用於轉基因青鱂魚的基因片段的製作方法
2023-09-19 18:04:55 1
專利名稱：用於轉基因青鱂魚的基因片段的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的核酸片段。
背景技術：
觀賞用魚是漁產業之一環並具有全球性市場。因此，利用DNA重組及轉基因技術，藉以改變觀賞用魚的表型具有巨大市場價值。
轉基因魚研究是利用基因由異源及同源的調節元件所驅動，並由組成或組織特異性表達基因所產生的。調控元件包括抗凍蛋白(antifreezeprotein)、鼠金屬硫蛋白(metallothionein)、雞的δ-結晶(δ-crystalline)、鯉魚β肌動蛋白(carp β-actin)、鮭魚組蛋白H3(histone H3)及鯉魚α球蛋白(α-globin)的基因等等。然而，於轉基因魚中使用這些DNA元件有很大的缺點，包括表達效率低及轉基因的鑲嵌型(mosaic)表達。
將青鱂魚(mekada)β-肌動蛋白啟動子所驅動的lac報導基因顯微注射入青鱂魚卵後，雖然表達很少且具有高度的鑲嵌性，但還是會導致lacZ基因短暫的表達，甚至在第一子代也會表達出來。Hamada等人將綠色螢光蛋白與青鱂魚β-肌動蛋白啟動子融合後，顯微注射至魚卵所產生出來的青鱂魚胚胎的報告中也有類似的結果。(Hamada et al.，1998，Mol Marine Biol Biotechnol 7173-180)。
不幸的，傳統轉基因技術只能產生出釋放鑲嵌或微弱螢光之轉基因魚。這些轉基因魚螢光僅能於螢光顯微鏡下以特定波長光源觀察。基於此非實用性及種種困難，這些螢光轉基因魚因消費者接受度不佳難以達到商業上的成功。
Chi-Yuan Chou等人發表了一個兩端連接反向末端重複序列，以增加青鱂魚體內轉基因表達效率的DNA構建質粒。轉基因在第0代及之後兩代的表達都呈一致性(Chi-Yuan Chou et al.，2001，TransgenicResearch 10303-315)。雖然一種轉基因綠色螢光青鱂魚已有文獻發表，而產生其它的螢光基因(如紅色螢光蛋白)的不同類轉基因魚之方法及條件皆不相同，且因轉基因技術之基因構建，基因表達，基因遺傳的策略不同與不確定因素，使得吾人不能輕易由現有技術推得。
發明內容
為克服現有技術的轉基因螢光魚缺點，本發明徹底並謹慎地在設計中使用概念性突破。一pβ-DsRed2-1-ITR質粒構建體可以經由將青鱂魚的β-肌動蛋白啟動子導入pDsRed2-1-ITR(Clontech)表達質粒產生。適量的該pβ-DsRed2-1-ITR質粒接著以顯微注射導入青鱂魚一細胞時期受精卵細胞質中。注射後之卵細胞以子代是否於全身肌肉表達螢光篩選之。取會表達螢光之子代轉基因螢光魚進行繁殖。
雖然現有技術已揭露產生轉基因綠色螢光魚之方法，然而本發明之轉基因紅色螢光魚之技術與以往顯有不同。在質粒構建方面，第一代轉基因綠色螢光蛋白質粒，其β-肌動蛋白啟動子序列由質粒pOBA-109經限制酶SalI與NcoI作用後，回收的4kb DNA片段與質粒pEGFPITR經限制酶SalI與NcoI作用後，回收的4.7kb DNA片段接合反應作用而成。而第二代轉基因紅色螢光蛋白質粒，由於可運用之限制酶切割位置較少，因此其接合方式更為複雜困難。首先，其β-肌動蛋白啟動子序列由質粒pOBA-109經限制酶EcoRI與NcoI作用後，進行補入突出的5′端的處理，再進一步回收4kb DNA片段，而質粒pDsRedITR經限制酶SalI與BamHI作用後，進行補入突出的5′端的處理，接著進行DNA之5′端脫磷酸作用(Dephosphorylation)，再將4.7kb DNA片段回收。最後將先前所述之含β-肌動蛋白啟動子序列的DNA與4.7kb DNA片段經接合反應作用而成。
