與昆蟲腸蛋白結合的抗體和其應用的製作方法

2023-10-22 20:44:17

專利名稱：與昆蟲腸蛋白結合的抗體和其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及能與昆蟲腸蛋白結合的抗體和其應用，特別是它們在形成新雜合毒素分子中的應用。本發明還涉及分別產生所述抗體和雜合毒素的微生物、植物細胞和植物。本發明還包括殺昆蟲組合物和其保護植物抗蟲害的用途。
只有在有限的情形下可以通過生物分子防治各種害蟲。具有殺蟲作用的生物分子最熟知的例子是來自蘇雲金芽孢桿菌(Bt)的δ-內毒素。已知許多Bt菌株在孢子形成過程中產生殺蟲蛋白δ-內毒素。這些δ-內毒素中有些對不同的害蟲有有效的殺蟲活性。但是δ-內毒素的應用有限，因為它們的活性僅限於眾多害蟲中的很小一部分。
Bt內毒素的有限特異性至少部分依賴於毒素在昆蟲腸中的活化(Haider，M.Z.等，1986，歐洲生物化學雜誌156531-540)和其與昆蟲中腸表皮細胞上特異受體結合的能力(Hofman，CP.等，1988，PNAS 857844-7848)。妨礙有些Btδ-內毒素對特異昆蟲活性的因素之一是在昆蟲腸中缺少適當的受體或δ-內毒素與可能存在的受體缺乏親和性，從而造成δ-內毒素不能與刷狀緣膜結合。因此現在用Bt內毒素防治具體害蟲的能力依賴於發現具有理想活性範圍的適當δ-內毒素的能力。許多情形下這種δ-內毒素是未知的，甚至不一定存在。例如，針對玉米根葉甲(WCRW，玉米的主要害蟲)的活性已篩選了幾千株Bt，但至今還沒有關於產生對WCRW有高活性的δ-內毒素的Bt菌株的報導。
單一的δ-內毒素一般活性譜很窄，每種只對一種或少數幾種害蟲有活性。而且已知δ-內毒素只對少數目別的少數昆蟲有活性。產生其他具有特異殺蟲活性的蛋白的能力，為用對非靶標生物高度安全的生物分子防治農業害蟲特別是昆蟲提供了更多的選擇。因而需要能被設計成靶向特異害蟲的結合蛋白。
因而，本發明涉及與昆蟲腸的刷狀緣膜小泡結合的抗體，特別是單克隆抗體或其片段，和編碼這些蛋白的基因。本發明的抗體與靶昆蟲腸中的蛋白結合，特別是對選自以下目的靶昆蟲鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目和毛翅目，但不與哺乳動物的刷狀緣膜或與植物的微粒體結合。本發明特別涉及與玉米根葉甲的腸結合的單克隆抗體或片段。在一優選的實施方案中，本發明涉及選自下組的單克隆抗體2B5、3B1、10B6、17F6、14G1和16E4。
本發明還包括產生本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞，特別是已按下列保藏號保藏的雜交瘤細胞ATCC HB 11616，HB 11617，HB 11618，HB11619和HB 11620。
本發明的另一個目的是提供編碼本發明單克隆抗體或所述單克隆抗體的結合位點的DNA序列。本發明特別涉及編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列，其中所述DNA片段選自SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46。還包括這樣的DNA序列，所述DNA序列與毒素部分有效地連接，特別是其中所述毒素片段選自芽孢桿菌毒素、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
這些抗體和編碼它們的基因可用於構建防治害蟲的雜合毒素。因而，本發明的另一方面是包括本發明單克隆抗體或單克隆抗體片段和與其有效連接的毒素部分的雜合毒素分子。在本發明的一個優選實施方案中，所述毒素部分選自芽孢桿菌毒素如芽孢桿菌內毒素，特別是選自下組Bt內毒素、營養期殺蟲蛋白、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
