選擇轉化的細胞的方法
2023-09-14 10:47:35 1
專利名稱：選擇轉化的細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種選擇用所需基因轉化後的細胞的方法。更具體地，其涉及一種通過將來自水稻組織的細胞在含巴龍黴素的選擇性培養基上培養來選擇轉化的細胞的方法。
現在技術在常規方法中，為了得到在其中轉入有特定基因的轉化植物，還把一個選擇性標記基因與目的基因一起轉入以確定所需基因是否被轉入到了細胞中。檢測選擇性標記基因的表達以對其中轉入了上述基因的轉化細胞進行選擇。轉化植物可由如此選擇的細胞再生而來。關於這類標記基因，可以使用對選擇性藥物具有抗性的那些，即藥物抗性基因。換句話說，在廣泛使用的選擇方法中，將抗藥性基因和目的基因同時轉入細胞中，並選擇抗藥性細胞作為轉化細胞。這種抗藥性基因的一個典型例子是新黴素磷酸轉移酶(npt II)基因，其與相應的選擇性藥物卡那黴素一起使用。
在水稻轉基因的早期研究中，就利用了上述的npt II基因和卡那黴素結合的方法(Uchimiya等，1986，Yang等，1988)。然而，在這些報導中，還沒有得到再生的轉化植物。Toriyama等(1988)報導還未得到通過卡那黴素的篩選的任何完整的綠色植物。而且，Dekeyser等(1989)指出水稻愈傷組織對卡那黴素有固有的抗性。因此，關於用npt II基因結合卡那黴素來選擇轉化的水稻細胞的方法中存在著各種問題。
另一方面，已嘗試用G418作為一種選擇性藥物，其通過npt II表達來進行中和，與用卡那黴素相似。因此，有一些報導說已通過利用G418得到了水稻轉化體(Toriyama等，1988，Peng等1992，Chan等1993)。Toriyama等(1988)報導說G418在轉化效率方面比卡那黴素要佔優。
目前，潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因是在水稻轉化中應用最為廣泛的選擇性標記基因。該基因與作為相應的選擇性藥物潮黴素一起使用(Vasil1994)。還有報導說bar基因(選擇性藥物PPT及其衍生物)作為水稻的選擇性標記基因是高度有效的(Ayres和Park1994)。
雖然在水稻轉化中可用的選擇性標記基因方面的比較很少有報導，但有人指出npt II標記的效率不如hpt標記(shimamoto等，1989，Aldemita和Hodges 1996)。事實上，如上所述，目前已不大使用npt II標記了。
因此，在水稻轉化中一般是使用htp基因和bar基因來作為水稻轉化中的選擇性標記基因(抗藥物基因)。與此相反，在水稻的轉化中並不常用npt II基因，因為其轉化效率低。
雖然可以用hpt或bar基因來轉化水稻，但如果需要將一個或多個額外的基因轉到轉化體中去時就需要一個或更多個不同的選擇性標記。也就是說，如果要把一個額外的基因轉入到已通過hpt或bar基因共轉化所得的轉化體中，有必要使用另一個選擇性標記(藥物抗性)基因。
雖然，可以將npt II和G418結合使用來進行選擇，但將導致轉化效率低下。因此，非常需要具有改善的轉化效率的新的選擇性標記基因(藥物抗性基因)與選擇性藥物的組合。
發明簡述為了滿足上述要求，本發明人已進行了大量的研究以建立一個利用藥物抗性基因和選擇性藥物的新組合的高效水稻轉化系統。結果，他們發現用巴龍黴素作選擇性藥物可以解決問題，因而完成了本發明。
因此，本發明人通過提供一種選擇轉化細胞的方法和通過此方法選擇的轉化細胞解決了上述問題，該方法包括將至少一個所需的結構基因和巴龍黴素抗性基因轉到水稻組織中，在含巴龍黴素的選擇性培養基中培養細胞，並選擇轉化的細胞。