在受精卵顯微注射方面，第一代轉基因綠色螢光蛋白所選用的毛細管針頭孔徑為4-5μm，並在注射針管壁做矽化處理，在100倍放大倍率下，將DNA(10ng/ml)注入受精卵的細胞質中，所注射的溶液體積約20-30pl，顯微注射後的存活率為85％-90％。在第二代轉基因紅色螢光蛋白所選用的毛細管針頭孔徑為1.6-2.5μm，為DNA溶液不會堵塞的最小孔徑，所注射的溶液體積約20-30pl在注射管壁不做矽化處理，顯微注射後的存活率為90％-95％，約提高5％。
由於紅色螢光蛋白比率色螢光蛋白表達較為穩定，綠色螢光蛋白在轉基因青鱂魚純品系的表達上會有偏向黃綠色與橘綠色，在紅色螢光蛋白轉基因青鱂魚不會有色差的情形，相形之下紅色螢光蛋白對青鱂魚胚胎發育似乎具有毒性，在所篩選得到的紅色螢光青鱂魚皆為雜合子(heterozygote)。
此外，在轉基因魚的孵化上，紅色轉基因魚亦有明顯較綠色轉基因魚為高的困難度。可見下表
由單次產卵數、平均產卵數、產卵率、壞卵率、孵化率、養成率、平均體長、體重、卵重等，都明顯發現純合子的紅TK-1都與綠色TK-1有很大的差異。紅TK-1的純合子的活存率及體長、體重都較綠TK-1明顯為低，所以兩者間有明顯的不同之處。
本發明中之「青鱂魚」一詞是指來自但非限定於以下之Adrianichthyidae(稻米魚)諸如Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryziasnigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryzias melastigma，O.curvinotus，O.celebensis，X.oophorus，及X.saracinorum。優選的青鱂魚來自但非限定於以下之青鱂科(Oryziinae)品種諸如Oryzias javanicus，Oryziaslatipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryziasmatanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryzias melastigma，O.curvinotus，O.celebensis。最佳的青鱂魚為Oryzias latipes。
本發明提供一基因片段，其中包括(1)一青鱂魚β-肌動蛋白啟動子；(2)一螢光基因；及(3)腺相關病毒的反向末端重複序列(ITR)。
本發明優選的片段為 本發明亦提供一質粒，其中該質粒包含本發明的基因片段。
本發明紅色螢光基因可由BD Bioscience Clontech購買。在本發明實施中，pDsRed2-1當成紅色螢光基因之來源。pDsRed2-1編碼之DsRed2，其是一DsRed之變體，設計來達到更快速的成熟及降低非特異性聚集。DsRed2包含一系列對應人類密碼子優先使用之沉默(silent)鹼基對改變供哺乳動物細胞之高度表達。在哺乳動物細胞培養中，當DsRed2結構性表達時，散發紅色細胞可於轉染後24小時內以螢光顯微鏡觀察。大型不可溶之蛋白聚集通常可在表達DsRed1系統之細菌及哺乳動物細胞中觀察到，而表達DsRed2之系統則顯著地減少。成熟快速，更穩定的紅色螢光蛋白亦可讓宿主細胞良好地適應；以DsRed2轉染的哺乳類培養細胞未顯示明顯降低生存能力跡象—在測試過的一些細胞株之中，表達DsRed2的細胞與未經轉染對照組顯示相同的型態(如黏附，折光)及生長特性。pDsRed2-1是一不具啟動子的DsRed2載體，可用來監測插入多重克隆部位(MCS)的不同啟動子及啟動子/增強子組合的轉錄。
