基於納米金標記和酪胺信號放大技術測定脫落酸的方法

2023-09-20 17:10:00 2

基於納米金標記和酪胺信號放大技術測定脫落酸的方法
【專利摘要】基於納米金標記和酪胺信號放大技術測定脫落酸的方法。以生物素化脫落酸抗體修飾納米金為標記物，以磁珠為載體，結合酪胺信號放大技術和PIP-HRP-H2O2化學發光體系高靈敏度測定脫落酸的方法。屬於化學發光領域。其原理是用抗體修飾磁珠捕獲目標物脫落酸；用生物素化脫落酸抗體修飾納米金，並以其為標記物；然後利用酪胺信號放大技術在磁珠表面聚集鏈黴親和素-HRP；再利用PIP-HRP-H2O2化學發光體系實現對目標物的測定。由於通過酪胺信號放大在磁珠表面有大量的鏈黴親和素-HRP形成，再利用高靈敏度化學發光檢測體系，實現了脫落酸的高靈敏度測定。方法具有簡單、成本低、靈敏度高的優勢。
【專利說明】基於納米金標記和酪胺信號放大技術測定脫落酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於化學發光【技術領域】，涉及以納米金為標記物和酪胺信號放大技術建立的分析方法。具體涉及一種植物激素脫落酸測定的方法。
【背景技術】
[0002]脫落酸(abscisic acid, ΑΒΑ)是植物體內一種重要的激素，由類胡蘿蔔素降解形成，有阻遏赤黴酸及細胞分裂素促進生長的作用；與葉子的衰老、果實的脫落等有關。雖然含量甚微，但對調節植物體的生長、成熟和衰老有著重要的作用。準確測定這種植物激素的含量，研究其變化規律，對於探索果實成熟及貯藏保鮮具有重要意義。植物激素測定的傳統方法主要有色譜法及聯用技術[Hou SJ, Zhu J, DingMY, Lv GH.Simultaneousdetermination of gibberellic acid, indole-3-acetic acid and abscisic acid inwheat extracts by solid—phase extraction andliquid chromatography-electrospraytandem mass spectrometry.Talantaj 2008，76:798]、免疫學方法[Ferreiraa WDj KerbauybGBj Krausb JE，Pescadorc Rj Suzuki RM.Thidiazuron influences the endogenous levelsof cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium.JPlant Phys，2006，163:1126]、光譜法、電化學方法[Carretero AS, Cruces-Bianco C，PenaMS，Ramirez SC，Gutierrez AF.Determination of phytohormones of environmentalimpact by capillary zone electrophoresis.J Agric Food Chemj 2004, 52:1419 ；LiuX，Ma L，Lin YWj Lu YT.Determination of abscisic acid by capillary electrophoresiswith laser-1nduced fluorescence detection.J Chromatogr A，2003，1021:209 ;LiJ，Xiao LT，Zeng GM，Huang GH，Shen GLj Yu RQ.1mmunosensor for rapid detection ofgibberellin acid in the rice grain.J Agric Food Chem，2005，53:1348]等。目前測定脫落酸的方法主要有HPLC法[劉長江，劉暘暘，李書倩，張博，辛廣.HPLC法測定軟棗獼猴桃中內源激素脫落酸含量.食品研究與開發.2012，33:162;孫崇臻，王超，蔡子哲，陳沿廷，吳希陽.高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸.食品科學，2013，34:281]、ELASE法[周振華，楚霞，沈國勵，俞汝勤.間接競爭ELISA方法用於脫落酸的檢測.化學傳感器.2009，29: 29]等。
[0003]但是，這些方法的各有其缺點，本發明利用納米金為標記物和磁珠為載體，以酪胺信號放大技術，實現植物激素脫落酸的測定，具有方法簡單、成本低、靈敏度高的優點。

