從孕婦血漿中檢測胎兒父系dna單核苷酸差異的方法

2023-08-13 16:36:51

專利名稱：從孕婦血漿中檢測胎兒父系dna單核苷酸差異的方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA檢測方法，特別是一種檢測游離DNA單核苷酸差異的方法。
(二)、技術背景伴隨著我國人口與疾病模式的轉變，出生缺陷問題日益突出，已成為我國新生兒和嬰兒死亡、兒童和成人殘疾的主要原因。據國家衛生部統計，出生缺陷的發生率約為13.05‰，其中單純由遺傳因素引起的出生缺陷所佔的比例高達25％。遺傳性出生缺陷沒有有效的治療方法，目前只好通過產前診斷有效避免患兒的出生，從而有利於優生優育和提高人口素質。
傳統的羊膜腔穿刺和絨毛吸取是目前許多醫院較為常用的產前診斷技術，因其操作易導致宮內感染、羊膜破裂、流產、胎兒損傷及死亡等，使其在臨床的推廣和應用受到了限制，因此發展一種有效無創性的產前診斷方法，避免羊膜腔穿刺和絨毛吸取的併發症，受到了科學家們的關注。近年來研究發現在妊娠過程中，孕婦血漿中存在游離胎兒DNA，而且胎兒DNA在孕婦血漿總游離DNA中的比率大約為3～6％，這一發現為無創性產前診斷開闢了新領域。
所述的單核苷酸差異一般包括單核苷酸突變和單核苷酸多態性(SNP)。孕婦血漿中的胎兒父系DNA，把它稱之為目的DNA；孕婦血漿中的孕婦DNA或胎兒母源性DNA，把它稱之為背景DNA。
現有的從孕婦血漿中檢測胎兒DNA單核苷酸差異的方法一般採用的是等位基因特異性聚合酶鏈式反應(ASPCR)技術，它是在DNA序列一端的核苷酸差異位點處設計一個引物，該位點位於引物的3′端，再在DNA另一端設計一個引物，用聚合酶鏈反應(PCR)對突變基因進行檢測。但這種方法存在著如下的不足眾所周知，影響檢測可靠性是由核苷酸差異的類型、樣品中目的DNA的含量和目的DNA與背景DNA之間的比例等因素決定。在背景DNA過量幹擾下，就會增加檢測微量目的DNA的難度，對單個核苷酸差異的檢測極容易出現誤診。因此，該方法僅限於如突變位點為幾個核苷酸缺失的一些特殊突變類型。
在2004年，美國國家科學院進展雜誌第101卷29期發表了名稱為「游離核酸單個核苷酸差異的質譜分析在無創性產前診斷中的應用」的論文(MS analysis of single-nucleotide differences incirculating nucleic acidsApplication to noninvasive prenataldiagnosis.Proc Natl Acad Sci USA.2004，101(29))，它是利用質譜陣列分析技術平臺(Sequenom公司)成功地檢測了胎兒父系單個核苷酸突變，拓展了孕婦血漿中胎兒DNA的突變檢測範圍。該技術平臺基於具有高特異性的單鹼基延伸反應(single base extensionreaction，SBER)和具有高靈敏度的基質輔助雷射解析電離/飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization-time offlight MS，MALDI-TOF-MS)，將有潛力應用於無創性產前診斷，但該方法有以下缺點1)當突變DNA的濃度低於野生型DNA濃度的1％時，單鹼基延伸反應可出現不依賴模板性擴增，將SBER技術檢測母體血漿尤其血清中胎兒DNA突變可能引起誤診，因此胎兒DNA佔血漿總DNA的比例嚴重影響著該方法的診斷結果；2)儀器價格昂貴，檢測費用高。由於存在上述缺點，從而限制了該方法在母體血漿中的應用。
(三)、發明內容本發明的目的就是提供一種簡便可靠、經濟實用的檢測游離DNA單核苷酸差異的方法，在過量背景DNA幹擾的情況下，它可以準確地檢測出微量目的DNA中的單核苷酸突變及單核苷酸多態性。
本發明的目的是通過這樣的技術方案實現的，它步驟如下(1)樣品處理抽取孕婦外周血8～15ml，提取血漿游離DNA，取5～10μl，含量為1～100ng的游離DNA，採用聚合酶鏈式反應(PCR)技術從血漿游離DNA中擴增目的DNA片段和背景DNA片段。
(2)標記靶序列取聚合酶鏈式反應(PCR)產物5～10μl，加入鹼性磷酸酶，37℃反應20～30分鐘後，使過量的脫氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入與所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，濃度為500～2000μmol/L，以目的DNA片段為模板，採用單鹼基延伸反應(SBER)技術，標記含有所需檢測的游離DNA突變或單核苷酸多態性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分離靶序列向上述單鹼基延伸反應(SBER)產物中，加入連有配基的磁珠50～100μl，直徑為1～10μm，濃度為1～5mg/ml，同