用於活化幹細胞的藥劑的製作方法

2023-09-14 12:15:55 2

專利名稱：用於活化幹細胞的藥劑的製作方法
用於活化幹細胞的藥劑本發明涉及醫藥，特別涉及設計用於活化它們自身的幹細胞的藥物。人類幹細胞被用於現代醫藥，以治療許多疾病，包括癌症、心臟疾病和其他疾病。 幹細胞可來源於骨髓和胚胎組織的臍帶血以及外周血。幹細胞分裂為間充質細胞(它們能夠分化為中胚層源的組織細胞)、造血細胞(血 細胞的前體)、神經元細胞(神經系統的祖細胞)和其他細胞。間充質幹細胞(MSC)經常被 用作移植物，因為它們將增強它們自身的身體儲備，促進細胞因子和生長因子的形成，MSC 是成骨細胞的前體，並促進重建單元的形成。在細胞治療的實踐中，基於引入新幹細胞生物體而非其自身的活化的活化幹細胞 的工具被廣泛銷售和使用。特別是，一種工具是通過糖蛋白活化幹細胞(Rd. IASC S07K16/28上RF專利號 2，272，810，公開於2006年3月27日)，其包括作為糖蛋白的IgG類的多克隆免疫球蛋白， 平均分子量為150kDa，獲自對複合抗原CD34+幹細胞的體液免疫應答。這一工具在幹細胞 表面和內部的抗原決定簇的最大範圍內操作，這引起它們的活化。然而，該工具用它們自身的幹細胞活化。獲得藥物的過程是持久的，需要很大的努 力。已知活化幹細胞的一種工具(藥物非格司亭(Neupogen)F. Hoffman-IaRoshe公 司)是由175個胺基酸組成並具有187-189千道爾頓(kDa)分子量的，由人類基因5gdl_g31 在大腸桿菌(E.coli)的基因組中表達獲得的糖蛋白。該產品含有額外的胺基酸-甲硫氨 酸。非格司亭將祖細胞成熟為嗜中性粒細胞縮短了 5至1天，加速了成熟嗜中性粒細胞從骨 髓輸出到血液(B. Lord 等人 Proc. Of the National Academy of Sci. Of USA，1992，1986， 第9499-9503頁)，增強了嗜中性粒細胞的趨化性(SPColgan等人，Experim. Hematology, 1992，1920，第12四-1234頁)。其用於標準細胞毒性化學治療、骨髓移植、動員慢性嗜中性 粒細胞減少症中的天然集落刺激因子、促進傷口癒合等等。然而，非格司亭的應用引起併發症骨痛、脾腫大、皮膚反應等等。此外，非格司亭 的治療成本非常高，為U. S. $1500-3000。最接近要求保護的藥物《硼替佐米》(參見www. rlsnet. ru/mnn_bortezomib. html)存在於所有真核細胞的細胞核和胞質溶膠中，並催化細胞生命周期涉及的主要蛋白 的分裂，硼替佐米是修飾中心的硼酸，是一種26S蛋白酶體活性的高度選擇性可逆抑制劑。 化學名-[(IR) -3-甲基-1 [ [ (2S)-1-氧代-3-苯基-2-[(吡嗪羧基(pirasinilcarbonil)) 氨基]丙基]氨基]丁基]，Brutto 式=C19H25BN4O40《硼替佐米》在體內引起人類腫瘤，包括多發性骨髓瘤的許多實驗模型的延緩。該 藥物用0. 9% NaCl稀釋至lmg/ml的濃度，靜脈內施用。該藥物的主要目標是多發性骨髓瘤。還確定(sm. www. sciencedaily. com/releases/2008/01/080124 173，809. Htm)， 《硼替佐米》減少骨組織的破壞，增加成骨細胞和骨形成的活性，具有對間充質幹細胞的直 接藥理學效應。因此，相對於基於引入幹細胞的新生物體的細胞治療的實踐中普遍和廣泛使用的，該藥物在體內活化幹細胞，增強其修復能力。這一藥物的主要缺點是其高毒性，和許多的副作用對血液部分(血小板減少，貧 血)、對消化系統(噁心、嘔吐、腸梗阻、急性胰腺炎、肝炎)、對神經系統(頭疼、意識喪失、 自主神經系統功能障礙、驚厥)、對Parties、對心血管系統(血壓下降、充血性心力衰竭)等等。