可調控的腫瘤活疫苗及其製備方法
2023-09-19 09:57:45
專利名稱：可調控的腫瘤活疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種腫瘤活疫苗，具體涉及一種其安全性和免疫效應可調控的腫瘤活疫苗及其製備方法。
腫瘤疫苗(Cancer Vaccine)的提出已有100餘年的歷史。通過體外製備各種形式的腫瘤疫苗注射到腫瘤患者體內，能使機體T淋巴細胞致敏、活化，生成腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，專一性地結合併殺傷腫瘤細胞。腫瘤疫苗種類眾多，大致可分為基因修飾的疫苗；抗獨特型抗體疫苗；DNA疫苗和樹突狀細胞疫苗等。目前，對於樹突狀細胞疫苗的研究成果最為引人注目。
樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是機體免疫系統中功能最強的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，高表達MHCI、MHCII類分子、共刺激分子和粘附分子，能有效攝取、加工和提呈腫瘤抗原，激發T細胞增殖，誘導CTL對腫瘤的殺傷作用。因而DC在以細胞免疫為主的抗腫瘤反應中有著舉足輕重的地位。迄今為止，DC疫苗已在惡性淋巴瘤、惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌等的實驗研究和臨床I、II期試驗中取得了結果。DC疫苗包括(1)、腫瘤抗原肽修飾或抗原基因轉染的DC；(2)、腫瘤細胞提取物致敏DC；(3)、腫瘤細胞總RNA衝擊DC；(4)、凋亡腫瘤細胞刺激DC；(5)、腫瘤細胞與DC的融合細胞疫苗等。其中融合疫苗可表達來源於DC和腫瘤細胞表面的全部標誌物，能顯著增強疫苗的免疫原性，誘導宿主產生強烈的抗腫瘤免疫應答，為當今腫瘤免疫基因治療的一大熱點。
目前絕大多數腫瘤的特異性腫瘤抗原仍不明確，且針對單一抗原的治療往往效果不佳，因而將DC與腫瘤細胞融合作為疫苗，產生針對全部抗原的免疫反應，為腫瘤的治療提供了一條捷徑。Gong等的研究表明，人卵巢癌與人DC融合細胞能表達CA-125抗原和源於DC的MHC-II分子、共刺激分子，有效地刺激T細胞增殖，引起並CTL腫瘤殺傷反應，導致腫瘤消退。
自殺基因是來自某些病毒或細菌的基因，可編碼特定的酶，正常哺乳動物細胞缺乏這種基因。如果將自殺基因導入靶細胞中，可使無毒性的前體藥物轉化為細胞毒性代謝產物從而導致靶細胞死亡。常用的自殺基因系統有HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD雙自殺基因等。
各種腫瘤疫苗的實驗和臨床研究表明，腫瘤疫苗在抗腫瘤方面有廣闊而良好的應用前景。但攜帶腫瘤抗原的腫瘤疫苗回輸體內後存在潛在的致瘤性問題，也是始終是人們所關注的疫苗安全性問題。既往的研究通常將疫苗在體外經60Co照射或是絲裂黴素滅活處理，即以死疫苗回輸體內，目的在於降低由疫苗引起腫瘤生長的可能。這樣同時也降低了疫苗的抗原性，刺激機體產生的免疫效應較活瘤苗所形成的弱而短暫。腫瘤活疫苗能夠持久有效地刺激機體產生強烈的抗腫瘤免疫效應，這與安全性之間地矛盾就亟待解決。
本發明將自殺基因系統引入到腫瘤活疫苗，籍此來調控腫瘤活疫苗的安全性和免疫效應。本發明以細胞因子誘導大鼠骨髓前體細胞獲得樹突狀細胞，並加以純化和擴增；再與已轉導有自殺基因的腫瘤細胞融合製成活疫苗。所述疫苗在進入體內時為活疫苗，在完成活疫苗的作用後可接受自殺基因的控制而死亡，既可杜絕活疫苗在體內持續生長所導致的不良影響，又可象一般疫苗一樣細胞解體，從而徹底釋放免疫物質。
所述的自殺基因系統是HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD雙自殺基因。
所述的腫瘤活疫苗包括樹突狀細胞疫苗，基因修飾的疫苗，DNA疫苗和抗獨特型抗體疫苗，優選是婦科腫瘤活疫苗，最優選是卵巢癌腫瘤活疫苗。
本發明通過下述技術方案和步驟進行
(1)、樹突狀細胞分離、培養和生物免疫特性鑑定從大鼠骨髓前體細胞中分離樹突狀細胞，再體外以細胞因子誘導並擴增樹突狀細胞；流式細胞儀和雷射共聚焦進行表型鑑定；採用本領域常規的實驗方法檢測其免疫功能，包括LDH釋放法檢測CTL活性、3H滲入法檢測混合淋巴細胞反應和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測細胞因子IFN-γ。
(2)、以逆轉錄病毒或腺病毒為載體介導自殺基因轉導入腫瘤細胞。