時須保證所有磁珠上的配基數目比上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體要多，37℃反應20～50分鐘，使磁珠上的配基與上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)的配體通過配基配體反應導致磁珠與靶序列相連，採用磁性分離技術，該技術用磷酸鹽緩衝液(PBS)反覆懸浮並充分洗滌數次，直至將結合有靶序列的磁珠和未與靶序列結合的磁珠分離出來；(4)生物條形碼信號放大及檢測加入連上生物條形碼DNA序列和一種與靶序列互補的寡核苷酸片段的納米級微粒50～100μl，直徑為20～40nm，濃度為0.2～2μmol/L，使其與磁珠結合的靶序列通過鹼基配對原理進行DNA雜交1～2小時，然後採用磁性分離技術，該技術用磷酸鹽緩衝液(PBS)懸浮和充分洗滌數次，至除去未與靶序列結合的納米級微粒和與靶序列非特異性結合的納米級微粒為止，最後加入雙蒸消毒水40～50μl，加熱至45℃～60℃，使生物條形碼DNA序列充分脫離納米級微粒，再使用實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術或分子雜交技術或生物晶片技術來檢測生物條形碼DNA序列，從而間接達到檢測靶序列含量，實現檢測出遊離DNA突變或單核苷酸多態性的目的。
在上述的技術方案中，所述的「聚合酶鏈式反應(PCR)技術」、「實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術」、「磁性分離技術」、「分子雜交技術」和「生物晶片技術」均是現有的成熟技術。所述的「單鹼基延伸反應」是現有技術，它是指將引物合成到所需要檢測的突變位點和單核苷酸多態性前一個鹼基，加入與所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)，以目的DNA片段為模板，使引物得以延伸一個鹼基。所述的「磁珠」是指由具有較好磁響應性的磁性材料如三氧化二鐵、四氧化三鐵及鐵鈷合金等和高分子骨架材料如聚苯乙烯、矽烷及聚一烯等製備而成的磁性微球，直徑為1～10μm，它是磁性分離技術的必備部分，目前已經商業化。所述的「生物條形碼DNA序列」是指一段特異DNA序列，長度為40～70個鹼基，只能與納米級微粒上的一種寡核苷酸片段運用鹼基配對原理相結合，不能與檢測過程中其他序列相結合，作為辨識靶序列用的標籤。所述的「納米級微粒」可以是納米金顆粒，其直徑可以為30nm左右，也可以是高分子材料顆粒，如聚苯乙烯、聚氯乙烯等構成的顆粒，還可以是其它的納米級顆粒。目前已經商業化，也可參考相關文獻自行製備。納米級微粒上連接有兩種寡核苷酸片段，一種用於與靶序列互補，另一種則與生物條形碼DNA序列互補，將生物條形碼DNA序列通過分子雜交與納米級微粒上的寡核苷酸片段相連，以構成連上生物條形碼DNA序列和一種與靶序列互補的寡核苷酸片段的納米級微粒。將納米級微粒連接生物條形碼DNA序列和與靶序列互補的寡核苷酸片段可參考相關文獻自行操作。
在本發明中，把所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)加入後，進行單鹼基延伸反應，反應的結果是如果目的DNA片段存在單核苷酸差異，如單核苷酸突變或單核苷酸多態性(SNP)，引物得以延伸一個脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)；如果目的DNA片段不存在單核苷酸差異，引物就不會延伸。這樣一來，使得目的DNA片段中存在單核苷酸差異時，引物將帶上配體標記，以利於下一步的磁性分離，保證檢測的特異性。加入連有配基的磁珠，磁珠上的配基能與上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)的配體發生配基配體反應，使磁珠與靶序列相連，採用磁性分離技術將靶序列分離出來。加入連上生物條形碼DNA序列和一種與靶序列互補的寡核苷酸片段的納米級微粒，使其與磁珠結合的靶序列雜交，充分反應後，在磁場作用下，經過懸浮與洗滌，除去未與靶序列結合的納米級微粒和與靶序列非特異性結合的納米級微粒，接著加熱使生物條形碼DNA序列脫離納米級微粒，這時只需要檢測生物條形碼DNA序列數量，就可以間接達到檢測靶序列含量。由於每一納米級微粒能接上大約360條寡核甘酸片段，其中，生物條形碼DNA序列互補的寡核甘酸片段數量與跟靶序列互補的寡核甘酸片段數量之比可以控制為70∶1，從而把檢測信號擴大了70倍，提高了檢測的靈敏度，顯著降低了誤診率。而且本發明因不涉及到特殊昂貴儀器而成本非常低廉。