【發明內容】

[0004]本發明目的是提供一種測定脫落酸的方法，以納米金為標記物、磁珠為載體，結合酪胺信號放大技術和PIP (對碘苯酚)-HRP-H2O2化學發光體系，實現脫落酸的測定。
[0005]技術方案
[0006]一種基於納米金標記和酪胺信號放大技術測定脫落酸的方法。其特徵在於用納米金為標記物，羧基化磁珠為載體，再以酪胺信號放大技術和PIP-HRP-H2O2化學發光體系，實現脫落酸的測定。測定步驟如下:
[0007](I)納米金的製備。將用於製備納米金的玻璃儀器及聚四氟乙烯攪拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸餾水衝洗後烘乾備用。再向500mL三口燒瓶中加入250mL水，再加入
2.5mLl%HAuCl4，在電爐上加熱至沸騰後，快速加入4.4mLl%檸檬酸鈉。溶液在2~3分鐘內其顏色由淡黃色逐漸變為酒紅色，然後繼續保持沸10~15分鐘，移走熱源，在室溫下繼續攪拌至冷卻，定容至200mL，置4°C冰箱冷藏備用。
[0008](2)生物素化脫落酸抗體的製備。首先用lmol/LpH9.2的NaHCO3溶液將脫落酸抗體稀釋為lmg/mL ;用DMF將Bio-NHS配製成50mg/mL的溶液；然後按Bio-HNS與脫落酸抗體質量比1:7的比例將其混合，室溫下攪拌混勻反應4h，即得生物素化脫落酸抗體。
[0009](3)抗體修飾納米金的製備。在2mL的小試管中加入150 μ L, IO^7M的巰基丙酸，再加入ImL0.1M的EDC，活化30分鐘。另取一個5mL的小試管，加入2mL納米金，ImL咪唑緩衝液(0.1Μ，ρΗ6.8)，活化30分鐘。將上述兩溶液混合反應12小時，磁性分離，棄上清液，再用磷酸緩衝溶液洗三次，定容至2mL。將10 μ g生物素化IgG、3 μ g生物素化脫落酸抗體加入上述溶液中，混合反應12小時，得抗體修飾納米金。
[0010](4)抗體修飾磁珠的製備。取30 μ L磁珠於1.5mL小試管中，用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，加入200 μ L咪唑-HCl緩衝溶液(0.1Μ)和100 μ L0.2Μ的EDC溶液，在37°C下反應40分鐘。然後用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次,最後加入200 μ L磷酸緩衝溶液搖勻。再加入1(^8抗體，371:振蕩孵育過夜。最後，用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，磁性分離後，分散於200 μ L磷酸緩衝溶液中。再加入200 μ L0.lg/mL的BSA，並置於37°C下反應40分鐘，再用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，磁性分離後，分散於200 μ L磷酸緩衝溶液中，得抗體修飾磁珠。4V冰箱保存備用。
[0011 ] (5)生物素化酪胺的製備。分別取10.0mgBio-NHS和酪胺-HCl，用DMF溶解，分別配製成10mg/mL的溶液;在配置的酪胺-HCl溶液中`加入三乙胺10 μ L，室溫放置4小時後，取17.3 μ L，與60.2 μ L的Bio-NHS溶液混合，室溫反應4小時，即得生物素化酪胺，4°C冰箱保存備。
[0012](6)脫落酸的測定。取脫落酸標準溶液或樣品溶液10 μ L加入50 μ L的抗體修飾磁珠溶液中，37°C下反應30分鐘。然後加入抗體修飾納米金20μ L，37°C下反應30分鐘，磁性分離，並用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次後分散於80 μ L磷酸緩衝溶液中。然後加入40 μ L的生物素化酪胺溶液，再加入10 μ L體積分數為0.5%的過氧化氫溶液，在37°C避光振蕩孵育30分鐘，用含0.05% (體積分數)吐溫-20的磷酸緩衝液洗滌三次。然後再加入40 μ L的鏈黴親和素-HRP，37°C振蕩孵育30分鐘，用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次後分散於80 μ L磷酸緩衝溶液中。然後進行化學發光測定，根據標準溶液濃度和化學發光信號關係作圖得標準曲線；根據所測定樣品溶液的化學發光信號對樣品中脫落酸含量進行定量。