在本發明的一個實施方案中提供了一種選擇轉化細胞的方法，包括的步驟為a)提供一株攜帶含有T-DNA區的質粒的土壤桿菌，該T-DNA區以能夠使所說基因進行表達的方式依次含有巴龍黴素抗性基因和目的基因；b)提供水稻組織的細胞；c)將水稻細胞以上述的土壤桿菌株進行接種；d)在含巴龍黴素的植物細胞培養基中培養接種過的細胞，而巴龍黴素的濃度使得只有那些以巴龍黴素抗性基因轉化過的細胞能存活(此後被稱為選擇性培養基)，以及如此選擇巴龍黴素抗性愈傷組織；以及e)如果必要，利用選自愈傷組織的細胞重複選擇步驟d)一到多次。如此所選擇的細胞可在適於植物再生的培養基上培養因此將會再生成完全植株。
附圖簡述
圖1表明了實施例2中所用的載體pSB133的限制性圖譜。
圖2顯示的是電泳照片，該照片表明了利用LBA4404(pSB133)所得的轉化體的Southern分析結果。從每個轉化體提取的DNA用Hind III處理，並以npt II基因為探針進行Southern雜交。C非轉化體(Asanohikari)。1-13轉化體圖3顯示了一張電泳圖，該圖表明了利用LBA4404(pSB133)所得的轉化體的Southern分析。從每個轉化體所提取的DNA用Hind III處理，並用GUS基因為探針進行Southern雜交。C非轉化體(Asanohikari)。1-13轉化體。
發明詳述現在將對本發明進行更詳細的描述。
如上所述，本發明的主要特徵在於選擇轉化細胞的方法和由此方法選擇的轉化細胞，而此方法包括將至少一個目的結構基因和巴龍黴素抗性基因轉到水稻組織細胞中，並在含巴龍黴素的選擇性培養基中培養細胞，以及選擇轉化細胞。
本發明中所使用的巴龍黴素是一種氨基糖苷類抗生素，其代表性分子式是C23H45N5O14(分子量615.5)，其由放線菌產生，典型的是龜裂鏈黴菌巴龍黴素原種(Sterptomyces rimosus forma paromomycinus)，其能夠抑制格蘭氏陽性和格蘭氏陰性細菌。其結構中，新黴素的6′位氨基已被羥基取代。據報導巴龍黴素的功能和抑制機制類似於那些含2-脫氧鏈黴胺的抗生素例如卡那黴素。含有作為主要成分的巴龍黴素I和作為雜質的巴龍黴素II的製劑在市場上可以買到，即硫酸巴龍黴素。這類產品可以購自Sigma(St.Louis，USA)等。
根據本發明，應用的是含巴龍黴素的選擇性培養基。優選選擇性培養基中的巴龍黴素濃度範圍在5毫克/升到400毫克/升之間，更優選20毫克/升到200毫克/升，再更優選從40毫克到100毫克/升。當培養基中巴龍黴素的濃度高於所確定的上限時，轉化細胞的生長將會受到強烈抑制。當其濃度低於所確定的下限時，未轉化細胞的生長將不會受到抑制。因此在兩種情況下都不能夠選擇轉化的細胞。
對本發明中所用的選擇性培養基並無特定的限制，只要它是從常規使用的水稻細胞的選擇性培養基中選出就可以了。優選的實施例包括改良的CC培養基和改良的MS培養基(Christou等，1991)。更優選的是2N6培養基和N6-7培養基，其成份將在下面給出的實施例中進行描述。
在這些培養基中的培養可在常規條件下進行。
用本發明的方法所選擇的轉化細胞可以是任何細胞，只要它們來源於水稻組織即可，雖然來源於水稻胚的細胞是優選的。
如此所選擇的轉化細胞可以攜帶至少一個目的基因，其特徵為除了已被轉入其中的巴龍黴素抗性基因之外的編碼有益蛋白的結構基因或可賦予水稻優良特性的基因。
如上所述，對目的基因並無任何具體的限制，只要它可以賦予水稻優良特性即可。同樣，該基因並不限於是天然的。也就是說，可以使用通過遺傳工程改良的基因或編碼由相互聯繫在一起的多個蛋白組成的嵌合蛋白的基因，等等。而且目的基因可以以有義方向轉化也可以以反義方向轉化。
對巴龍黴素抗性基因並無具體限制，只要它可以抵消巴龍黴素的效應即可。此處將一個編碼新黴素磷酸轉移酶(npt II)的基因用作是巴龍黴素抗性基因的適當實例。