(3)、以PEG法將樹突狀細胞與轉導有自殺基因的腫瘤細胞相融合。
(4)、體外給予自殺基因的底物，控制活疫苗在體內的存活狀態。
本發明從F344大鼠股骨骨髓中分離出單核細胞，再以GM-CSF、IL-4誘導並大量擴增出樹突狀細胞，每隻大鼠可獲樹突狀細胞5～10×107×107；倒置顯微鏡下逐日觀察樹突狀細胞生長狀態；Gimsa染色、免疫組化和掃描、透射電鏡顯示典型樹突狀細胞形態；螢光標記抗體流式細胞儀作樹突狀細胞表型鑑定，結果顯示樹突狀細胞未成熟時表面抗原低表達，成熟時高表達MHC class II、共刺激分子和粘附分子。混合淋巴細胞反應證實培養第6天的F344大鼠的樹突狀細胞能輕度刺激T細胞增殖；而培養第9天的樹突狀細胞促進T細胞增生的能力大幅度提高，差異顯著。
本發明以本領域常規使用的逆轉錄病毒為載體將自殺基因TK基因或腺病毒為載體將自殺基因CD轉導入F344大鼠卵巢癌細胞株NUTU-19，篩選出穩定的陽性克隆。陽性克隆經RT-PCR、WesternBlot、MTT法鑑定證實轉導有TK基因或CD基因，且能夠被HSV1-TK的底物GCV或Cd的底物5-FC高效地殺傷。
將培養至第8-10天的樹突狀細胞與NUTU-19用PEG法融合，經流式細胞儀、雷射共聚焦和螢光顯微鏡證實獲得雙陽性的樹突狀細胞與腫瘤融合細胞。融合細胞經RT-PCR、Western Blot、MTT法鑑定證實也轉導有TK基因或CD基因，且能夠被HSV1-TK的底物GCV或CD的底物5-FC高效地殺傷。以LDH釋放法檢測CTL活性、3H滲入法檢測混合淋巴細胞反應和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測細胞因子IFN-γ，以此證實融合疫苗能有效提高免疫功能。
以NUTU-19腹腔接種和皮下接種F344大鼠均獲得類似人卵巢癌的病程經過，並經病理證實為上皮性卵巢癌。將融合活疫苗以一周為間隔二次免疫F344大鼠，一周後皮下接種腫瘤細胞NUTU-19，觀察疫苗對抗腫瘤攻擊的保護性作用。實驗組在接種腫瘤細胞後一周再腹腔給予自殺基因的底物，觀察腫瘤的生長狀態。結果顯示，實驗組大鼠的腫瘤發生時間晚，腫瘤體積小，大鼠的生存期明顯延長，證實本發明疫苗對抗腫瘤攻擊有保護性作用。
圖5是雷射共聚焦顯示融合細胞為雙陽性，圖6是樹突狀細胞Gimsa染色，圖7是螢光顯微鏡顯示融合細胞為雙陽性。
復甦逆轉錄病毒包裝細胞TK/VPC，傳代後，取攜帶有TK基因的逆轉錄病毒上清液與F344大鼠卵巢癌細胞株NUTU-19共孵育，3天後G418篩選，克隆形成後轉板、擴增。陽性克隆經RT-PCR、WesternBlot、MTT法鑑定證實有TK基因整合，且能夠被HSV1-TK的底物GCV高效地殺傷。
將培養至第8-10天的樹突狀細胞與NUTU-19用PEG法融合。融合前NUTU-19經的紅色螢光染料Dil染色，融合後的融合細胞在以綠色螢光FITC標記的抗MHC class II抗體OX6標記。融合細胞經流式細胞儀、雷射共聚焦和螢光顯微鏡證實為雙陽性細胞。融合細胞經RT-PCR、Western Blot、MTT法鑑定證實有TK基因整合，且能夠被HSV1-TK的底物GCV高效地殺傷。以LDH釋放法檢測CTL活性、3H滲入法檢測混合淋巴細胞反應和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測細胞因子IFN-γ，結果均提示融合疫苗能有效提高免疫功能。
動物實驗共6組，每組6隻分為融合活疫苗加GCV組、融合活疫苗、滅活的融合疫苗組、DC和NUTU-19分別注射組、空白對照組、GCV對照組。疫苗均從雙足墊皮下免疫F344大鼠，每周一次，共兩次。免疫後一周皮下接種腫瘤細胞NUTU-19，觀察疫苗對抗腫瘤攻擊的保護性作用。實驗組與GCV對照組在接種腫瘤細胞後一周再腹腔給予HSV1-TK的底物GCV，繼續觀察腫瘤的生長狀態。結果顯示，實驗組大鼠的腫瘤發生時間晚，腫瘤體積小，大鼠的生存期明顯延長。
表1是樹突狀細胞促進T細胞增生結果。表1DC∶Tc＝1∶10SamGroupSI(Xple Cpm(X±SD)(n) ±SD)2347.83±431.21±DC(第6天)123.76 0.23DC(第10天) 12 15976.67±1034.7*9.49±0.68**與6dDC相比，p＜0.01。
