一種臨床標本中病原菌基因鑑定前處理方法
2023-09-20 06:08:45 1
專利名稱：一種臨床標本中病原菌基因鑑定前處理方法
技術領域：
本發明涉及臨床標本病原微生物基因檢測，屬於分子生物學領域。
背景技術：
國內外報導的標本前處理方法比較少，沒有專門針對各種不同臨床原始標
本的前處理方法。目前主要應用到臨床的標本前處理有鹼裂解法、免疫磁珠 法。鹼裂解法利用鹼液使標本中蛋白質發生變性溶解於鹼液中，通過洗脫鹼液 達到分離病原微生物基因的目的。免疫磁珠法通過磁珠吸附蛋白質與其它幹擾 因子達到分離病原微生物基因的目的。
臨床利用基因直接鑑定臨床體液標本中病原菌實際應用很少，存在的最大 技術難點在於臨床體液標本中含有蛋白質、細胞因子等幹擾因素，而研究證明 蛋白質和細胞中的人類基因組DNA都會干擾抑制病原菌的核酸擴增反應。這 種抑制作用在膿性的標本尤為突出。免疫磁珠法是目前國內最流行的處理方法， 但其抗幹擾能力弱，對純培養的細菌效果好，不適合直接用於臨床標本。傳統 的鹼裂解法裂解不徹底，很難裂解膿性標本。同時鹼裂解時間長，容易破壞細 菌基因，降低提取效率。
螢光定量PCR是1995年美國PE公司發明一種核酸定量技術，在普通PCR
的基礎上使用螢光探針達到核酸定量的目的。具有靈敏度高、結果準確、操作 簡單的特點，目前臨床廣泛應用於血清病毒定量檢查。
雖然螢光定量PCR直接鑑定臨床標本中病毒在臨床應用較多，但應用於其 它病原微生物如細菌和真菌檢測的卻很少。而臨床感染性標本很常見，檢測方 法主要為傳統培養鑑定。由於培養鑑耗時長，臨床往往在未接到實驗室培養報 告時就已經開始經驗用藥進行到治療，造成了抗生素的不合理使用'不但加重 患者的經濟負擔，而且還會產生對抗生素的耐藥問題，對後面的治療帶來負面 的影響。同時有相當的病原微生物體外培養困難，易產生漏診。真菌生長緩慢,報告時間長和易漏診的矛盾更加突出。因此，提供一種能夠在短時間內迅速檢 測出臨床標本中病原微生物的方法，從而指導臨床用藥，已經成為檢驗醫學領 域急需解決的問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種臨床標本直接病原菌基因鑑定前處理方法。 本發明所涉及的臨床標本直接病原菌鑑定前處理方法是釆用兩步裂解法。 所述的兩步裂解法是在單純鹼裂解法基礎上改進而成的，在鹼裂解前加一步胰 酶裂解步驟。有效的標本前處理方法是基因鑑定技術的關鍵，只有在標本前處 理中提取到了足量的病原菌核酸，才能進行直接鑑定。兩步裂解法解決了這一 技術難點，為直接鑑定提供了可靠的技術保障。
為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的
(1) 胰蛋白酶裂解
lml標本加入等量20mg/l的胰蛋白酶37°C 2 -4h至標本基本液化，抽吸順暢。
(2) 鹼裂解
再加入2ml4。/。NaOH 42°C lh, 12000rpm離心15min，去上清，生理鹽水 12000rpm洗滌兩遍取沉澱。向沉澱中加入25jli1雙蒸水與少量磁珠。再用反覆 凍融法，95°C 10min,迅速置於-80。C 10min,再95°C 10min, 12000rpm5min
取上清即可。
適合濃度的胰酶既可以對蛋白質進行裂解，又不會破壞微生物的細胞膜， 不會影響微生物基因的提取。而且經胰酶鹼裂解後的標本，再進行鹼裂解更容 易的徹底充分，對膿性標本效果也很理想。同時鹼裂解時間也大幅縮短，減少 了對病原微生物的破壞。最後提取部分結合了磁珠法的優勢，在除去標本幹擾 因素後，結合磁珠法進行核酸提取。
本發明可以針對原核病原微生物與真核病原微生物的雙重螢光定量PCR 的應用於臨床病原微生物檢測。具有快速、靈敏度高、操作簡單的特點，並且 可以同時檢測細菌和真菌，能夠快速報告臨床，指導臨床用藥。為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的