由於採用了上述技術方案，本發明具有如下的優點1.成本比較低廉，涉及到各項儀器均不超過20萬人民幣；2.可以準確地從孕婦血漿中檢測出胎兒父系DNA中的單核苷酸突變及單核苷酸多態性；3.可以從孕婦血漿中檢測出胎兒DNA含量。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明本發明的步驟如下(1)樣品處理抽取孕婦外周血8～15ml，提取血漿游離DNA，取5～10μl，含量為1～100ng的游離DNA，採用聚合酶鏈式反應(PCR)技術從血漿游離DNA中擴增目的DNA片段和背景DNA片段。
(2)標記靶序列取聚合酶鏈式反應(PCR)產物5～10μl，加入鹼性磷酸酶，37℃反應20～30分鐘後，使過量的脫氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入與所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，濃度為500～2000μmol/L，以目的DNA片段為模板，採用單鹼基延伸反應(SBER)技術，標記含有所需檢測的游離DNA突變或單核苷酸多態性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分離靶序列向上述單鹼基延伸反應(SBER)產物中，加入連有配基的磁珠50～100μl，直徑為1～10μm，濃度為1～5mg/ml，同時須保證所有磁珠上的配基數目比上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體要多，37℃反應20～50分鐘，使磁珠上的配基與上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)的配體通過配基配體反應導致磁珠與靶序列相連，採用磁性分離技術，該技術用磷酸鹽緩衝液(PBS)反覆懸浮並充分洗滌數次，直至將結合有靶序列的磁珠和未與靶序列結合的磁珠分離出來；(4)生物條形碼信號放大及檢測加入連上生物條形碼DNA序列和一種與靶序列互補的寡核苷酸片段的納米級微粒50～100μl，直徑為20～40nm，濃度為0.2～2μmol/L，使其與磁珠結合的靶序列通過鹼基配對原理進行DNA雜交1～2小時，然後採用磁性分離技術，該技術用磷酸鹽緩衝液(PBS)懸浮和充分洗滌數次，至除去未與靶序列結合的納米級微粒和與靶序列非特異性結合的納米級微粒為止，最後加入雙蒸消毒水40～50μl，加熱至45℃～60℃，使生物條形碼DNA序列充分脫離納米級微粒，再使用實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術或分子雜交技術或生物晶片技術來檢測生物條形碼DNA序列，從而間接達到檢測靶序列含量，實現檢測出遊離DNA突變或單核苷酸多態性的目的。
在本發明中，把所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)加入後，進行單鹼基延伸反應，反應的結果是如果目的DNA片段存在單核苷酸差異，如單核苷酸突變或單核苷酸多態性(SNP)，引物得以延伸一個脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)；如果目的DNA片段不存在單核苷酸差異，引物就不會延伸。這樣一來，使得目的DNA片段中存在單核苷酸差異時，引物將帶上配體標記，以利於下一步的磁性分離，保證檢測的特異性。加入連有配基的磁珠，磁珠上的配基能與上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)的配體發生配基配體反應，使磁珠與靶序列相連，採用磁性分離技術將靶序列分離出來。加入連上生物條形碼DNA序列和一種與靶序列互補的寡核苷酸片段的納米級微粒，使其與磁珠結合的靶序列雜交，充分反應後，在磁場作用下，除去未與靶序列雜交的納米級微粒，接著加熱使生物條形碼DNA序列脫離納米級微粒，這時只需要檢測生物條形碼DNA序列數量，就可以間接達到檢測靶序列含量。由於每一納米級微粒能接上大約360條寡核甘酸片段，其中，生物條形碼DNA序列互補的寡核甘酸片段數量與跟靶序列互補的寡核甘酸片段數量之比可以控制為70∶1，從而把檢測信號擴大了70倍，提高了檢測的靈敏度，顯著降低了誤診率。
為減少鹼性磷酸酶處理後可能剩餘微量脫氧核苷酸(dNTP)的引起延伸反應，在上述的步驟(2)中，在加入所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)同時，加入與野生型核苷酸互補的雙脫氧核苷酸(ddNTP)。
在上述的步驟中，所述的鹼性磷酸酶可以是牛小腸鹼性磷酸酶。
在上述的步驟中，所述的鹼性磷酸酶可以是蝦鹼性磷酸酶。
在上述的步驟中，所述的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體可以是生物素，磁珠上的配基可以是親和素、鏈黴親和素或親和素類似物。
在上述的步驟中，所述的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體也可以是螢光素，磁珠上的配基也可以是螢光素抗體。
