過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極的製作方法

2023-09-19 08:47:45 2

專利名稱：過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極及其製備方 法和應用，屬於生物傳感器領域。
背景技術：
生物傳感器是一種以生物活性物質(如酶、抗體、核酸、細胞等)為敏感 基元，並將其固定在信號轉換器上，構成生物轉化器，並通過把生物化學信號 轉換為相應的物理化學信號的儀器。生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分 析速度快、成本低等特點，其在生物、醫學、環境監測、食品、醫藥與軍事醫 學領域有著重要的應用價值，已引起世界各國的極大的關注。遺憾的是，在生 物傳感器中，蛋白質在電極表面通常易被吸附，可能造成構像變化和喪失活性， 從而使得蛋白質在電極表面的電子傳遞能力受到抑制。為了要實現這些缺乏長 程電子通道的蛋白質的直接電子轉移，就需要達到如下目的l)使蛋白質的活 性中心儘可能的接近電極表面；2)使蛋白質分子適當變形但不失活;3)使電 極表面與蛋白質分子充分接觸；4)通過修飾電極打開電子通道。要達到這些目 的方法有很多，其中一個比較有效的方法就是用適當的材料固定蛋白質於電極 上，從而促進蛋白質與電極的直接電子傳遞。很多材料，如聚合物膜、納米材料、表面活性劑、類脂膜等都被用於固定 蛋白質以製造生物傳感器。在這些材料中，納米結構的氧化鈦材料也被廣泛用 於固定蛋白質製造生物傳感器。氧化鈦納米材料具有高比表面積、強的吸附能 力、良好的生物相容性以及優異的熱和化學穩定性等一系列優良特性。許多課 題組都報導了利用各種納米結構氧化鈦材料作為主體負載蛋白質製造生物傳感 器的方法。這些納米結構，包括氧化鈦納米顆粒、氧化鈦納米管、介孔氧化鈦 等。由這些不同結構並且利用不同固定方法固定蛋白質的得到的生物傳感器， 其性能隨著載體結構和固定方法的不同有所不同。目前，在本領域中，研究並 製備基於納米氧化鈦固定蛋白質的生物傳感器的活動依然十分活躍。其目的在 於， 一方面提高傳感器的響應性能，另一方面也為拓展傳感器的使用環境。本發明在上述研究基礎上，利用過渡金屬部分取代的層狀氧化鈦固定蛋白， 用此新製備的複合材料修飾電極，製備得到一類新穎的生物傳感器，目前國內 外還未見報導。發明內容本發明提供了一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極及其製備 方法和應用。過渡金屬元素和組分的不同可以得到一系列的修飾電極，通過調 整氧化鈦的組成，可以製備性能不同的修飾電極。本發明中材料製備步驟依次如下首先將鹼金屬碳酸鹽，二氧化鈦和過渡金屬氧化物按化學式AJi2-yMy04稱量，混合，其中，A為元素K， Rb， Cs; x， y為摻雜實際組分，0.7《x《0.9， 0Ky《0.6; M為Co， Ni，、Cu， Zn， Mn則，Fe則0然後在600-120(TC下 焙燒20-40小時，冷卻至室溫並研磨，重複高溫反應一次並再次室溫研磨，得 到層狀鈦酸鹽。(2) 上面所述的層狀鈦酸鹽與1.0-2.0 mol/L無機強酸(如鹽酸、硝酸和 硫酸)以固液比(10-20)g/L的比例進行質子交換反應，室溫攪拌20小時以上， 為了使質子化充分化，需要重複上述步驟三次以上，最後經過離心、水洗、在 室溫下風乾，得到質子化的層狀鈦酸鹽。(3) (a)將所得產物與季銨鹼按0.2-1: 1的酸鹼摩爾比混合攪拌，反應 1-8天後，將所得的懸浮液離心分離，去除下層沉澱後，得到上層半透明溶膠；(b)或者將所得產物與氨基十一酸或氨基十酸或氨基十二酸按 0.2-0.4: l的質量比在水中混合，加熱至沸後保持10-20分鐘，然後劇烈攪拌， 離心，熱水洗，風乾，得到產物按固液比lg-2g/lL在pH值為8.0-9.0的水溶 液中分散，超聲反應2小時以上，將所得的懸浮液離心分離，去除下層沉澱後， 得到上層半透明溶膠。 、(4) 將上面(a)或(b)所得的半透明溶膠用0. 5-2.0mol/L有機弱酸(如 醋酸、檸檬酸、丙酸等)調pH至7.0-9.0，然後，將蛋白質分子與該調節後的 半透明溶膠按1-10: 1的質量比在室溫攪拌混合，逐滴加入有機酸直到引發沉 澱生成過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白。