一種用於以hrp為酶促反應的化學發光底物液的製作方法

2023-09-21 00:16:15

專利名稱：一種用於以hrp為酶促反應的化學發光底物液的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶聯免疫分析領域，可應用於HRP為酶促反應的檢測體系，如免疫檢測體系、螢光檢測體系等。
背景技術：
化學發光免疫分析技術在免疫檢測中已經得到了廣泛的推廣，近幾十個品種在普遍應用，其範圍從普通的臨床檢驗品種到各種腫瘤標誌物篩查、細胞因子、藥物等等，不僅在臨床檢驗，而且在藥物學、環境學、食品安全以及預防醫學都表現出了廣闊的應用前景。 同時，化學發光免疫分析技術的簡便、快捷、靈敏等優點使在基層對疾病的普查、診斷和療效考核都具有重要的價值。在化學發光免疫分析中，通過免疫反應結合在微孔板內的酶結合物的量直接反應了免疫結合的效率，該效率在標記抗體(抗原)和包被抗體(抗原)均過量的條件下，完全取決於待測的抗原(抗體)的濃度。由此而引起的發光信號強度(RLU)也就直接揭示了待測抗原(抗體)濃度的變化。現有發光底物有效期短、本底高、不穩定。發光底物的配方決定底物的這些特性， 我們主要對發光底物配方進行了研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種反應時間短、檢測平臺期長、穩定性好的底物系統，即一種化學發光底物液。本發明的化學發光底物液主要由發光底物液A和發光底物液B組成；所述發光底物液A包括發光劑魯米諾和增強劑對碘苯酚；所述發光底物液B包括氧化劑過氧化脲。具體地，所述發光底物液A含有如下組分魯米諾0. 08-0. 12mg/ml對碘苯酚2. 8-3. 2mg/ml甘氨酸0.02-0.04%牛血清白蛋白0.008-0.012%。優選地，所述發光底物液A含有如下組分魯米諾0. lmg/ml對碘苯酚3mg/ml甘氨酸0.03%牛血清白蛋白 0.01%。所述發光底物液A還含有緩衝系統，所述緩衝系統選自0.05M磷酸鹽緩衝液、 0. 05M Tris-HCl緩衝液和0. 2M硼酸鹽緩衝液中的一種，pH8. 3-8. 9 ；優選地，所述緩衝系統為0. 2M硼酸鹽緩衝液，ρΗ8· 6。具體地，所述發光底物液B含有如下組分


過氧化脲0. 08-0. 12mg/ml
苯甲酸鈉0.01-0.03%。
優選地，所述發光底物液B含有如下組分 過氧化脲0. lmg/ml
苯甲酸鈉0.02%。
所述發光底物液B還含有緩衝系統，所述緩衝系統選自0. 05M磷酸鹽緩衝液、 0. 05M Tris-HCl緩衝液和0. 2M硼酸鹽緩衝液中的一種，pH8. 3-8. 9 ；優選地，所述緩衝系統為0. 2M硼酸鹽緩衝液，ρΗ8· 6。本發明的化學發光底物液可以用於以HRP為酶促反應的檢測系統。使用時，發光底物液A與發光底物液B的體積比為2-3 3-2;優選地，發光底物液A與發光底物液B的體積比為1 1。在一個優選的實施方案中，本發明是針對辣根過氧化物酶(HRP)的魯米諾化學發光體系(反應原理見下式)。
O
H2O2 +
^nAnh οη.
