釋放的化合物之後，動物體內生長素提高，使動物生長速度加快。2-甲基-L-色氨酸可用於醫藥領域和食品領域等，具有非常廣泛的應用前景。
[0003]中國發明專利:CN101914605，N-芴甲氧羰基_2_甲基色氨酸的合成方法，報導了以2-甲基吲哚與福馬林溶液及二甲胺合成2-甲基蘆竹鹼，再與乙醯氨基丙二酸二乙酯及硫酸二甲酯在強鹼乙醇鈉作用下生成中間體雙酯，雙酯用氫氧化鈉溶液水解並在中性狀態下脫羧得到中間體單酯，單酯通過α-糜蛋白酶水解拆分，獲得D-N-乙醯-2-甲基色氨酸乙酯和L-N-乙醯-2-甲基色氨酸，然後用鹽酸水解分別得到D-2-甲基色氨酸和L-2-甲基色氨酸。《蘇州大學學報(自然科學版)》，2003，1:91-93中公開了以丁烯-2-酮，乙醯氨基丙二酸二乙酯以及苯肼為原料合成了非天然的N-乙醯基-DL-2-甲基-色氨酸的技術。
[0004]目前，我國2-甲基-色氨酸生產主要來源於化學合成法，該方法反應步驟多，操作難度大，生產成本高，不適合大規模工業化生產。而另一方面我國在胺基酸工業生產中，會產生大量不能直接用於食品和醫藥方面的富含L-絲氨酸的毛髮酸水解液，該混合胺基酸料液直接分離製備L-絲氨酸成本高、效率低。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供了一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，提高反應的催化速率和轉化率。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟:
[0007](I)將具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養基中培養發酵，發酵液離心後得到含色氨酸合成酶的溼菌體；
[0008](2)將上述溼菌體中加入轉化液，所述轉換液中包括:含L-絲氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一種；在20~50°C，pH 5~12條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離得到2-甲基-L-色氨酸。
[0009]所述步驟(1)中，具有色氨酸合成酶活性的菌株選自大腸桿菌ATCC15489、銅綠假單胞菌CGMCC NO:1.1129、施氏假單胞菌CGMCC NO: 1.202、枯草芽孢桿菌CGMCC NO: 1.1628中的一種。
[0010]所述步驟(1)中，培養基成分包括10~40g/L碳源物質、5~35g/L氮源物質、2.5g/L 檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/LCoCl2,0.0OOlg/L MnC4H6O4.4H20，碳源物質採用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種，氮源物質採用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白腖、豆餅水解液中的一種或多種。
[0011]所述步驟(2)中，所述含L-絲氨酸的料液中L-絲氨酸的濃度為0.5~40.5g/L。
[0012]所述含L-絲氨酸的料液來源於毛髮酸水解液或純L-絲氨酸液；毛髮酸水解液中總胺基酸的重量百分比為5%~45%，其中L-絲氨酸在總胺基酸中的重量百分比為10%~90%。
[0013]所述步驟(2)中，所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮，其濃度為0.001g/L~4.0g/L。
[0014]所述步驟⑵中，磷酸吡哆醛的濃度為0.2~0.8g/L，2-甲基吲哚的濃度為26.2 ~104.8g/L。
[0015]所述步驟(2)中，等電點結晶法的具體方法如下:
[0016]將酶促反應後的轉化液3000~5000r/min離心10~20min,去除菌體細胞；加熱
轉化液，採用活性碳脫色，抽濾，濾液調至PH 5~6，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得2-甲基-L-色氨酸粗品，米用乙醇洗漆，真空抽濾，烘乾得2-甲基-L-色氨酸精品。
[0017]本發明相比現有技術具有以下優點:本發明採用含色氨酸合成酶的特定菌株，在優選的培養基中培養可以高效表達色氨酸合成酶，使酶法合成2-甲基-L-色氨酸有較高的催化速率和轉化率，其中L-絲氨酸摩爾轉化率達到98%以上； [0018]本發明採用含L-絲氨酸的毛髮酸水解液為反應原料，價格低廉，並充分利用了工業副產物，解決了混合胺基酸料液中L-絲氨酸高效分離的難題，同時也為大規模低成本生產2-甲基-L-色氨酸提供了更為豐富的原料，具有良好的經濟效益和社會效益；
[0019]酶法合成2-甲基-L-色氨酸具有反應條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，成本低，工藝流程簡單等優點，適合工業化生產。
【具體實施方式】
[0020]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
[0021]實施例1
[0022]本實施例包括以下步驟:
[0023](I)將1000mL大腸桿菌ATCC15489在培養基中培養發酵，發酵液離心得到15g溼菌體，加入到500mL轉化液中，轉化液中含21g的L-絲氨酸的毛髮酸水解液、26.2g的2-甲基吲哚、0.2g/L的磷酸吡哆醛和0.005g/L的甲醇，pH8.0，37°C酶促反應12h，反應結束後轉化液中2-甲基-L-色氨酸為42.7g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為98% ；