1、 標本鑑定前的處理
(1 ) lml標本加入等量20mg/l的胰蛋白酶37°C 2 -4h至標本基本液化，抽 吸順暢。
(2)再加入2ml 4%NaOH 42°C lh， 12000rpm離心15min,去上清，生 理鹽水12000rpm洗滌兩遍取沉澱。向沉澱中加入25^1雙蒸水與少量磁珠。再 用反覆凍融法，95°C lOmin,迅速置於-80。C 10min，再95°C lOmin。 12000rpm 5min取5pl上清備用。
2、 螢光定量PCR擴增選取原核生物16SrRNA基因通用引物上遊5，-AGT TTG ATC TGG CTC AG -3 ，和下遊5 ， — GGA CTA CTA CAG GGT ATC TAA T-3，；真核生物l 8 SrRNA基因間隔區通用引物上遊5，-TCCGTAGGTGAA CCT GCG G-3 ，和下遊5 ， - GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3 ，(均由北京萬 泰生物藥業有限公司提供)。兩對引物的的探針5，端標記的螢光報告基團分別 是ROX、 HEX , 3，端標記的螢光淬滅基團均為ECL IPSE。反應體系為25pl組 分如下dNTPs2.0pl 、 10 xPCRBuffer2.5|il 、 MgC12 1.4|iil、 TaqDNA聚合酶 0.化1、原核微生物探針0.4^1、真核微生物探針0.4pl、MRP21 1.0pl、MRP22 l.Opl、 MRPp0.3)al、 ddH20 8 .0^1。最後,加入5 模板。蓋上塑料蓋，瞬時離心後，放 入螢光定量PCR儀中,按下列反應參數進行95 。C預變性5min , 94 。C3 0s、 55°C15s、 72°C40s擴增40個循環，觀察結果。
臨床實驗室可利用此方法直接提取標本中的核酸，利用螢光定量P CR儀 進行檢測。無螢光定量P CR儀的臨床醫院也可將擴增產物通過凝膠電泳判斷 陰陽性，從而判別臨床標本中是否存在病原微生物感染。有條件的實驗室還可 以進一 步進行核酸測序判定病原菌的種類。
通過本發明所述的檢測方法，臨床醫院能在第一時間內直接提取傳染性疾 病的各種原始標本中的病原微生物基因，通過螢光定量PCR進行臨床標本病原 微生物的快速定量診斷，對於病人抗生素的使用具有重要意義。抗生素的合理 使用減少耐藥率關係到國家衛生事業的發展和人民群眾的切身利益。由於真菌的用藥譜較窄，及時診斷出是否存在真菌感染可以有效的提示臨床及早治療。
圖1—1為兩步裂解法處理後標本PCR產物凝膠電泳結果； 圖1—2為磁珠法結果； 圖1—3為鹼裂解結果； 圖l一4為Maker;
圖2為螢光定量PCR檢測螢光曲線； 曲線1為原核生物ATCC25922大腸埃希氏菌螢光曲線； 曲線2為真核生物ATCC6528克柔假絲酵母菌螢光曲線； 圖3為檢測出的微生物電泳條帶；
圖3—1上端為原核病原微生物ATCC25922大腸埃希氏菌擴增產物電泳條 帶，下端為真核病原微生物ATCC6528克柔假絲酵母菌電泳條帶； 圖3—2為1000bp-100bp maker。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以助於理解本發明的內容。 實施例1
試劑的準備
選用下列試劑進行本發明所述的微生物檢測4。/。NaOH鹼裂解液，20mg/L 的胰酶，原核生物16SrRNA基因通用上下遊探針5，-AGTTTGATCTGGCTC AG-3 ，和5 ，-GGA CTA CTA CAG GGT ATC TAA T-3 ，，真核生物18 S rRNA基因 間隔區通用上下遊探針5， - TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，和5， - GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3，，磁珠一管(以上均從北京萬泰生物藥業有限公 司購得)，標準品104、 105 、 106 、 107拷貝的指控品各一管(由中國藥品生 物製品檢定所生產)。 實施例2