本發明方法提供5種對現有方法之改進1.本發明核酸序列片段之主體系如pDsRed2-1-ITR之質粒構建體，該質粒可易於商業上取得。
2.本發明核酸序列片段使青鱂魚能由全身性骨胳肌遍布地散發出螢光。
3.本發明方法，包含用顯微注射將轉基因構建體入受精卵，確保轉基因青鱂魚以較高比率高品質地在全身性骨骼肌散發螢光。
4.異質轉基因魚可穩定地將轉基因遺傳至下一代。因此可用自然培育方法維持轉基因數量與減少育種開銷。
5.轉基因青鱂魚的螢光，散發於其全身性骨胳肌，可以輕易的以肉眼所見。紅色螢光更能在較短波長光源下被加強，為觀賞魚提供較高的觀賞價值。
綜上所述，本發明提供一種產生具全身性螢光轉基因青鱂魚的方法，包括
(a)構建一質粒，其中包含反向末端重複序列(ITR)，CMV啟動子，一螢光基因，S40 polyA及ITR；(b)以青鱂魚β-肌動蛋白啟動子置換CMV啟動子，產生一新的質粒構建體；(c)以NotI將新的質粒構建體線性化；(d)將適量線性化之質粒構建體以顯微注射入受孕青鱂魚卵；(e)篩選帶螢光之卵；(f)孵育篩選卵使成熟並與野生種交配；及(g)篩選包含轉基因之子代並產生全身性螢光青鱂魚。
因此，優選之線性化構建體選自於 用於本發明方法中之優選螢光基因為來自pDsRed2-1之紅色螢光基因。
在本發明產生轉基因青鱂魚的方法中，注射入受孕卵中之適量NotI-線性化質粒構建體足以將轉基因導入青鱂魚之生殖細胞。注射入受孕卵中之線性化質粒構建體之優選量為1-10nl。注射入受孕卵中之線性化質粒構建體之最佳量為2-3nl。
本發明亦對轉基因青鱂魚提供以本發明方法產生的全身性螢光。優選的青鱂魚具有全身性紅色螢光。其它顏色的螢光魚如藍色螢光蛋白(BFP)基因，黃色螢光蛋白(YFP)基因或青色螢光蛋白(CFP)基因亦可以相同技術產生。
圖1顯示來自pOBA-109與pDsRed2-1-ITR的pβ-DsRed2-1-ITR質粒構建體。
圖2顯示產生轉基因青鱂魚之程序。
圖3照片顯示一來自F2代(取自以本發明的pβ-DsRed2-1-ITR核酸片段成功轉染種魚)的3個月齡轉基因青鱂魚，證實其紅色螢光之表達。
圖4顯示線性化質粒構建體pβ-DsRed2-1-ITR(8.7kb)。
具體實施例方式
以下實施例屬非限制性並僅作為在本發明中各種可能及特色之代表。
產生具紅色螢光青鱂魚的方法1.商業上可獲得之質粒構建體，pDsRed2-1(Clontech)，用於製備表達載體。
2.DsRed片段來自於pDsRED2-1質粒。CMV啟動子及兩個腺相關病毒之反向末端重複序列(ITR)被與DsRed片段連接，如圖1製備質粒構建體pDsRed2-1-ITR所描述之。pDsRed2-1-ITR質粒構建體具較佳的表達穩定性。
3.產生新質粒構建體pβ-DsRed2-1-ITR
如圖1所示，青鱂魚β-肌動蛋白啟動子通過以NcoI與EcoRI限制酶切割質粒構建體pOBA-109獲得。先使用NcoI，填充末端，接著以EcoRI切割產生一4kb片段。
如圖1所示，CMV啟動子由限制酶BamHI及SalI自構建體pDsRed2-1-ITR切下。BamHI及SalI之切割產生一4.7kb片段。接著，青鱂魚β-肌動蛋白啟動子被插入位於pDsRed2-1-ITR質粒構建體中，已切去之原CMV啟動子處。產生之質粒構建體具有兩段145bp腺相關病毒之反向末端重複序列(ITR)。其中一ITR位於SV40 poly A之3』端，另一則位於β-肌動蛋白啟動子之5』端。
