一種高效快速測定bac末端序列的方法
2023-08-13 23:45:36
一種高效快速測定bac末端序列的方法
【專利摘要】本發明提供了一種高效快速測定BAC末端序列的方法，所述方法包括如下步驟：（1）以超級池為單位，富集每個超級池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，製備成適合新一代測序平臺所需的文庫；（2）在新一代測序平臺上進行測序；（3）通過生物信息學的方法將混合的BAC末端序列回歸到單個克隆：利用序列比對，確定每個BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每個克隆的BAC末端序列。本發明所述方法不僅能快速得到全BAC文庫中所有單個克隆的BAC末端序列，而且極大程度降低了BAC末端測序的成本和時間。
【專利說明】—種高效快速測定BAC末端序列的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種高效快速測定BAC末端序列的方法。
【背景技術】
[0002]基因組BAC (Bacterial Artificial Chromosome,細菌人工染色體)文庫是含有某種生物體基因組隨機片段的重組DNA克隆群體，它在構建物理圖譜、基因圖位克隆、基因結構分析等研究中具有重要作用。目前許多生物都有高覆蓋度的BAC文庫。為了方便管理，BAC文庫被劃分為多個超級池來儲存，每個超級池由一定數目的96孔或384孔板組成；在每個超級池中，再將行向、列向和板面的BAC克隆混合，即得到行池、列池和板池。篩選克隆常用3D-PCR篩選系統，第一步是對超級池的DNA進行PCR擴增，找出含有陽性克隆的超級池；接下來對行池、列池和板池的DNA進行PCR擴增，得到克隆所在的行、列、板三個方向信息。由此，兩步PCR就可以找到含有目的片段的BAC克隆。
[0003]BAC末端序列是指BAC克隆中插入片段的兩端序列，能夠迅速而精確的定位BAC在基因組上位置。BAC末端測序技術在全基因組測序中有著舉足輕重的作用，它能夠迅速而精確地進行序列拼裝，也可以用來確定基因組序列結構的多態性，如倒置和易位。在許多基於新一代測序的動植物de novo基因組拼接中利用了 BAC末端序列的長程(約100_150kb)的位置關係，輔助基因組的拼接。在白菜基因組的de novo測序中，研究者利用BAC末端序列的信息將Scaffold N50從500kb提高到2Mb，顯示了這一應用的潛力。
[0004]目前BAC末端測序都是基於Sanger技術的，與質粒或PCR產物的測序步驟相近，但成功率卻比它們低得多 ，主要是由於難以獲得大量高純度的BAC DNA(500ng以上)，而且操作複雜、通量低、成本高。若以一個含10萬個克隆的大基因組的BAC文庫計算，每對BAC末端測序需要50元，則測出所有BAC末端序列需要10萬X 50元/克隆=500萬元，更別說所需要的時間。因此，發明一種快速低成本地測序BAC文庫中所有BAC末端序列的方法是非常有必要的和有市場前景的。
[0005]除此之外，高效快速測定BAC末端序列的方法可以用於全基因組測序的組裝工作中。近些年來，基於各種新一代測序平臺的denovo基因組測序為我們提供了成千上萬個物種的參考基因組序列，但短的序列讀長增加了 de novo數據的組裝難度，拼接後的contigN50 一般在15-40kb。為此，開發一種高效利用已有BAC文庫中所有BAC末端序列來輔助基因組組裝的方法，是非常有意義的。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種高效快速測定BAC末端序列的方法，所述方法通過新一代測序平臺大規模平行測定BAC文庫中行池、列池和板池中所有的BAC末端序列，再通過生物信息學的方法將BAC末端序列回歸到單個克隆。
[0007]本發明所述的高效快速測定BAC末端序列的方法包括如下步驟:
[0008](I)以超級池為單位，富集每個超級池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，製備成適合新一代測序平臺所需的文庫；
[0009](2)在新一代測序平臺上進行測序；
[0010](3)通過生物信息學的方法將混合的BAC末端序列回歸到單個克隆:利用序列比對，確定每個BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每個克隆的BAC末端序列。
[0011]其中，步驟(1)的方法為:用Covaris S220超聲破碎系統將超級池的行池、列池和板池中BAC DNA分別打斷成400-500bp，經過末端修復後，在DNA兩端連接上特定接頭，再通過特異的PCR引物擴增含BAC末端序列的區域，純化並膠回收300-350bp擴增產物，即製成含所有BAC末端序列的測序文庫。
[0012]具體地，步驟(1)中製備上述含所有BAC末端序列的測序文庫的方法包括如下步驟:
[0013](Al)將BAC DNA打斷:在1.5ml離心管中加入5 μ g BACDNA，用TE溶液稀釋將其體積補充至130 μ L,把稀釋好的DNA緩慢注入Covaris microTube,注意不要引入氣泡；設置 Covaris S220 參數，將 DNA 打斷成 400_500bp ；
[0014](A2)末端修復:配製末端修復反應的體系,混勻,室溫放置20min，反應結束後，用1.8 X AMPure XP Beads 純化，50 μ L TE 溶液洗脫；