[0024](2)將轉化液4000r/min離心10min,去除菌體細胞,加熱,活性碳脫色，抽濾，濾液調pH5.5左右，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得39.5g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘乾得35.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.9 %。
[0025]本實施例的培養基成分包括40g/L碳源物質、35g/L氮源物質、2.5g/L檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物質採用葡萄糖和麥芽糖，氮源物質採用牛肉膏和酵母膏。
[0026]實施例2[0027]本實施例包括以下步驟:
[0028](I)將1000mL銅綠假單胞菌CGMCC NO:1.1129在培養基中培養發酵，發酵液離心得到18g溼菌體，加入到500mL轉化液中，轉化液中含Ilg的L-絲氨酸、13.1g 2-甲基吲哚、
0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L乙醚，pH8.0，37°C酶促反應16h，反應結束後轉化液中2-甲基-L-色氨酸為22.4g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為98 % ；
[0029](2)將轉化液3000r/min離心20min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調pH5.5左右，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得20.1g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘乾得18.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.8 %。
[0030]本實施例的培養基成分包括10g/L碳源物質、35g/L氮源物質、2.5g/L檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質採用麥芽糖和果糖,氮源物質採用酵母膏、蛋白腖和豆餅水解液。
[0031]實施例3
[0032]本實施例包括以下步驟:
[0033](I)將1000mL施氏假單胞菌CGMCC NO: 1.202在培養基中培養發酵，發酵液離心得到溼菌體20g，加入到500mL轉化液中，轉化液中含21g的L-絲氨酸的毛髮酸水解液、26.2g2-甲基吲哚、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L丙酮，pH8.0, 37°C酶促反應15h，反應結束後轉化液中2-甲基-L-色氨酸為42.9g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為98.5% ;
[0034](2)將轉化液5000r/min離心10min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調PH5.5左右，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得39.9g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘乾得36.3g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.9 %。
[0035]本實施例的培養基成分包括30g/L碳源物質、20g/L氮源物質、2.5g/L檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質採用鹿糖和果糖,氮源物質採用玉米楽;、蛋白腖和豆餅水解液。
[0036]實施例4
[0037]本實施例包括以下步驟:
[0038](I)將1000mL枯草芽孢桿菌CGMCC NO: 1.1628在培養基中培養發酵，發酵液離心得到20g溼菌體，加入到500mL轉化液中，轉化液中含Ilg的L-絲氨酸、13.1g 2-甲基吲哚、
0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L乙醇，pH8.0，37°C酶促反應20h，反應結束後轉化液中2-甲基-L-色氨酸為22.6g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為99 % ；
[0039](2)將轉化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調pH5.5左右，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得21.1g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘乾得19.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.9 %。
[0040]本實施例的培養基成分包括30g/L碳源物質、5g/L氮源物質、2.5g/L檸檬酸、
3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質採用葡萄糖,氮源物質採用豆餅水解液。
[0041]實施例5
[0042]本實施例包括以下步驟:
[0043](I)將1000mL大腸桿菌ATCC15489在培養基中培養發酵，發酵液離心得到15g溼菌體，加入到500mL轉化液中，轉化液中含42g的L-絲氨酸的毛髮酸水解液、52.4g 2-甲基吲哚、0.4g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L甲醇，pH8.0, 37°C酶促反應16h，反應結束後轉化液中2-甲基-L-色氨酸為85.4g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為98% ；