如圖1所示，產生之質粒構建體pβ-DsRed2-1-ITR其全長為8.7kb。pβ-DsRed2-1-ITR包括(1)青鱂魚β-肌動蛋白啟動子(使全身遍布性表達)；(2)珊瑚紅色螢光蛋白；(3)腺相關病毒反向末端重複序列；及(4)pUC質粒構建體基礎。
質粒構建體pβ-DsRed2-1-ITR被轉化至大腸桿菌5α。
4.質粒構建體之線性化如圖1所示，適量之pβ-DsRed2-1-ITR質粒以適量限制酶NotI切割。一小量經切割之產品以瓊脂糖凝膠電泳分析並確認其線性。如預期，片段長度為8.7kb。接著，經切割之DNA產物以含酚∶氯仿(1∶1)溶液萃取，用酒精沉澱，風乾後以10μg/ml濃度溶於PBS緩衝液，使用於後續之細胞質顯微注射。
5.細胞質顯微注射
a.受精卵之收集於夜間11時實施顯微注射步驟及培養箱進入黑暗期之前，以分離網處理魚的分隔與收集，次日早晨在日光期開始後，依圖2步驟1描述，每15-20分鐘收集魚卵。在每一次的顯微注射中，注射30-40顆卵；依圖2步驟3，每次實驗注射250-300顆卵。
b.顯微注射線性化之構建體經定量並依需要濃度溶於含酚紅指示劑之5倍PBS緩衝液。以青鱂魚用顯微注射器(Drummond)之微毛細管(微毛細管注射針頭寬度範圍從2到10μm)拾起DNA。當微針頭伸入細胞質內，以2-3nl之DNA注射之。
c.孵育受精卵經注射之卵以無菌溶液溼潤，培養於培養箱，溫度設定於26℃。24小時後，螢光可於發育中的胚胎觀察到，如圖2第4步驟所示。
6.螢光顯微鏡觀察經注射之胚胎置於一含水培養皿中。紅色螢光之分布與強度於螢光顯微鏡下觀察(Leica MZ-12；螢光系統光源Hg 100W；主發散波長558nm，主吸收波長583nm，濾鏡組RFP-Plus；照相系統MPS60)。
7.轉基因之胚源傳送如圖2所示，源自顯微注射pβ-DsRed2-1-ITR片段之卵的紅色螢光青鱂魚與野生型配種，獲得能表達一致性螢光的子代。表達螢光之F1代再度與野生型配種以獲得F2子代(圖3)，其全部能表達紅色螢光，且能容易地與不表達螢光的魚區別。轉基因青鱂魚與野生型青鱂魚的不同在藍色光下更容易區別。
本發明之DNA片段可經修改以令其攜帶其它的螢光基因，因此能產生具不同螢光的魚。
其它包括他種螢光基因之轉基因構建體可以與紅色螢光一同導入青鱂魚卵中使魚具有不同的體色。
本發明之青鱂魚可以廣泛應用於醫學研究及生命科學中其它領域的研究，例如，細胞融合，克隆，體細胞核轉基因技術，細胞運動性，細胞目標，及胚胎發育研究。
本發明已詳細說明及舉例，以使本領域人員能施行並加以利用，唯任何替代、變更與修改均應在不脫離本發明之精神與範圍內進行。
本領域人員很快便會發現到本發明很容易便可達到目標，並得到本文中所述之結果及優點。細胞株、胚胎、動物及其產生過程和方法僅為示範性之優選實施例代表，並非欲限制發明之範圍。本領域人員將會想到對本發明進行修改及其它用途，唯這些修改均應包含在本發明的精神內並僅限於申請專利範圍內。
本領域人員顯然很容易便可在不脫離本發明之精神與範圍內對本發明進行變更與修改。
本說明書所述之所有專利及發表均為此領域中和發明有關之一般技術。本說明書所述及之專利與發表文章可說明本領域人員具有的技術程度。