[0013](7)樣品分析，將微納米級微透析探針插入模式植物內部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣，在通道下遊待測組分按步驟(6)方法進行實驗，根據化學發光信號和步驟(6)所得標準曲線可以獲取植物激素脫落酸的含量。
[0014]本發明的化學試劑優選分析純試劑，所有溶液均用二次蒸餾水配置。
[0015]本發明的磷酸緩衝溶液(0.2ΜρΗ7.4)配製方法:取濃度為35.61g/L的Na2HPO4.2H20 溶液 81mL，濃度為 27.6g/L 的 NaH2PO4.H2O 溶液 19mL 混合即得。
[0016]咪唑-HCl緩衝液配製方法:取咪唑6.8g，氯化鈉11.7g，加於500mL 二次蒸餾水中，加0.lmol/L鹽酸186mL,調pH至6.8,最後加二次蒸懼水至I升即得。
[0017]本發明的化學發光測定選用MP1-E型化學發光分析系統(西安瑞邁分析儀器有限公司)。
[0018]本發明的振蕩孵育選用THZ-82A氣浴恆溫振蕩器(全壇市醫療儀器廠)。
[0019]本發明的離心機選用Anke-TGL_16C飛鴿牌高速離心機(上海市安亭科學儀器廠)。
[0020]本發明的pH測量選用PHS-3D型酸度計(上海雷磁儀器廠)。
[0021]本發明的磁性分離選用55002型磁性分離架(天津市倍思樂色譜技術開發中心)
[0022]本發明的顯著效果
[0023]本發明研究了不同濃度脫落酸與發光強度之間的關係，得到了檢測脫落酸的標準曲線，線性範圍及線性方程。
[0024]當脫落酸的濃度在1.0ng/mL-3000.0ng/mL之間時，隨著脫落酸濃度的變化,化學發光強度有明顯變化。經計算得到檢測脫落酸的線性方程為Ia=2.13C+26.62 (Ia是化學發光強度；C是脫落酸的濃度，ng/mL ；η=12, η表示同一濃度測定次數，R2=0.9897)。檢測限是0.3ng/mL(3 σ )。該測定方法的精密度通過對濃度為7.0ng/mL的脫落酸進行11次平行測定而計算得出，相對標準偏差分別為3.8%，表明本發明的測定方法有較好的重現性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1.酪胺信號放大技術測定脫落酸原理圖
[0026]圖2.脫落酸標準曲線。橫坐標是脫落酸濃度，單位是ng/mL，縱坐標Ia是體系的化學發光強度。
【具體實施方式】
[0027]按照技術方案的步驟(1)至(6)得到脫落酸標準曲線見圖2，其中N-羥基琥珀醯亞胺生物素(Bio-NHS)、辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素(鏈黴親和素-HRP)購於上海生工生物工程技術服務有限公司；氯金酸(HAuCl4),檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)均購於天津市博迪化工有限公司；脫落酸、吐溫-20、咪唑購自國藥化學試劑公司；1_乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、生物素化IgG購自Sigma公司；脫落酸抗體購自盛世中方(北京)生物科技有限公司；巰基丙酸購自天津市博迪化工有限公司；牛血清蛋白(BSA)、二甲基甲醯胺(DMF)購自中國醫藥上海化學試劑公司；酪胺-HCl購自北京化工廠；磁珠(羧基化，粒徑為I~2μπι)購自天津市倍思樂色譜技術開發中心。
[0028]根據發明的方法對脫落酸含量進行了測定，並採用標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為98.5 - 102.6%，測定結果見表1，本發明的方法在脫落酸檢測中具有精密度高的特點。測定時用微納米級微透析探針插入模式植物水稻莖部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣。
[0029]表1.樣品分析測定結果a』b
[0030]
【權利要求】