(5) 將上述所得的過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白塗覆在電極(包括 熱解石墨電極、玻碳電極或者ITO電極)上，在空氣中乾燥，得到層狀氧化鈦 固定蛋白修飾電極，並對其進行各種電化學分析。此過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極包括過渡金屬取代的層狀 氧化鈦固定蛋白層和電極層，其中蛋白質分子固定於過渡金屬取代的層狀氧化鈦納米片之間，形成類似三明治結構，其組成式為Hb/Ti2—yMy04， Hb為蛋白質分 子，y為摻雜實際組分，0. 25《y《0.6， M為Co， Ni, Cu， Zn， Mn(UI)， Fe(LII)。 過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白層塗覆在電極層的表面。 所述的電極層包括熱解石墨電極或玻碳電極或IT0電極。 所述的蛋白質分子優選血紅蛋白。本發明提供的過渡金屬部分取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極的特點是1) 在溫和的條件下將蛋白固定在層狀氧化鈦的層中間。2) 修飾電極的結構圖如圖l所示。蛋白分子固定於氧化鈦納米片之間，類 似於三明治的結構，蛋白和氧化鈦納米片的複合物塗覆在電極的表面。3) 本發明工藝簡單，所需生產設備簡單，易於實現工業化生產。4) 由於層狀結構對生物分子的保護作用，使得該傳感器可以在強酸溶液中 使用分析。5) 通過調變氧化鈦的組成，可以得到了一種響應相對更靈敏的生物傳感器。 例如以Ko,8TiL6NioA和K。.8Tii.2Fe。.晶為初始材料制的酶電極，分別記為Hb/ Ti』i。,A和Hb/TiuFeo.^,結果表明Hb/TUea^的響應更為靈敏。


圖1過渡金屬部分取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極結構示意圖。圖2過渡金屬部分取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極的小角X射線衍射圖。圖3修飾電極的循環伏安圖，掃描速度為O. 06mV。a)為固定蛋白修飾電極; b)為氧化鈦納米片晶溶膠修飾電極。圖4在1.0 mo1/1 pH分別為2.0， 5.0， 7. 0的緩衝溶液中，在-400mV的電壓下固定蛋白修飾電極對雙氧水的時間電流響應曲線，每次加入雙氧水的濃度 為50uM。圖5原料組成為K。.8Ti,2Fe。.s04的層狀氧化鈦固定蛋白分子修飾電極的循環 伏安圖，掃描速度為0.06 mV。
具體實施方式
通過實施例詳述本發明，但本發明絕非僅局限於實施例。實施例l原料組成為K。.JiL6Ni。.A的層狀氧化鈦固定血紅蛋白分子修飾電極。稱取K2C03 2.0 g、 Ni0 1.03 g和Ti02 4. 4 g，混合，然後研磨均勻，放入 石英柑堝中，直接敞口放入馬弗爐中在1100 t下加熱20小時，冷卻後再次研 磨均勻，再次放入馬弗爐中在1100 。C下加熱20小時，冷卻得到固體粉末。取 上述粉末2. 0 g放入1. 0 mol/L鹽酸200 ml中攪拌24小時，進行質子交換反 應，為了使質子化充分需要重複上述步驟三次，最後經過離心、水洗、在室溫 下風乾，得到質子化的層狀鈦酸鹽。取0.4g質子化的層狀鈦酸鹽加入100ml含 8ml 40%四丁基氫氧化銨的水溶液中，室溫攪拌8天後，在8000 rpm下離心分 離，取上層溶膠備用。取氧化鈦層板含量為0. 5mg/ml的膠體10ml與2mg/ml血 紅蛋白溶液10ml混合，用lmol/l醋酸調節pH為5.5左右，引起自組裝的產生， 生成絳紅色沉澱。熱解石墨分別經粗細砂紙打磨，用導電膠將鉑絲和熱解石墨 電極相連，然後再放置於130度的烘箱乾燥3小時。將上述得到的紅色沉澱在 攪拌均勻，取0.35ml懸浮液直接滴塗到製備好的石墨電極上，在空氣中乾燥 10-12小時，並得到了固定的血紅蛋白修飾電極。小角X射線衍射在低角度出現 比較強的衍射峰(圖2)，說明血紅蛋白固定在氧化鈦無機層的中間。XRD分析 表明對於此種樣品，層間距為7. lnm，減去氧化鈦單層厚度0. 75nm，為6. 35nm， 略小於蛋白質分子(5.3 X 5.4 X 6.5 nm)最大軸6. 5nm，蛋白質在層間屬於單 層排列。圖3a顯示的是在濃度為1. 0 mol/1 pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液 中此修飾電極的循環伏安曲線。