實施例2從F344大鼠股骨骨髓中分離出單核細胞，以雙蒸水溶解紅細胞，接種24孔板，每孔加mrGM-CSF、mrIL-4，隔天半量換液，培養8-10天，每隻大鼠可獲樹突狀細胞5～10×107；倒置顯微鏡下觀察到典型的樹突狀細胞成集落生長；Gimsa染色、免疫組化和掃描、透射電鏡顯示典型樹突狀細胞形態。螢光標記抗體流式細胞儀作樹突狀細胞表型鑑定，結果顯示樹突狀細胞未成熟時表面抗原低表達OX6(MHCclass II)為45.22％，B7-2為32.76％；成熟時高表達OX6為89.21％，B7-2為56.33％。以腺病毒為載體將自殺基因CD轉導入F344大鼠卵巢癌細胞株NUTU-19，篩選出陽性克隆後轉板、擴增。克隆經RT-PCR、Western Blot、MTT法鑑定證實有CD基因軟染成功，且能夠被CD的底物5-FC高效地殺傷。
將培養至第8-10天的樹突狀細胞與轉到有CD的NUTU-19用PEG法融合。融合前NUTU-19經的紅色螢光染料Dil染色，融合後的融合細胞在以綠色螢光FITC標記的抗MHC class II抗體OX6標記。融合細胞經流式細胞儀、雷射共聚焦和螢光顯微鏡證實為雙陽性細胞。融合細胞經RT-PCR、Western Blot、MTT法鑑定證實也有CD基因整合，且能夠被CD的底物5-FC高效地殺傷。以LDH釋放法檢測CTL活性、3H滲入法檢測混合淋巴細胞反應和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測細胞因子IFN-γ，結果均提示此融合疫苗能有效提高免疫功能。
動物實驗共6組，每組6隻分為融合活疫苗加GCV組、融合活疫苗、滅活的融合疫苗組、DC和NUTU-19分別注射組、空白對照組、GCV對照組。疫苗免疫F344大鼠，每周一次，共兩次。免疫後一周腹腔接種腫瘤細胞NUTU-19，觀察疫苗對抗腫瘤攻擊的保護性作用。
實驗組與GCV對照組在接種腫瘤細胞後一周再腹腔給予HSV1-TK的底物GCV，繼續觀察腫瘤的生長狀態。結果顯示，實驗組大鼠的生存期明顯延長(P＜0.1)。
權利要求
1.可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是將自殺基因系統引入到腫瘤活疫苗，調控腫瘤活疫苗安全性和免疫效應。
2.按權利要求1所述的可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是所述的自殺基因系統是HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD雙自殺基因。
3.按權利要求1所述的可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是所述的自殺基因系統是HSV1-TK/GCV自殺基因。
4.按權利要求1所述的可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是所述的自殺基因系統是CD/5-FC自殺基因。
5.按權利要求1所述的可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是所述的腫瘤活疫苗包括樹突狀細胞疫苗，基因修飾的疫苗，DNA疫苗和抗獨特型抗體疫苗。
6.按權利要求1所述的可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是所述的腫瘤活疫苗是婦科腫瘤活疫苗。
7.按權利要求1所述的可調控的腫瘤活疫苗，其特徵是所述的腫瘤活疫苗是卵巢癌腫瘤活疫苗。
8.按權利要求1所述的調控腫瘤活疫苗的方法，其特徵是通過下述技術方案和步驟進行(1)、樹突狀細胞的分離、培養和生物免疫特性鑑定；(2)、以逆轉錄病毒或腺病毒介導自殺基因轉導入腫瘤細胞；(3)、PEG法將樹突狀細胞與轉導有自殺基因的腫瘤細胞融合；(4)、體外給予自殺基因的底物，控制活疫苗體內存活狀態。
9.按權利要求7所述的調控腫瘤活疫苗的方法，其特徵是所述的自殺基因的底物，其中HSV1-TK的底物是GCV，CD的底物是5-FC。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一種安全性和免疫效應可調控的腫瘤活疫苗及其製備方法。本發明將自殺基因系統引入腫瘤活疫苗，所述疫苗在進入體內時為活疫苗，在完成活疫苗的作用後可接受自殺基因的控制而死亡，既杜絕活疫苗在體內持續生長所導致的不良影響，又可象一般疫苗細胞解體，徹底釋放免疫物質。動物實驗結果顯示，本發明使實驗動物腫瘤發生時間晚，體積小，實驗動物生存期明顯延長，證實本發明疫苗對抗腫瘤攻擊有保護性作用，能調控腫瘤活疫苗的安全性和免疫效應。
文檔編號A61K48/00GK1476900SQ03141560
公開日2004年2月25日 申請日期2003年7月10日 優先權日2003年7月10日
發明者徐叢劍, 康玉 申請人:復旦大學附屬婦產科醫院