本發明的目的是解決產生活化身體自身幹細胞而無毒且不具有副作用的工具的 任務。為解決這一問題，根據本發明的活化幹細胞的工具含有化學來源的活性成分和注 射用氯化鈉，其含有以下比例wt. %的活性甲醛甲酸....................................................0. 00003-0. 004注射用氯化鈉0.85-0. 95%濃度...........................餘量專利和科技信息來源的已知作者沒有描述用於未基於將幹細胞輸入體內而活化 幹細胞的無毒且不具有副作用的工具，和對身體自身細胞，即對脾細胞和紅骨髓的影響。已知免疫調節劑含有甲醛和氯化鈉(參見對於細胞的俄羅斯專利號2077882， A61K31/115IPC，公開於 1997 年 4 月 27 日)，甲醛的濃度是 0. 07-0. 24wt. % 然而，這一藥物沒有活化幹細胞，而僅具有免疫調節效應。作者首先確認了藥物濃度數據(0. 00003-0. 004wt. % )的作用。增加有氧氧化，這 轉而限制其對正常細胞的效應並引起癌細胞死亡。這使得我們推斷出要求保護的發明存在「創造性步驟」。具有特殊刺激性氣味的透明無色液體甲醛水溶液以所有比例與水和醇混合。甲醛是醛類的代表HC0H。是具有刺激性氣味的無色氣體，它們具有30. 03的質量， 其在201的密度是0.815，熔點921，沸點19.21。其可溶於水、醇。其易於聚合，在水介 質中形成聚合-低聚甲醛，在乾燥環境(丁烷、己烷)中形成聚合-POM。等滲注射用氯化鈉溶液-一種成味無色透明液體。溶液是無菌、無熱原的。氯化鈉-立方晶體或白色結晶粉末，成味，無氣味。可溶於水(1 3)。要求保護的藥劑是澄清無色無氣味液體，略帶鹹味。該工具如下製備。取LIMITED Medicine 37-40%甲醛溶液，將其加入無菌的0. 9-0. 95%注射用氯化 鈉溶液，直至0. 00003-0. 003%的甲醛溶液。儲備液在15-35°C的溫度下保存在暗處。實施例1取0.01ml健康級37%甲醛水溶液，將其加入到99. 99ml 0.9% (或0.95%濃度) 無菌等滲氯化鈉水溶液。將混合物溶液充分混合。甲醛在獲得的儲備液中的最終濃度將是 0. 0037wt. %。實施例2取0.0001ml健康級37%甲醛水溶液，將其加入到99. 9999ml 0.9% (或0.95%濃 度)無菌等滲氯化鈉水溶液。將混合物溶液充分混合。甲醛在獲得的儲備液中的最終濃度 將等於 0. 000037wt. %。實施例3取0. Olml醫用40%甲醛水溶液。根據以上實施例2製備工具。甲醛的最終濃度將等於 0. 004wt. %。實施例4取0.0001ml健康級40%甲醛水溶液；將其加入到99. 9999ml 0.95%無菌等 滲氯化鈉水溶液。將混合物溶液充分混合。甲醛在獲得的儲備液中的最終濃度將等於 0. 00003wt. %。為了證明幹細胞的活化，進行了藥物對增殖的作用和在脾細胞和骨髓中的毒性的 研究。實驗使用3個月鼠齡的C57B1/6系小鼠(雄性)。小鼠在無菌條件下通過斷頭術 殺死，提取脾和紅骨髓。脾碎片在199培養液中在玻璃勻漿器中充分均化，通過滅菌紗布過 濾，並以1500rpm在199培養液中洗滌3次，持續5分鐘。在環境199下用注射器提取股骨的骨髓細胞。然後，小心地吸取它們，並用以上方 法洗滌。此後，將脾細胞和骨髓骨髓細胞(cariotsites)轉移至完全培養基(培養基 RPMJ-1640+10% FCS (胎牛血清)+2mM L-穀氨醯胺+25mM Hepes緩衝液+2+巰基乙醇4g/ ml慶大黴素)，並調節至每Imll X IO6有核細胞濃度。