由圖表明此電極有一對形狀相似，大小相當的 氧化還原峰，分別在-204和-285 mV，說明存在著可逆的電子轉移。圖4a顯示 此修飾電極在pH為5的緩衝溶液中對雙氧水的電化學響應測試。測試在室溫下 的三電極電解池中進行，修飾電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl為參比 電極。向工作電極加-0. 4V的電壓，直到得到穩態電流，然後向濃度為1.0 mol/1 pH為5.0的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中連續的加入雙氧水，記錄電流隨時間的變化。 在測試之前，用高純氮氣向溶液中鼓泡30分鐘除氧，測試時用氮氣保護，以排 除氧氣的千擾。圖3顯示隨著雙氧水不斷的加入，會產生階梯狀的電流躍遷， 並且電流響應迅速，在5s中內就能達到95%的穩態電流。由圖4可知，此修飾 電極的靈敏度為27PAmM—1 cm—2。對比例1納米片晶溶膠直接修飾電極將上述方法合成的由組成為K。.8Ti,fiNiQ 404的層狀氧化鈦剝離得到的納米片 晶溶膠直接滴塗在熱解石墨電極上，在空氣中過夜乾燥，得到的修飾電極用於 與實施例1中的酶修飾電極對比。由圖3b所示，此電極在與實施例1相同條件 下做循環伏安掃描，沒有觀察到還原峰和氧化峰，說明實施例1中的氧化還原 峰來源於血紅蛋白分子，而不是納米片晶。對比例2原料組成為K。.JiL6Ni。.必的層狀氧化鈦固定血紅蛋白分子修飾電 極在強酸溶液中對雙氧水的電化學響應測試。圖4b、 4c分別為pH值為2. 0和7. 0的溶液中修飾電極的對雙氧水的電流 響應曲線。由圖可知隨著pH值的減小，靈敏度反而變大。這是因為氧化鈦片層 對酶分子出色的保護，即使在pH值為2的情況下，依然能很好地保持活性。顯 示了此修飾電極在酸性體系中極好的應用前景。實施例2原料組成為處。.811,.6(:0。.404的層狀氧化鈦固定血紅蛋白分子修飾電極稱取Rb2C03 23. 1 g、 CoO 7.5 g和Ti02 32. 0 g，混合，然後研磨均勻，放 入石英坩堝中，直接敞口放入馬弗爐中在1100 °C下加熱20小時，冷卻後再次 研磨均勻，再次放入馬弗爐中在1100 °(:下加熱20小時，冷卻得到固體粉末。 其他製備方法同實施例1，可以得到原料為Ab。.8TiuCo。.404的層狀氧化鈦固定血 紅蛋白修飾電極。實施例3原料組成為K。.JiL2Fe。.804的層狀氧化鈦固定血紅蛋白分子修飾電極稱取K2C03 2 . 0 g， Fe203 2. 3g和Ti02 3. 5 g，混合，然後研磨均勻，放入石 英坩堝中，直接敞口放入馬弗爐中在1100 。C下加熱20小時，冷卻後再次研磨 均勻，再次放入馬弗爐中在1100 °C下加熱20小時，冷卻得到固體粉末 KaJi^FeoA取上述粉末2.0 g放入l.O mol/L鹽酸200 ml中攪拌24小時， 進行質子交換反應，為了使質子化充分需要重複上述步驟三次，最後經過離心、 水洗、在室溫下風乾，得到質子化的層狀鈦酸鹽。取lg質子化的層狀鈦酸鹽加 入100ml含10ral 4096四丁基氫氧化銨的水溶液中，室溫攪拌10天後，在8000 rpm 下離心分離，取上層溶膠備用。取氧化鈦含量為0. 5mg/ml的膠體10ml與2mg/ml 血紅蛋白溶液10ml混合，用lmol/l醋酸調節pH為5.5左右，引起自組裝的產生，生成絳紅色沉澱。圖5顯示的是在濃度為1. 0 mol/1 pH為5. 0的乙酸-乙 酸鈉緩衝溶液中此修飾電極的循環伏安曲線。由圖表明此電極有--對形狀相似， 大小相當的氧化還原峰，分別在-200和-289 mV，說明存在著可逆的電子轉移。 同時，氧化還原峰電流比實例1的大一倍左右。這是因為層板摻入Fe以後導電 性增加導致的。
權利要求
1. 一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極，包括過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白層和電極層，其特徵在於過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白層中蛋白質分子固定於過渡金屬取代的層狀氧化鈦納米片之間，形成類似三明治結構，其組成式為Hb/Ti2-yMyO4，Hb為蛋白質分子，y為摻雜實際組分，0.25≤y≤0.6，M為Co或Ni或Cu或Zn或Mn(III)或Fe(III)；過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白層塗覆在電極層的表面；電極層為熱解石墨電極或玻碳電極或ITO電極。