應當對上述的兩個基因進行轉移，從而讓其得到表達。因此，常常將這些基因與表達必需的啟動子和終止子等一起使用。而且還可以將兩個或更多個目的基因與額外的藥物抗性基因等進行轉移。
本發明中，通過常規使用的將基因轉移到水稻組織細胞中的方法將這些基因轉移到水稻中。例如可以使用電穿孔法、聚乙二醇法、粒子槍法或土壤桿菌介導法。其中，就轉化效率而言優選土壤桿菌介導法。以土壤桿菌介導法向來自於水稻組織的細胞轉入基因的方法的描述見於例如WO95/06722。
本發明中，對轉化細胞的選擇可只進行一次。然而，為了提高得到轉化體的可能性，優選重複篩選幾數。在下文給出的實施例中，將篩選重複了3次。實施例1(1)土壤桿菌株與質粒使用LBA4404(pTOK 233)(Hiei等，1994)來製備其中帶有載體的土壤桿菌。載體的T-DNA區含有由一個CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子驅動的hpt基因，一個由NOS(胭脂氨酸合酶)啟動子驅動的npt II基因，以及由來自蓖麻豆的過氧化氫酶基因的內含子所間斷的GUS基因。(2)待試品種和組織使用日本水稻品種Asanohikari作為待試品種。待試組織是來自該品種的未成熟胚的愈傷組織。根據Hiei等，(1994)的方法製備未成熟胚，並於2N6培養基(Hiei等，1994)上培養2周。在相同的培養基上對來自於盾片的愈傷組織再額外培養4到5天，並以其作為待試組織。(3)接種和協同培養如Hiei等的報導(1994)進行接種和協同培養。接種物密度為1×109/毫升。(4)轉化細胞的選擇在協同培養後3天，將愈傷組織移植到含有50毫克/升潮黴素、400毫克/升卡那黴素、50毫克/升G418或含有50毫克/升巴龍黴素的2N6培養基(Hiei等，1994)上，並在光照條件下於30℃培養約3周。將如此所得的抗藥性愈傷組織轉移到分別含50毫克/升各種藥的N6-7培養基(Hiei等，1994)上，並進行十天的第二輪選擇。每種選擇培養基進一步含有250毫克/升的頭孢噻肟(cefotaxime)。含有巴龍黴素和G418的選擇培養基含有8克/升的瓊脂糖作為膠凝劑。
上述2N-6培養基和N6-7培養基的配方如下。
2N6培養基N6無機鹽、N6維生素、1克/升的酪蛋白水解物、30克/升的蔗糖、2毫克/升2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)、2克/升的Gelrite，pH5.8。
N6-7培養基N6無機鹽、N6維生素、2克/升的酪蛋白水解物、30克/升的蔗糖、30克/升的山梨醇、1毫克/升的2，4-D、0.5毫克/升的6-苄基腺嘌呤、2克/升的Gelrite，pH5.8。(5)轉化體的再生和GUS表達的檢測將第二輪選擇所得的抗藥性的胚發生愈傷組織置於Abe和Futsuhara(1986)所描述的再生培養基上，前提是主要的無機鹽濃度都減半。將Gelrite(4克/升)或瓊脂糖(8克/升)加到培養基中作為膠凝劑。再生培養基也各含有一種選擇性藥物，其濃度為如上所述。在光照條件下於25℃培養4到5周，將如此所得的抗藥性再生植株的葉片用X-Gluc處理以檢測GUS的表達(Hiei等，1994)。再生的個體被移植到Hyponex的500倍稀釋水溶液中，並在那裡在光條件下於25℃培養10天，然後再移植到溫室的盆中。(6)結果和討論在卡那黴素測試組中，雖然有高的藥物濃度(400毫克/升)，但未轉化的愈傷組織的生長並未受到抑制。因此，未能選擇到轉化的愈傷組織(表1)。在G418組中，沒發生再生，雖然也以低的頻率觀察到非胚發生藥物抗性愈傷組織(表1)。
用巴龍黴素選擇和經歷再生的許多個體在葉中都觀察到相當一致的表達，與用潮黴素進行選擇時的現象是一樣的。因此，證實這些個體就是轉化體(表1)。在任何一個測試組中都未觀察到白化個體。用巴龍黴素所得的轉化效率明顯高於用潮黴素進行選擇的組，而潮黴素是水稻轉化中所常規使用的(表1)。