1.基於納米金標記和酪胺信號放大技術測定脫落酸的方法，其特徵在於以納米金為標記物和磁珠為載體，以酪胺信號放大技術和PIP-HRP-H2O2化學發光體系實現植物激素脫落酸的測定，測定步驟如下: (O納米金的製備:將用於製備納米金的玻璃儀器及聚四氟乙烯攪拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸餾水衝洗後烘乾備用；再向500mL三口燒瓶中加入250mL水，再加入2.5mLl%HAuCl4，在電爐上加熱至沸騰後，快速加入4.4mLl%檸檬酸鈉；溶液顏色由淡黃色逐漸變為酒紅色，然後繼續保持沸10~15分鐘，移走熱源，在室溫下繼續攪拌至冷卻，定容至200mL，置4°C冰箱冷藏備用； (2)生物素化脫落酸抗體的製備:首先用lmol/LpH9.2的NaHCO3溶液將脫落酸抗體稀釋為lmg/mL ;用DMF將Bio-NHS配製成50mg/mL的溶液；然後按Bio-HNS與脫落酸抗體質量比1:7的比例將其混合，室溫下攪拌混勻反應4h，即得生物素化脫落酸抗體； (3)抗體修飾納米金的製備:在2mL的小試管中加入150μ L，10_7Μ的巰基丙酸，再加入lmL、0.1M的EDC，活化30分鐘；另取一個5mL的小試管，加入2mL納米金，ImL咪唑緩衝液(0.1M，pH6.8)，活化30分鐘；將上述兩溶液混合反應12小時，磁性分離，棄上清液，再用磷酸緩衝溶液洗三次，定容至2mL ;然後將10 μ g生物素化IgG、3 μ g生物素化脫落酸抗體加入上述溶液中，混合反應12小時,得抗體修飾納米金； (4)抗體修飾磁珠的製備:取30μ L磁珠於1.5mL小試管中，用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，加入200 μ L咪唑-HCl緩衝溶液(0.1Μ)和100 μ L0.2Μ的EDC溶液，在37°C下反應40分鐘；然後用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，最後加入200 μ L磷酸緩衝溶液搖勻；再加入10μ g抗體，37°C孵育過夜；最後，用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，磁性分離後，分散於200 μ L磷酸緩衝溶液中；再加入200 μ L0.lg/mL的BSA，並置於37°C下反應40分鐘，再用200 μ L磷酸緩衝溶液洗滌三次，磁性分離後，分散於200 μ L磷酸緩衝溶液中，得抗體修飾磁珠，4°C冰箱保存備 用； (5)生物素化酪胺的製備:分別取10.0mgBio-NHS和酪胺-HC1，用DMF溶解，分別配製成10mg/mL的溶液；在配置的酪胺-HCl溶液中加入三乙胺10 μ L，室溫放置4小時後取17.3 μ L，與60.2 μ L的Bio-NHS溶液混合，室溫反應4小時，即得生物素化酪胺，4°C冰箱保存備； (6)脫落酸的測定:取不同量的脫落酸標準溶液或樣品溶液加入抗體修飾磁珠溶液中，37°C下反應30分鐘；然後加入抗體修飾納米金，37°C下反應30分鐘，磁性分離，並用磷酸緩衝溶液洗滌三次後分散於磷酸緩衝溶液中；然後加入生物素化酪胺溶液，再加入體積分數為0.5%的過氧化氫溶液，在37°C避光孵育30分鐘，用含0.05% (體積分數)吐溫-20的磷酸緩衝液洗滌三次；然後再加入鏈黴親和素_HRP，37°C孵育30分鐘，用磷酸緩衝溶液洗滌三次後分散於磷酸緩衝溶液中；然後進行化學發光測定，根據標準溶液濃度和化學發光信號關係作圖得標準曲線；根據所測定樣品溶液的化學發光信號對樣品中脫落酸含量進行定量; (7 )樣品分析:將微納米級微透析探針插入模式植物內部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣，在通道下遊待測組分按步驟(6)方法進行實驗，根據化學發光信號和步驟(6)所得標準曲線可以獲取植物激素脫落酸的含量。
2.根據權利要求1測定脫落酸的方法，其特徵在於所述化學試劑為分析純試劑，所有溶液均用二次蒸餾水配置。
3.根據權利要求1測定脫落酸的方法，其特徵在於所述磷酸緩衝液濃度為0.2M，ρΗ7.4，配製方法:取濃度為35.61g/L的Na2HPO4.2H20溶液8ImL,濃度為27.6g/L的NaH2PO4.H2O溶液19mL混合即得。
4.根據權利要求1的測定脫落酸的方法，其特徵在於所述咪唑-HCl緩衝液配製方法:取咪唑6.8g,氯化鈉11.7g,加於5OOmL 二次蒸懼水中，加0.lmol/L鹽酸186mL,調pH至6.8,最後加二次蒸懼水至I升。
5.根據權利要求1的測定脫落酸的方法，其特徵為以PIP-HRP-H2O2化學發光體系對化學發光進行測定。·
【文檔編號】G01N21/76GK103592291SQ201310467561
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月9日 優先權日:2013年10月9日
【發明者】混旭, 康泰, 謝國亮 申請人:青島科技大學