一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法

2023-09-19 21:22:50 1

專利名稱：：一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法
技術領域：
：本發明屬於對甲狀腺激素1\幹擾活性的檢測領域，特別涉及一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法。
背景技術：
：溴系阻燃劑目前被認為是普遍存在的持久性有機汙染物，在它的生產、使用和廢物處置階段都會不同程度地釋放到環境中。溴系阻燃劑主要可分為多溴聯苯醚(PBDEs)，多溴聯苯(PBBs)，四溴雙酚A(TBBPA)和六溴環十二烷(HBCD)等四大類。溴系阻燃劑的阻燃效率高，熱穩定性好，添加量少，對材料性能影響小，價格便宜，因而作為一種添加型阻燃劑被廣泛地應用於家用電器、室內裝璜中的泡沫塑料、地毯和布料之中；同時，含溴系阻燃劑的塑料也大量用於與電源、電路、發熱體等密切相關的電子電器設備，轎車、公共汽車、火車和飛機等，與人們的生活息息相關。溴系阻燃劑及其代謝產物與甲狀腺激素轉運蛋白有很高的結合活性，表明溴系阻燃劑可能會與體內的L甲狀腺激素競爭結合轉運蛋白，通過幹擾甲狀腺激素的轉運過程，幹擾體內甲狀腺激素的動態平衡。它對甲狀腺激素的幹擾體現在多個方面，比如直接損傷甲狀腺，造成甲狀腺肥大；改變甲狀腺激素水平，加速甲狀腺激素清除；或者與甲狀腺激素競爭結合轉運蛋白等等。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，該方法步驟簡單，快速，高效率且靈敏性高，該方法在很低濃度的條件下也能測試化合物的TTR結合活性，並得到了各化學品較理想的抑制曲線。本發明的一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，包括(1)加樣樣品組在反應管中依次加入0.1MTris-HCl緩衝液140145uL、30nM轉運蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL、15uL濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L的競爭劑，以及09uL的二甲亞碸或二氯甲烷使競爭結合反應液最終體積為200uL;對照組在反應管中依次加入0.1MTris-HCl緩衝液140145uL、30nM轉運蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL以及510uL的二甲亞碸或二氯甲烷，使反應液最終體積為200uL;(2)孵育將上述兩組反應液分別在fC下孵育1224h，以達到競爭結合平衡；(3)分離孵育結束後，除去未與轉運蛋白TTR結合的游離125I_T4;(4)測量用Y計數儀測量收集到的離心液體放射性，單位為cpm(每分鐘放射性計數)；(5)計算由每管每分鐘放射性計數cpm，求出樣品組與對照組每分鐘放射性計數cpm的比值，即為125I-T4和待測化合物與轉運蛋白TTR孵育競爭結合的能力。所述步驟(1)中的0.1MTris-HCl緩衝液的組分濃度為0.1MTris-HC1，0.1MNaCl和0.ImMEDTA，pH=8.0;具體配製步驟如下稱量12.llgTris，5.856gNaCI和0.0370gEDTA，加入780800mL的去離子水，充分攪拌溶解，再加入34ml濃鹽酸調節pH值至8.O，定容至1L;所述步驟(1)中的競爭劑為含溴阻燃劑類汙染物，具體為四溴雙酚A(TBBPA)、六溴環十二烷HBCD、2，2'，4，4'_四溴聯苯醚(BDE-47)或環境樣本萃取液，環境樣本萃取液利用PUF大氣被動採樣裝置採集室內空氣，以二氯甲烷為萃取劑用索氏抽提法抽提48小時得到。所述步驟(3)中的分離是指用0.1MTris-HCl緩衝液預先平衡lml的S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱，以3000rpm離心2min，棄離心出的液體；取100uL競爭結合反應液加到S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱上，再3000rpm離心2min，並收集離心出的液體。本發明通過單濃度實驗確定化學品的競爭結合濃度梯度每管加入濃度為8X10—5mol/L的5uL抑制劑，同時準備兩個對照組，一組無競爭劑，一組無TTR，其它溶液組成不變。檢測無競爭劑，有競爭劑和無TTR時的甲狀腺激素(T4)與甲狀腺運載蛋白(TTR)的結合率，再根據結合率來判斷該濃度下各化學品有無抑制性，有無跟TTR結合。如果該濃度下化學品能抑制T4與TTR的競爭結合，根據該濃度由高濃度到低濃度確定化學品的濃度梯度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L。