這些事實表明巴龍黴素在水稻轉化中是一種新的高度有用的選擇性藥物。換句話說，發現npt II基因雖然由於其效率低而不再使用，但如果在水稻轉化中它與巴龍黴素一起使用就是一種極其有用的標記基因。
用巴龍黴素進行的轉化體的選擇在其它水稻品種即Tsukinohikari和Koshihikari中也有高的轉化效率。
表1用潮黴素和巴龍黴素進行選擇轉化的結果
實施例2(1)載體將LBA4404(pSB 133)(圖1)作為含質粒載體的土壤桿菌菌株來轉化日本粳稻品種Asanohikari和Tsukinohikari。在T-DNA區，該載體具有一個在NOS啟動子控制下的npt基因，以及一個由來自蓖麻豆的過氧化氫酶基因的內含子間斷的GUS基因。用上述方法進行轉化。再生培養基含有4克/升的Gelrite作為膠凝劑。
pSB 133以下列方式進行構建。將以SaII消化pGA482(An等，1985)所得的DNA片段(6.2kb)連接到以SalI消化pSB 11(Komari等，1996)所得的另一DNA片段(5.1kb)上得到一個質粒。接著，用EcoRI和BglII對質粒進行消化得到一DNA片段(8.6kb)。將該DNA片段平端化並在其中插入一個BglII接頭(Takara生產)得到質粒pSB27。該質粒再用Hind III消化然後連到一個含35S啟動子和一個內含子間斷的GUS基因的片段(3.1kb)上，其是用Hind III消化pIG 221(Ohta等，1990)得到的。因此就得到了pSB33。再將pSB33導入大腸桿菌株LE392中，然後再通過三親本雜交法(Ditta等，1980)轉到含pSB1(Komari等，1996)的土壤桿菌菌株LBA中。通過在土壤桿菌中pSB1和pSB33之間的同源重組形成質粒pSB133。(2)轉化在含巴龍黴素培養基上以LBA4404(pSB 133)轉化產生高頻率的藥物抗性愈傷組織，類似於用LBAA4404(pTOK 233)的情況。該愈傷組織可在含巴龍黴素的培養基上毫無困難地再生。如此所得的許多再生個體在葉中都表現出了一致的GUS表達，這說明其為轉化體(表2)。
表2以巴龍黴素選擇用LBA4404(pSB 133)轉化的結果
(3)基因轉移的確證從13株用LBA4404(pSB 133)接種Asanohikari所衍生的巴龍黴素抗性和GUS陽性個體的葉中提取DNA。將所提取的DNA用Hind III處理，並用npt II基因或GUS基因為探針進行Southern雜交。作為對照，使用的是來自於未轉化的Asanohikari的DNA。Southern雜交依據分子克隆(Sambrook等，1989)所述進行。
用npt II基因作探針對Hind III消化DNA的Southern分析表明在所有測試的13株個體中轉入了一到多個拷貝的轉移的基因(圖2)。在質粒pSB133中，含npt II基因的Hind III片斷恆定地表現出大小為5.9kb(圖1)。因此，如果有土壤桿菌留在水稻植株中，那麼就應該只檢測到這樣大小的帶。事實上，從測試轉化體中檢測到了各種不同大小的帶(圖2)。而且，其中的大部分帶(圖2)都比從Hind III位點起延伸、通過npt II併到達左邊界(約2.5kb，圖1)的區段要長。這些結果表明，在所測試的個體中，T-DNA整合入不同的染色體區域，暗示這些個體是獨立的轉化體。
以GUS基因為探針對Hind III消化的DNA的Southern分析顯示在13株轉化體中有11株中出現了一條3.1kb的帶(圖3)。在質粒pSB133中，含GUS基因的Hind III片段表現出恆常大小為3.1kb(圖1)。因此，Southern分析的結果與預期的帶長是一致的。從一些個體中得到了各種不同長度的帶，這看起來是由於轉移的基因的重排引起的。這種現象在用土壤桿菌介導法所得的雙子葉植物轉化體中也常觀察到(Peroles和Gardner，1988，Komari，1989；Komari，l990)。