權利要求
1.一種從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，其步驟如下(1)樣品處理抽取孕婦外周血8～15ml，提取血漿游離DNA，取5～10μl，含量為1～100ng的游離DNA，採用聚合酶鏈式反應(PCR)技術從血漿游離DNA中擴增目的DNA片段和背景DNA片段。(2)標記靶序列取聚合酶鏈式反應(PCR)產物5～10μl，加入鹼性磷酸酶，37℃反應20～30分鐘後，使過量的脫氧核苷酸(dNTP)去磷酸化，加入與所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)1～2μl，濃度為500～2000μmol/L，以目的DNA片段為模板，採用單鹼基延伸反應(SBER)技術，標記含有所需檢測的游離DNA突變或單核苷酸多態性目的DNA片段——靶序列；(3)磁珠分離靶序列向上述單鹼基延伸反應(SBER)產物中，加入連有配基的磁珠50～100μl，直徑為1～10μm，濃度為1～5mg/ml，同時須保證所有磁珠上的配基數目比上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體要多，37℃反應20～50分鐘，使磁珠上的配基與上述標記在脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)的配體通過配基配體反應導致磁珠與靶序列相連，採用磁性分離技術，該技術用磷酸鹽緩衝液(PBS)反覆懸浮並充分洗滌數次，直至將結合有靶序列的磁珠和未與靶序列結合的磁珠分離出來；(4)生物條形碼信號放大及檢測加入連上生物條形碼DNA序列和一種與靶序列互補的寡核苷酸片段的納米級微粒50～100μl，直徑為20～40nm，濃度為0.2～2μmol/L，使其與磁珠結合的靶序列通過鹼基配對原理進行DNA雜交1～2小時，然後採用磁性分離技術，該技術用磷酸鹽緩衝液(PBS)懸浮和充分洗滌數次，至除去未與靶序列結合的納米級微粒和與靶序列非特異性結合的納米級微粒為止，最後加入雙蒸消毒水40～50μl，加熱至45℃～60℃，使生物條形碼DNA序列充分脫離納米級微粒，再使用實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術或分子雜交技術或生物晶片技術來檢測生物條形碼DNA序列，從而間接達到檢測靶序列含量，實現檢測出遊離DNA突變或單核苷酸多態性的目的。
2.如權利要求1所述的從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，所述步驟(2)中，在加入所需檢測核苷酸互補的配體標記的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)同時，加入與野生型核苷酸互補的雙脫氧核苷酸(ddNTP)。
3.如權利要求1或2所述的從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，所述的鹼性磷酸酶可以是牛小腸鹼性磷酸酶。
4.如權利要求1或2所述的從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，所述的鹼性磷酸酶可以是蝦鹼性磷酸酶。
5.如權利要求1或2所述的從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，所述的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體是生物素，磁珠上的配基是親和素、鏈黴親和素或親和素類似物。
6.如權利要求1或2所述的從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，所述的脫氧核苷酸(dNTP)或雙脫氧核苷酸(ddNTP)上的配體是螢光素，磁珠上的配基是螢光素抗體。
全文摘要
一種從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的方法，它是依次通過常規PCR擴增、單鹼基延伸反應標記靶序列、磁珠分離靶序列和生物條形碼信號放大及檢測的四個步驟，來實現從孕婦血漿中檢測胎兒父系DNA單核苷酸差異的目的。本發明具有成本比較低廉和經濟實用等優點，可以準確地從孕婦血漿中檢測出胎兒父系DNA中的單核苷酸突變及單核苷酸多態性，還可以從孕婦血漿中檢測出胎兒DNA含量。
文檔編號G01N33/533GK1978668SQ20061009530
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月18日 優先權日2006年12月18日
發明者李力, 易萍, 陳竹欽, 郭建新 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院