有益效果本發明的TTR結合活性測試方法步驟簡單，快速，高效率而且靈敏性很高，該方法在很低濃度的條件下(8X10—5mol/L8X10—6mol/L)也能測試化合物的TTR結合活性，並得到了各化學品較理想的抑制曲線。圖1是TBBPA的TTR抑制曲線；圖2是BDE-47的TTR抑制曲線；圖3是HBCD的TTR抑制曲線;圖4是環境樣本萃取液的TTR抑制曲線。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例(1)0.1MTris-HCl緩衝液的配製稱量12.llgTris，5.856gNaCl和0.0370gEDTA，加入780800mL的去離子水，充分攪拌溶解，再加入34ml濃鹽酸調節pH值至8.O，定容至1L;(2)加樣樣品組在反應管中依次加入0.1MTris-HCl緩衝液140145uL、30nM轉運蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL、l5uL濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L的競爭劑(TBBPA、HBCD、BDE-47或環境樣本萃取液)以及09uL的二甲亞碸或二氯甲烷使競爭結合反應液最終體積為200uL;對照組在反應管中依次加入0.1MTris-HCl緩衝液140145uL、30nM轉運蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL以及510uL的二甲亞碸或二氯甲烷，使反應液最終體積為200uL;(3)孵育將上述兩組反應液在fC下孵育1224h，以達到競爭結合平衡；(4)分離:孵育結束後，用0.1MTris-HCl緩衝液預先平衡lml的S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱，以3000rpm離心2min，棄離心出的液體；取100uL競爭結合反應液加到S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱上，再3000rpm離心2min，並收集離心出的液體，以除去未與轉運蛋白TTR結合的游離125I_T4;(5)測量用Y計數儀測量收集到的離心液體放射性，單位為cpm(每分鐘放射性計數)；(6)計算由每管每分鐘放射性計數cpm，求出125I_T4和待測化合物與轉運蛋白TTR孵育競爭結合的能力。以上具體加樣和操作程序見下表1:No.加樣或操作總放管零結合管非特異管競爭管TBoNB(uL)(uL)(uL)(uL)1緩衝液/1431451432競爭劑///3DMSO/5/4125I-T450505050TTR蛋白/2ug/2uL/2ug/2uL6溫育4'C放置過夜7離心3000rpm，4。C離心2min8測量測量洗出放射性計數(cpm)9計算求出B與Bo每分鐘放射性計數cpm的比值實施例1TBBPA化合物TTR結合活性分析表2:TBBPA化合物的抑制率(B/Bo表示)tableseeoriginaldocumentpage6通過表2的實驗數據得到了TBBPA的TTR抑制曲線(圖1)。當競爭結合反應液中沒有添加TBBPA(無抑制劑即競爭劑)時T4與TTR的結合率為100%，無幹擾。當競爭結合反應液中加了不同濃度的TBBPA(加抑制劑)後，隨著反應液中TBBPA濃度的增加，T4與TTR的競爭結合率不斷降低。當TBBPA的濃度增加到了最高濃度8X10—5時，TBBPA會顯著地抑制T4與TTR的結合，這時T4與TTR的競爭結合率為14.17%。在濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L時，T4與TTR的結合率在14.17%85.64%。這說明隨著TBBPA濃度的增加，它的抑制性越強，跟TTR的競爭結合能力越高，通過TTR的甲狀腺激素幹擾活性也越實施例2PBDE化合物TTR結合活性分析表3:PBDE化合物的抑制率(B/Bo表示)tableseeoriginaldocumentpage6通過表3的實驗數據得到了BDE-47的TTR抑制曲線(圖2)。當競爭結合反應液中沒有添加BDE-47(無抑制劑)時T4與TTR的結合率為100%，無幹擾。當競爭結合反應液中加了不同濃度的BDE-47(加抑制劑)後，隨著反應液中BDE-47濃度的增加，T4與TTR的競爭結合率不斷降低。當BDE-47的濃度增加到了最高濃度8X10—5mol/L時，1\與TTR的競爭結合率為64.42%。在BDE-47濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L時，丁4與TTR的結合率在64.42%91.29%。這說明隨著TBBPA濃度的增加，它的抑制性越強，跟TTR的競爭結合越多，通過TTR的甲狀腺激素幹擾活性也越高。實施例3HBCD化合物TTR結合活性分析表4:HBCD化合物的抑制率(B/Bo表示)tableseeoriginaldocumentpage7通過表4的實驗數據得到了HBCD的TTR抑制曲線(圖3)。