以上提及的程序之後，活細胞的數量 是 93-98%。在具有5% C02的潮溼氣氛中，在無菌條件下進行細胞培養。在將吖啶橙(0.25mg/ ml)和菲啶溴紅(0.25mg/ml)的溶液加入細胞懸浮液混合物之後，使用螢光顯微鏡評價活 細胞和死細胞的數量。將ImkKYu 3H-胸苷(比活性)在4:00(孵育之後)加入細胞之後， 評價細胞的增殖活性。用胸苷孵育之後，將相同的細胞轉移至玻璃纖維濾器中，用過量的水洗滌，經受 96°乙醇，然後在空氣中乾燥。之後，將濾器浸在基於標準甲苯閃爍劑的POP和POPOP (每種 藥物稀釋液3份樣品)。使用β -計數器計算樣品的放射活性(1分鐘內3Η-胸苷的β -衰 變的數量)。在細胞培養物中，以不同濃度加入藥物，並考慮孵育M小時之後死亡細胞的百分 比。確定不同濃度的藥物毒性的結果在表1中提供。根據表1，當加入到脾細胞和骨髓細胞(cariotsytes)時，與對照相比，不同濃度 的藥物(0. 0035-0. 0000273)增加死亡細胞的數量1. 4-2. 5倍。研究脾細胞和骨髓細胞(cariotsytes)的增殖能力的結果在表2中提供。表2顯示與對照相比，脾細胞增殖增加了 1. 5-4. 2倍，骨髓細胞(kariotsitov)增 加了 2. 1至12. 7倍。我們在孵育M小時和44小時之後，在可比方面研究脾細胞的增殖活性。在這種 情況下，通過注射到細胞培養物4小時的3H-胸苷的每分鐘脈衝數，評價增殖活性。結果在 表3中列出。表3顯示，與對照相比，所有濃度的藥物在孵育期增加細胞增殖1. 5-14倍。這些結果表明在體外藥物增加了脾細胞和骨髓的增殖。在這種情況下，部分細胞 死亡在再生過程中不是決定性的，且不影響剩餘正常細胞增殖的加強。該藥物在使用濃度下在有限數量的患者中交替試用未癒合營養不良性潰瘍、術後瘻。該藥物每周肌內注射1次，持續1-2個月。實施例1患者N，35歲，患有術後瘻治療療程持續2個月後，傷口完全癒合，而沒有再次手術介入。實施例2患者S，1972-難治性營養不良性潰瘍1個月療程後，出現潰瘍淨化並完全癒合。實施例3患者K，45歲-踝關節骨折1. 5個月治療後，骨組織康復，且沒有任何併發症。放射學證實加速了康復過程。因此，體外的且應用於有限數量的患者的要求保護的工具證實其用於增加患者自 身幹細胞的可能性。用不同濃度的藥物孵育M小時後，3個月鼠齡小鼠S57VL/6的死亡細胞(脾細胞 和骨髓細胞)的百分比
權利要求
1.活化幹細胞的工具，包括化學來源的活性成分和注射用氯化鈉，其特徵在於其含有 以下比例wt. %的作為活性成分的甲醛甲醛.................................................0. 00003-0. 004 ；注射用氯化鈉0.85-0. 95%濃度...............餘量。
全文摘要
本發明涉及醫藥，特別涉及旨在活化它們自身的幹細胞的醫藥製品。本發明的目的是開發不產生副作用並用於活化生物體的幹細胞的無毒藥劑。用於生產該藥劑的方法包括取37-40％的藥用甲醛溶液，並將其加入到用於注射的0.9-0.95％無菌氯化鈉溶液中，使得獲得0.00003-0.003％的甲醛溶液。該藥劑應該在15-35℃的溫度下儲存在暗處。
文檔編號A61P43/00GK102099023SQ200980127657
公開日2011年6月15日 申請日期2009年3月30日 優先權日2008年7月17日
發明者尼古拉耶維奇·拉斯卡維 弗拉季斯拉夫, 弗拉基米羅維奇·郭留諾夫 德米特裡, 伊凡諾維奇·伊萬年科 瑟吉 申請人:尼古拉耶維奇·拉斯卡維 弗拉季斯拉夫, 弗拉基米羅維奇·郭留諾夫 德米特裡, 伊凡諾維奇·伊萬年科 瑟吉