本文所述之發明圖式可在沒有任何要件或限制下施行，而非特定本文所揭露者。所使用之名詞及表達僅為說明之用，而非用於限制，且非欲利用這些名詞及表達來排除任何所示及所述或其部分特徵之等價物，而是認為各種變更修改仍可能在發明申請專利範圍內。因此，應該了解雖然已利用優選實施例及選擇性的特徵來具體揭露本發明，但本領域人員可能會根據此中所揭露之構想加以修改及變更，唯這些修改與變更應當在本發明所附申請專利請求項所定義之範圍內。
其它實施例在下列的權利要求書中提到。
權利要求
1.一基因片段，其包括(1)一青鱂魚β-肌動蛋白啟動子；(2)一螢光基因；及(3)腺相關病毒的反向末端重複序列(ITR)。
2.權利要求1的基因片段，其為如圖4所示的8.7kb的pβ-DsRed2-1-ITR。
3.權利要求1的基因片段，其中螢光基因選自藍色螢光蛋白(BFP)基因、黃色螢光蛋白(YFP)基因或青色螢光蛋白(CFP)基因。
4.一包含權利要求1的基因片段的質粒。
5.一包含權利要求2的基因片段的質粒。
6.一種產生全身性螢光青鱂魚的方法，包含(a)構建一質粒，其中包含反向末端重複序列(ITR)、CMV啟動子、一螢光基因、S40 poly A及ITR；(b)以青鱂魚β-肌動蛋白啟動子置換CMV啟動子，產生一新的質粒構建體；(c)以NotI將新的質粒構建體線性化；(d)將適量線性化的質粒構建體以顯微注射入受精青鱂魚卵；(e)篩選帶螢光的卵；(f)孵育篩選卵使成熟並與野生種交配；及(g)篩選包含轉基因的子代並產生全身性螢光青鱂魚。
7.權利要求6的方法，其中線性化質粒構建體是如圖4所示的8.7kb的pβ-DsRed2-1-ITR。
8.權利要求6的方法，其中螢光基因為來自pDsRed2-1的紅色螢光基因。
9.權利要求6的方法，其中，注射入受精卵中的適量NotI-線性化質粒構建體足以將轉基因導入青鱂魚的生殖細胞。
10.權利要求9的方法，其中注射入受精卵中的適量線性化質粒構建體為2-3nl。
11.權利要求6的方法，其中螢光基因選自藍色螢光蛋白(BFP)基因、黃色螢光蛋白(YFP)基因或青色螢光蛋白(CFP)基因。
12.一種全身性螢光青鱂魚，其由權利要求6的方法產生。
13.權利要求12的青鱂魚，其中該青鱂魚具有全身性紅色螢光。
14.權利要求12的青鱂魚，其中該青鱂魚來自Adrianichthyidae。
15.權利要求12的青鱂魚，其中該青鱂魚選自Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryziasmelastigma，O.curvinotus，O.celebensis，X.oophorus，或X.saracinorum。
16.權利要求15的青鱂魚，其中該青鱂魚選自Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryziasmelastigma，O.curvinotus或O.celebensis。
17.權利要求16的青鱂魚，其中該青鱂魚為Oryzias latipes。
18.權利要求12的青鱂魚，其擁有全身性藍色螢光。
19.權利要求12的青鱂魚，其擁有全身性黃色螢光。
20.權利要求12的青鱂魚，其擁有全身性青色螢光。
全文摘要
本發明涉及一核酸片段，其中包括(1)一青鱂魚β－肌動蛋白啟動子；(2)一螢光基因；及(3)腺相關病毒的反向末端重複序列(ITR)。本發明還涉及一質粒，其中包括本發明的核酸片段。
文檔編號C07K14/435GK1664099SQ200410094708
公開日2005年9月7日 申請日期2004年11月12日 優先權日2004年1月8日
發明者蔡懷楨 申請人:邰港科技股份有限公司, 蔡懷楨