當競爭結合反應液中沒有添加HBCD(無抑制劑)時T4與TTR的結合率為100%，無幹擾。當競爭結合反應液中加了不同濃度的HBCD(加抑制劑)後，隨著反應液中HBCD濃度的增加，T4與TTR的競爭結合率不斷降低。當HBCD的濃度增加到了最高濃度8X10—5時，T4與TTR的競爭結合率為73.14%。在HBCD濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L時，T4與TTR的結合率在73.14%94.91%。這說明隨著TBBPA濃度的增加，它的抑制性越強，跟TTR的競爭結合越多，通過TTR的甲狀腺激素幹擾活性也越高。實施例4環境樣本萃取液TTR結合活性分析tableseeoriginaldocumentpage8通過表5的實驗數據得到了環境樣本萃取液的TTR抑制曲線(圖4)。當競爭結合反應液中沒有添加萃取液時T4與TTR的結合率為100%，無幹擾。當競爭結合反應液中加了不同量的萃取液後，隨著反應液中萃取液的量的增加，T4與TTR的競爭結合率不斷降低。當萃取液的量增加到了4uL時，T4與TTR的競爭結合率甚至下降到20%左右，抑制效果非常明顯。這說明隨著環境樣本萃取液濃度的增加，它的抑制性越強，跟TTR的競爭結合越多，通過TTR的甲狀腺激素幹擾活性也越高。權利要求一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，包括(1)加樣樣品組在反應管中依次加入0.1MTris-HCl緩衝液140～145uL、30nM轉運蛋白TTR2～5uL、55nM125I-T445～50uL、1～5uL濃度為8×10-5mol/L～8×10-6mol/L的競爭劑，以及0～9uL的二甲亞碸或二氯甲烷使競爭結合反應液最終體積為200uL；對照組在反應管中依次加入0.1MTris-HCl緩衝液140～145uL、30nM轉運蛋白TTR2～5uL、55nM125I-T445～50uL以及5～10uL的二甲亞碸或二氯甲烷，使反應液最終體積為200uL；(2)孵育將上述兩組反應液分別在4℃下孵育12～24h；(3)分離孵育結束後，除去未與轉運蛋白TTR結合的游離125I-T4；(4)測量用γ計數儀測量收集到的離心液體放射性，單位為cpm；(5)計算由每管每分鐘放射性計數，求出樣品組與對照組每分鐘放射性計數的比值，即為125I-T4和待測化合物與轉運蛋白TTR孵育競爭結合的能力。2.根據權利要求1所述的一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的0.1MTris-HCl緩衝液的組分濃度為1MTris-HCl，O.1MNaCl和0.ImMEDTA，pH=8.0。3.根據權利要求2所述的一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，其特徵在於所述步驟的0.1MTris-HCl緩衝液具體配製步驟如下稱量12.llgTris，5.856gNaCl和0.0370gEDTA，加入780800mL的去離子水，充分攪拌溶解，再加入34ml濃鹽酸調節pH值至8.0，定容至1L。4.根據權利要求1所述的一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的競爭劑為含溴阻燃劑類汙染物，具體為四溴雙酚A、六溴環十二烷、2，2'，4，4'_四溴聯苯醚或環境樣本萃取液。5.根據權利要求1所述的一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的分離是指用0.1MTris-HCl緩衝液預先平衡1ml的S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱，以3000rpm離心2min，棄離心出的液體；取lOOuL競爭結合反應液加到S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱上，再3000rpm離心2min，並收集離心出的液體。全文摘要本發明涉及一種測定含溴阻燃劑類汙染物的甲狀腺幹擾活性的方法，包括在反應管中依次加入Tris-HCl緩衝液、TTR、125I-T4以及競爭劑；同時另取一組反應管替換競爭劑為相應溶劑作為對照組；在4℃下孵育12～24h；孵育結束後，除去未與轉運蛋白TTR結合的游離125I-T4；用γ計數儀測量收集到的離心液體放射性，由每管每分鐘放射性計數cpm，求出125I-T4和待測化合物與轉運蛋白TTR孵育競爭結合的能力。該方法步驟簡單，快速，高效率且靈敏性高，該方法在很低濃度的條件下也能測試化合物的TTR結合活性，並得到了各化學品較理想的抑制曲線。文檔編號G01N23/02GK101738404SQ200910198538公開日2010年6月16日申請日期2009年11月10日優先權日2009年11月10日發明者冀秀玲,劉洋申請人:東華大學