[0015](A3)連接接頭:配製連接接頭反應的體系，混勻，室溫放置30min ;反應結束後，用1.8 X AMPure XP Beads 純化，30 μ L TE 溶液洗脫；
[0016](Α4)特異性PCR富集BAC末端序列:配製PCR反應的體系，設置好程序進行PCR擴增反應；反應結束後，用1.5 X AMPure XPBeads純化，30ul TE溶液洗脫，膠回收300_350bp擴增產物。
[0017]優選地，步驟(Al)中設置的Covaris S220參數為:
[0018]
【權利要求】
1.一種測定BAC末端序列的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: Cl)以超級池為單位，富集每個超級池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，製備成適合新一代測序平臺所需的文庫； (2)在新一代測序平臺上進行測序； (3)通過生物信息學的方法將混合的BAC末端序列回歸到單個克隆:利用序列比對，確定每個BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每個克隆的BAC末端序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)的方法為:用CovarisS220超聲破碎系統將超級池的行池、列池和板池中BAC DNA分別打斷成400-500bp，經過末端修復後，在DNA兩端連接上特定接頭，再通過特異的PCR引物擴增含BAC末端序列的區域，純化並膠回收300-350bp擴增產物，即製成含所有BAC末端序列的測序文庫。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中製備上述含所有BAC末端序列的測序文庫的方法包括如下步驟: (Al)將BAC DNA打斷:在1.5ml離心管中加入5 μ g BACDNA，用TE溶液稀釋將其體積補充至130 μ L,把稀釋好的DNA注入Covaris microTube,設置Covaris S220參數,將DNA打斷成 400-500bp ； (A2)末端修復:配製末端修復反應的體系，混勻，室溫放置20min，反應結束後，用1.8 X AMPure XP Bea ds 純化，50 μ L TE 溶液洗脫； (A3)連接接頭:配製連接接頭反應的體系，混勻，室溫放置30min ;反應結束後，用1.8 X AMPure XP Beads 純化，30 μ L TE 溶液洗脫； (Α4)特異性PCR富集BAC末端序列:配製PCR反應的體系，設置好程序進行PCR擴增反應；反應結束後，用1.5 X AMPure XPBeads純化，30ul TE溶液洗脫，膠回收300_350bp擴增產物。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(Al)中設置的CovarisS220參數為: 負載比5°/u 水浴溫度5-15°C 峰值入射功率105瓦特 每秒爆破數200 時間40秒 循環數2。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(A2)中配製的末端修復反應體系如下:打斷的DNA130 pL水48 μL
1x末端修復緩衝液20 μΕ
末端修復酶混合物2μΙ^
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(A3)中配製的連接接頭反應體系如下:末端修復的DNA50 pL5xDNA連接緩衝液20 pL接頭25 μL,連接酶5 pL。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟(A3)中所述接頭為:核苷酸序列為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條序列，將它們等摩爾混合，退火形成雙鏈，即製成接頭。
8.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(A4)中配製的PCR反應體系如下:
連有接頭的DNA10 μL PCR反應混合物50 pL
引物 I0.5 μ?,
引物 20.5 μL; 引物I的核苷酸序列如SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示；引物2的核苷酸序列如SEQID N0.5 所示。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，步驟(Α4)中PCR反應程序如下:先95°C預變性 5min ;然後 95°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，30 個循環；再 72°C延伸 1min ;4°C保存。
10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其特徵在於，所述新一代測序平臺為1nTorrent PGM 測序儀、1n Torren Proton 測序儀、Illumina 公司的 HiSeq、GA、MiSeq 測序儀或Roche公司的454測序儀中的一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073549SQ201310108959
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】胡曉湘, 談成, 李寧 申請人:中國農業大學