I I OH ( ι NH, ONH
CO0
光 (425nm)檢測系統是由發光底物液A和發光底物液B組成。發光底物液A含有發光劑魯米諾和增強劑對碘苯酚，底物液B中含有氧化劑過氧化脲。底物的穩定性、靈敏度以及檢測方式決定了是否有利於臨床免疫分析。以此目的為研究方向，發明人對化學發光底物液的緩衝體系，主要原料的濃度，以及配方進行了研究和優化，較目前商品化的底物有明顯的改進。主要體現在反應時間短、檢測平臺期長、穩定性好等性能上。緩衝體系的選擇及優化分別對磷酸鹽、Tris-HCl、硼酸鹽等緩衝系統進行了穩定性、靈敏度等性能測試，根據測試結果優選PH8. 6的硼酸鹽緩衝液。其配製方法為配製 0. 05M硼砂溶液和0. 2M硼酸溶液，然後按11:9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合後即得pH8. 6硼酸鹽緩衝液。不同增強劑、穩定劑的選擇及優化對碘苯酚、過硼酸鈉、甘氨酸、牛血清白蛋白等多種增強劑和穩定劑等物質對檢測結果的影響，並對其使用濃度進行了優化；然後進行穩定性、靈敏度等性能測試，最終確定包括增強劑、穩定劑(甘氨酸、牛血清白蛋白)等物質在內的發光底物液A和發光底物液B優選的和最優選的組分及其濃度配比。主要原料的濃度優化對魯米諾和過氧化脲分別進行實驗設計，然後按設計中的濃度配製工作液，再進行性能測試，最終確定了發光底物液A中魯米諾的濃度為 0. 08-0. 12mg/ml，最優濃度為0. lmg/ml ；發光底物液B中過氧化脲的濃度為0. 08-0. 12mg/ ml，最優濃度為0. lmg/ml。性能測試分別進行了酶促發光反應動力學研究、反應溫度研究、靈敏度、穩定性等研究。本發明研究得到的化學發光底物液，其有效期達到12個月以上，靈敏度達到 10_18mOl，有效延長反應平臺期(一般會延長5到20分鐘，不同的酶濃度，其反應速度不一致)。本發明的化學發光底物液主要應用於以HRP為酶促反應的檢測體系，如免疫檢測體系、螢光檢測體系等。在免疫診斷體系中，該發光底物可以增加試劑盒靈敏度、試劑盒的有效期和檢查的線性範圍(光度法常見的有效吸光度範圍在0 2. 0之間；化學發光法檢測的發光信號強度(RLU)受檢測儀器的限制；本發明所用儀器的可檢測範圍在0 2290萬之間)，並方便用戶使用、快捷的操作。


圖1為酶促發光反應動力學曲線，即RLU隨反應時間變化的曲線圖；圖2為靈敏度梯度曲線，即RLU(S/N)隨HRP濃度變化的曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1緩衝液的配製分別配製0.05M硼砂溶液和0.2M硼酸溶液，然後按11 9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合後即為0. 2M pH8. 6的硼酸鹽緩衝液。室溫靜置待用。發光底物液A的配製分別稱取對碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白 0. Olg，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然後將上述物質加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩衝液中；稱取魯米諾O.oig，先用5ml純水溶解，然後加入到上述緩衝液中，混勻，得發光底物液A，4°C保存。發光底物液B的配製稱取苯甲酸鈉0. 02g,加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩衝液中，然後直接加入過氧化脲0. Olg,溶解，混勻，得發光底物液B，4°C保存。實施例2 緩衝液的配製分別配製0. 05M硼砂溶液和0. 2M硼酸溶液，然後按11:9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合後即為0. 2M pH8. 6的硼酸鹽緩衝液。室溫靜置待用。發光底物液A的配製分別稱取對碘苯酚0J8g、甘氨酸0.02g、牛血清白蛋白 0. 008g，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然後將上述物質加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩衝液中；稱取魯米諾0. 008g，先用5ml純水溶解，然後加入到上述緩衝液中，混勻，得發光底物液A，4°C保存。發光底物液B的配製稱取苯甲酸鈉0. Olg,加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩衝液中，然後直接加入過氧化脲0. 008g,溶解，混勻，得發光底物液B，4°C保存。實施例3緩衝液的配製分別配製0. 05M硼砂溶液和0. 2M硼酸溶液，然後按11:9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合後即為0. 2M pH8. 6的硼酸鹽緩衝液。室溫靜置待用。發光底物液A的配製分別稱取對碘苯酚0.32g、甘氨酸0.04g、牛血清白蛋白 0. 012g，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然後將上述物質加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩衝液中；稱取魯米諾0. 012g，先用5ml純水溶解，然後加入到上述緩衝液中，混勻，得發光底物液A，4°C保存。發光底物液B的配製稱取苯甲酸鈉0. 03g，加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩衝液中，然後直接加入過氧化脲0. 012g，溶解，混勻，得發光底物液B，4°C保存。