臨床標本鑑定前的處理(1 )選取含有ATCC25922大腸埃希氏菌和ATCC6528克柔假絲酵母菌的 標本lml加入等量20mg/l的胰蛋白酶37。C2h (3h或4h)至標本基本液化，抽 吸順暢。
(2)再加入2ml 4%NaOH 42°C lh， 12000rpm離心15min,去上清，生 理鹽水12000rpm洗滌兩遍取沉澱。向沉澱中加入25pl雙蒸水與少量磁珠。再 用反覆凍融法，95°C 10min,迅速置於-80。C 10min,再95°C 10min。 12000rpm 5min取5 pl上清備用。 實施例3
臨床標本中病原微生物的檢測
1、 實施例2中的標本鑑定前的處理
2、 螢光定量擴增選取ATCC25922大腸埃希氏菌16SrRNA基因通用引 物上遊5， - AGT TTG ATC TGG CTC AG -3，，下遊5， - GGA CTA CTA CAG GGTATCTAAT-3，。 ATCC6528克柔假絲酵母菌1 8 SrRNA基因間隔區通用 引物上遊5， 一 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3',下遊5， 一 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3'。兩對引物的的探針5，端標記的螢光報告基團分別是 ROX、 HEX，3，端標記的螢光淬滅基團均為ECLIPSE (由北京萬泰生物藥業有 限公司提供)。反應體系為2 5pl組分如下dNTPs 2.0|il 、 10 xpCR Buffer 2.5^1 、 MgC12 1.4pl、 Taq DNA聚合酶0.4^1、 ATCC25922大腸埃希氏菌探針 0.4pl、 ATCC6528克柔假絲酵母菌探針0.4pl、MRP21 1.0pl、MRP22 1.0pl、MRPp OJ(il、 ddH20 8.0nl。最後,力口入5pl模板。蓋上塑料蓋，瞬時離心後，放入熒 光定量PCR儀中，按下列反應參數進行95 。C預變性5min,94 。C3 0 s、55°C 15s、 72。C40s擴增40個循環，觀察結果。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並非用於限定本發明的保護範圍。
權利要求
1、一種臨床標本中病原菌基因鑑定前處理方法，包括以下步驟(1)胰蛋白酶裂解；(2)鹼裂解。
2、 根據權利要求1所述的臨床標本中病原菌基因鑑定前處理方法，其特徵 在於，胰蛋白酶裂解是在標本中加入等量20mg/l的胰蛋白酶37°C 2 -4h至標本 基本液化，抽吸順暢。
3、 根據權利要求l所述的臨床標本中病原菌基因鑑定前處理方法，其特徵 在於，鹼裂解是在胰蛋白酶裂解的基礎上再4。/。NaOH 42°C lh，離心，去上清， 生理鹽水洗滌、離心，2次取沉澱，向沉澱中加入雙蒸水與少量磁珠，再用反 復凍融法，95°C 10min,迅速置於-80。C 10min,再95°C 10min,離心，取上 清即可。
全文摘要
本發明公開了一種臨床標本直接病原菌基因鑑定前處理方法。本發明的臨床標本中病原菌基因鑑定前處理方法採用兩步裂解法，包括胰蛋白酶裂解和鹼裂解。採用本發明的方法處理的標本，可以快速的檢測出臨床標本中的病原微生物，具有靈敏度高、操作簡單的特點，能夠合理地指導臨床用藥。
文檔編號C12N15/10GK101649318SQ20091015740
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月28日 優先權日2009年7月28日
發明者魯辛辛 申請人:魯辛辛