2、 按權利要求1所述的一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極， 其特徵在於所述蛋白質分子為血紅蛋白。
3、 按權利要求1或2所述的一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾 電極，其特徵在於過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白層組成式為Hb/TiL2Fe。.804
4、 按權利要求1或2或3所述的過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾 電極的製備方法，其特徵在於包括下述步驟(1) 將鹼金屬碳酸鹽，二氧化鈦和過渡金屬氧化物按化學式AJi2-yMA稱量， 混合，其中，A為元素K， Rb， Cs; x， y為摻雜實際組分，0.7《x《0.9， 0.25 《y《0.6; M為Co或Ni或Cu或Zn或Mn(in)或Fe(LII)，然後在600-1200。C下 焙燒20-40小時；(2) 將步驟(1)所得產物與無機強酸進行質子交換反應；(3) 將步驟(2)所得產物與季銨鹼按0.2-1: l的摩爾比混合攪拌，反應後分離得到上層半透明溶膠；(4) 將步驟(3)分離所得產物用有機弱酸調pH至7.0-9.0，將蛋白質分 子與該調節後的半透明溶膠按1-10: 1的質量比在室溫攪拌混合，逐滴加入有 機酸；(5) 將步驟(4)所得產物塗覆在電極上並乾燥。
5、 按權利要求1或2或3所述的包括下述步驟(1 )將鹼金屬碳酸鹽，二氧化鈦和過渡金屬氧化物按化學式AJi^MA稱量， 混合，其中，A為元素K， Rb， Cs; x， y為摻雜實際組分，0. 7《x《0.9， 0.25 《y《0. 6; M為Co或Ni或Cu或Zn或Mn(UI)或Fe(IH)，然後在600-1200。C下 焙燒20-40小時；(2) 將步驟(1)所得產物與無機強酸進行質子交換反應；(3) 將步驟(2)所得產物與氨基十一酸或氨基十酸或氨基十二酸與水混 合，加熱至沸，然後劇烈攪拌、離心分離、水洗、乾燥、分散、離心分離得到 上層半透明溶膠；(4) 將步驟(3)分離所得產物用有機弱酸調pH至7. 0-9. 0，將蛋白質分 子與該調節後的半透明溶膠按1-10: 1的質量比在室溫攪拌混合，逐滴加入有 機酸；(5) 將步驟(4)所得產物塗覆在電極上並乾燥。
6、 按權利要求4或5所述的過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極 的製備方法，其特徵在於步驟(2)中所述的無機強酸為鹽酸或硝酸或硫酸，濃 度為1. 0-2. 0 mol/L，固液比為10-20g/L。
7、 按權利要求4或5所述的過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極 的製備方法，其特徵在於步驟(5)中所述的有機弱酸為醋酸或檸檬酸或丙酸， 濃度為0. 5-2. 0 mol/L。
8、 一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極用於強酸溶液分析。
全文摘要
本發明涉及一種過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極及其製備方法和應用，屬於生物傳感器領域。本發明的過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白修飾電極包括過渡金屬取代的層狀氧化鈦固定蛋白層和電極層，其中蛋白質分子固定於過渡金屬取代的層狀氧化鈦納米片之間，形成類似三明治結構，其組成式為Hb/Ti2-yMyO4，Hb為蛋白質分子，y為摻雜實際組分，0.25≤y≤0.6，M為Co，Ni，Cu，Zn，Mn(Ш)，Fe(Ш)。本發明工藝簡單，所需生產設備簡單，易於實現工業化生產，並可在強酸溶液中使用。
文檔編號G01N27/327GK101281157SQ20081003688
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者吳益華, 高秋明 申請人:中國科學院上海矽酸鹽研究所