[0044](2)將轉化液3000r/min離心20min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調pH 5.5左右，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得78.4g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘乾得76.5g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.8 %。
[0045]本實施例的培養基成分包括25g/L碳源物質、15g/L氮源物質、2.5g/L檸檬酸、
3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質採用麥芽糖、鹿糖和果糖,氮源物質採用玉米楽;、蛋白腖和豆餅水解液。
[0046]實施例6
[0047]本實施例包括以下步驟:
[0048](I)將1000mL施氏假單胞菌CGMCC NO: 1.202在培養基中培養發酵，發酵液離心得到溼菌體20g，加入到500mL轉化液中，轉化液中含Ilg的L-絲氨酸的毛髮酸水解液、13.1g
2-甲基吲哚、0.lg/L磷酸吡哆醛和0.05g/L乙醚，pH8.0，37°C酶促反應16h，反應結束後轉化液中2-甲基-L-色氨酸為21.4g，對L-絲氨酸摩爾轉化率為98.5% ;
[0049](2)將轉化液5000r/min離心10min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調PH5.5左右，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得19.9g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘乾得17.7g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.8 %。
[0050]本實施例的培養基成分包括40g/L碳源物質、20g/L氮源物質、2.5g/L檸檬酸、
3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物質採用葡萄糖和果糖，氮源物質採用牛肉膏和豆餅水解液。
【權利要求】
1.一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)將具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養基中培養發酵，發酵液離心後得到含色氨酸合成酶的溼菌體； (2)將上述溼菌體中加入轉化液，所述轉換液中包括:含L-絲氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一種；在20~50°C,pH 5~12條件下進行酶促反應，等電點結晶法分離得到2-甲基-L-色氨酸。
2.根據權利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，具有色氨酸合成酶活性的菌株選自大腸桿菌ATCC15489、銅綠假單胞菌CGMCC NO:1.1129、施氏假單胞菌 CGMCC NO: 1.202、枯草芽孢桿菌 CGMCC NO: 1.1628 中的一種。
3.根據權利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，培養基成分包括10~40g/L碳源物質、5~35g/L氮源物質、2.5g/L朽1檬酸、3.0g/L硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物質採用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種，氮源物質採用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白腖、豆餅水解液中的一種或多種。
4.根據權利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，所述含L-絲氨酸的料液中L-絲氨酸的濃度為0.5~40.5g/L。
5.根據權利要求4所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述含L-絲氨酸的料液 來源於毛髮酸水解液或純L-絲氨酸液；毛髮酸水解液中總胺基酸的重量百分比為5%~45%，其中L-絲氨酸在總胺基酸中的重量百分比為10%~90%。
6.根據權利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮，其濃度為0.00^/1~4.(^/1。
7.根據權利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，磷酸吡哆醛的濃度為0.2~0.8g/L，2-甲基吲哚的濃度為26.2~104.8g/L0
8.根據權利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉化製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，等電點結晶法的具體方法如下: 將酶促反應後的轉化液3000~5000r/min離心10~20min，去除菌體細胞；加熱轉化液，採用活性碳脫色，抽濾，濾液調至pH 5~6，靜置析出沉澱，真空抽濾，烘乾得2-甲基-L-色氨酸粗品，米用乙醇洗漆，真空抽濾，烘乾得2-甲基-L-色氨酸精品。
【文檔編號】C12R1/19GK104017838SQ201410274056
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】徐禮生, 高貴珍, 卓馨, 曹穩根, 趙亮, 袁維風, 吳超 申請人:宿州學院