實施例4緩衝液的配製0. 05M磷酸鹽緩衝液，pH8. 9。發光底物液A的配製分別稱取對碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白 0. Olg，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然後將上述物質加入到IOOml 0. 05M磷酸鹽緩衝液中；稱取魯米諾0. Olg，先用5ml純水溶解，然後加入到上述緩衝液中，混勻，得發光底物液A，4°C保存。發光底物液B的配製稱取苯甲酸鈉0. 02g，加入到IOOml 0. 05M磷酸鹽緩衝液中，然後直接加入過氧化脲0. Olg,溶解，混勻，得發光底物液B，4°C保存。實施例5緩衝液的配製0. 05M Tris-HCl緩衝液，pH8. 3。發光底物液A的配製分別稱取對碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白O.Olg，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然後將上述物質加入到IOOml 0. 05M Tris-HCl緩衝液中；稱取魯米諾0. Olg，先用5ml純水溶解，然後加入到上述緩衝液中，混勻，得發光底物液A，4°C保存。發光底物液B的配製稱取苯甲酸鈉0. 02g，加入到100ml 0. 05MTris-HCl緩衝液中，然後直接加入過氧化脲0. Olg,溶解，混勻，得發光底物液B，4°C保存。實驗例1酶促發光反應動力學研究1.反應動力學曲線微孔板中加入10μ1 HRP(10ng/ml)，每孔中加入實施例1製備的發光底物液A 50μ1和發光底物液B 50μ1，檢測RLU 30分鐘，繪製反應動力學曲線。實驗結果見圖1。2.反應溫度研究微孔板中分別加入10 μ 1 PBS和10 μ 1 HRP (10ng/ml)，於每孔中加入實施例1製備的發光底物液A 50 μ 1和發光底物液B 50 μ 1，分別在室溫(20°C ^°C)，37°C、45°C下避光反應5分鐘，觀察HRP和PBS的RLU值，來比較不同溫度的影響，以S/N進行評價與分析。實驗結果見表1。表1不同溫度對發光反應的影響
權利要求
1.一種化學發光底物液，其特徵在於，主要由發光底物液A和發光底物液B組成； 其中所述發光底物液A含有如下組分魯米諾0. 08-0. 12mg/ml對碘苯酚2. 8-3. 2mg/ml甘氨酸0.02-0.04%牛血清白蛋白0.008-0.012%;所述發光底物液B含有如下組分 過氧化脲0. 08-0. 12mg/ml苯甲酸鈉0.01-0.03%。
2.根據權利要求1所述的化學發光底物液，其特徵在於，所述發光底物液A含有如下組分魯米諾0. lmg/ml對碘苯酚3mg/ml甘氨酸0.03%牛血清白蛋白0.01%。
3.根據權利要求1或2所述的化學發光底物液，其特徵在於，所述發光底物液A還含有緩衝系統，所述緩衝系統選自0. 05M磷酸鹽緩衝液、0. 05M Tris-HCl緩衝液和0. 2M硼酸鹽緩衝液中的一種，PH8. 3-8.9。
4.根據權利要求3所述的化學發光底物液，其特徵在於，所述緩衝系統為0.2M硼酸鹽緩衝液，PH8. 6。
5.根據權利要求1所述的化學發光底物液，其特徵在於，所述發光底物液B含有如下組分過氧化脲0. lmg/ml苯甲酸鈉0.02%。
6.根據權利要求1或5所述的化學發光底物液，其特徵在於，所述發光底物液B還含有緩衝系統，所述緩衝系統選自0. 05M磷酸鹽緩衝液、0. 05M Tris-HCl緩衝液和0. 2M硼酸鹽緩衝液中的一種，PH8. 3-8.9。
7.根據權利要求6所述的化學發光底物液，其特徵在於，所述緩衝系統為0.2M硼酸鹽緩衝液，PH8. 6。
8.權利要求1-7任一項所述的化學發光底物液在以HRP為酶促反應的檢測系統中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，使用時，發光底物液A與發光底物液B的體積比為2-3 3-2。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於，使用時，發光底物液A與發光底物液B的體積比為1 1。
全文摘要
本發明公開一種化學發光底物液，主要由發光劑魯米諾及增強劑對碘苯酚和氧化劑過氧化脲組成，用於以HRP為酶促反應的檢測體系。該化學發光底物液具有反應時間短、檢測平臺期長、穩定性好等特點，可以增加試劑盒靈敏度、拓寬線性範圍和延長試劑盒的有效期。
文檔編號G01N33/52GK102156121SQ20101062396
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者徐晶, 謝晶, 那鑫 申請人:中生北控生物科技股份有限公司