當對這些轉化體下一代的自體授粉的個體中檢測了巴龍黴素抗性和GUS基因的表達時，確證了基於孟德爾法則的遺傳分離。
以前，在用npt II作為選擇性標記基因轉化水稻時，所用的選擇性藥物是卡那黴素和G418。然而，以這些藥物僅得到低轉化效率。根據本發明，利用巴龍黴素作為新的選擇性藥物可能以顯著高的效率對水稻組織的細胞進行轉化。
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權利要求
1. 選擇轉化細胞的方法，其包括在將至少一個目的結構基因和巴龍黴素抗性基因轉到來自於水稻組織的細胞中後將該細胞在含巴龍黴素的選擇性培養基上進行培養，以及選擇轉化細胞。
2. 權利要求1所要求的選擇轉化細胞的方法，其中所說的巴龍黴素抗性基因是編碼新黴素磷酸轉移酶(nptII)的基因。
3. 權利要求1或2所要求的選擇轉化細胞的方法，其中所說的轉化通過土壤桿菌介導法來進行。
4. 權利要求1到3中任一項所要求的選擇轉化細胞的方法，其中所說的轉化細胞源自水稻胚。
5. 權利要求1到4中任一項所要求的選擇轉化細胞的方法，其中在所說選擇性培養基中巴龍黴素的濃度從5毫克/升到400毫克/升。
6. 權利要求1到5中任一項所要求的選擇轉化細胞的方法，其中所說的選擇性培養基是2N6培養基或N6-7培養基。
7. 從源自水稻組織的細胞中選出的轉化細胞，其選擇方法是將細胞在其中至少轉入一個所需的結構基因和一個巴龍黴素抗性基因後將該細胞在含巴龍黴素的選擇性培養基上進行培養。
8. 產生由所需基因轉化的水稻轉化體的方法，包括a)提供一株屬於土壤桿菌屬的菌株，其含有一個在其T-DNA區以能使得各個所說基因得以表達的方式含一個巴龍黴素抗性基因和一個所需基因的質粒；b)提供來自於水稻組織的細胞；c)用上述屬於土壤桿菌屬的菌株對源自水稻的上述細胞進行接種；d)將接種過的細胞在含巴龍黴素的植物培養基上進行培養，而該巴龍黴素的濃度使得除去那些由巴龍黴素抗性基因轉化的之外的細胞不能在所說培養基(此後稱之選擇性培養基)中存活，以及選擇巴龍黴素抗性愈傷組織；e)如果必要，用從選出的愈傷組織得到的組織細胞重複一次或多次選擇步驟d)。f)將選出的愈傷組織在適於植物再生的培養基上培養以得到完全再生的植株。
9. 權利要求8所要求的方法，其中所說的步驟b)的細胞來源於水稻胚。
10. 權利要求8或9所要求的方法，其中所說的巴龍黴素抗性基因是編碼新黴素磷酸轉移酶(npt II)的基因。
11. 權利要求10所要求的方法，其中所說選擇性培養基中巴龍黴素濃度在5毫克/升到400毫克/升之間。
12. 權利要求11所要求的方法，其中所說的選擇性培養基是2N6培養基或N6-7培養基。
13. 權利要求8所要求的方法，其中所說的步驟c)中接種是將來自於水稻的所述細胞在有所說屬於土壤桿菌屬的菌株存在的條件下培養幾分鐘到幾天而進行的。
14. 權利要求8所要求的方法，其中一個或多個拷貝的所說的所需基因被整合到如此再生的植物的基因組中。
全文摘要
用nptⅡ作為選擇性標記基因(藥物抗性基因)，以及用卡那黴素、G418等作為選擇性藥物已是選擇水稻轉化體的慣常方法。然而，通過該方法所得的選擇效率很低，因此需要開發一種利用新組合的高效的水稻轉化系統。通過使用巴龍黴素作為新的選擇性藥物，可以極其高效地轉化水稻。
文檔編號C12N15/82GK1239513SQ9880137
公開日1999年12月22日 申請日期1998年7月23日 優先權日1997年7月23日
發明者小鞠敏彥, 樋江井佑弘, 笠岡啟介 申請人:日本菸草產業株式會社