本發明從而還涉及包括與靶昆蟲的腸特別是與昆蟲刷狀緣膜結合、但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合的單克隆抗體或其結合區域和與其有效地結合的毒素部分的雜合毒素，其中毒素部分選自芽孢桿菌毒素如芽孢桿菌內毒素，特別是選自下組Bt內毒素、營養期殺蟲蛋白、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
本發明還包括編碼本發明雜合毒素的DNA序列，所述雜合毒素包括與靶昆蟲的腸結合但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合的單克隆抗體或其結合區域和與其有效地連接的毒素部分。
本發明進一步包括用其中插入編碼本發明雜合毒素的DNA分子的適當載體轉化的微生物宿主。這些微生物宿主特別包括細菌、藻類和真菌。
本發明進一步包括用至少一種本發明的DNA序列轉化的重組微生物，特別是選自下組的微生物細菌如芽孢桿菌、柄桿菌、Agmenellum、假單胞菌、歐文氏菌、沙雷氏菌、科雷伯氏菌、黃單胞菌、鏈黴菌、根瘤菌、紅假單胞菌、Metylius、農桿菌、醋桿菌、乳桿菌、節桿菌、固氮菌、明串珠菌和產鹼菌；真菌特別是酵母如酵母、隱球酵母、克魯維酵母、擲孢酵母、紅酵母和短梗黴；病毒如苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒。
本發明特別涉及包含至少一種編碼雜合毒素的DNA分子的重組微生物，其中雜合毒素包括與靶昆蟲的腸結合但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合的抗體或其片段和與其有效地連接的毒素部分，所述編碼單克隆抗體的DNA序列選自SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46。
本發明進一步包括含有殺蟲有效量的本發明的任何上述重組微生物和適當載體的殺蟲組合物。
本發明特別涉及含有殺蟲有效量的本發明的分離的雜合毒素分子和適當載體的殺蟲組合物。
本發明進一步涉及由第一表達盒組成的DNA序列，該表達盒包括編碼能夠指導在植物中表達的啟動子的DNA序列，和與其有效連接的編碼與靶昆蟲的腸結合的單克隆抗體輕鏈或抗體結合域的第一DNA序列。在一優選實施方案中，所述表達盒進一步包括與所述編碼單克隆抗體輕鏈或抗體結合域的第一DNA序列有效連接的編碼毒素部分的第二DNA序列。特別優選的表達盒中第二DNA序列編碼的毒素部分選自芽孢桿菌毒素、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
本發明進一步包括含有第二表達盒的DNA序列，該第二表達盒中有編碼能夠指導在植物中表達的啟動子的DNA序列，並與編碼與靶昆蟲腸結合的單克隆抗體重鏈或抗體結合域的第一DNA序列有效地連接。在另一實施方案中，所述表達盒進一步包括與所述編碼單克隆抗體重鏈或抗體結合域的第一DNA序列有效連接的編碼毒素部分的第二DNA序列。特別優選的表達盒中第二DNA序列編碼的毒素部分選自芽孢桿菌毒素、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
本發明的DNA序列可以是分離的基本純化的形式或作為植物基因組的一部分。
本發明進一步涉及植物細胞或植物，包括其後代，特別是玉米植物，該植物細胞或植物已用本發明的DNA序列特別是本發明的植物表達盒進行了轉化。本發明還包括能以使植物和植物細胞分別耐受或抵抗害蟲的量表達本發明雜合毒素的轉基因植物細胞或轉基因植物，包括其後代，特別是玉米植物。本發明的植物優選為雜種植物。
本發明還包括經保護劑包衣處理的植物繁殖體，特別是植物種子。
本發明還涉及產生本發明抗體或單克隆抗體的雜交瘤細胞系的製備方法，其包括a)用昆蟲腸，特別是昆蟲刷狀緣膜作為抗原；b)用所述抗原免疫供體動物；c)從被免疫的供體動物分離免疫成分B細胞；d)將所述免疫成分B細胞與能進行連續細胞分裂的腫瘤細胞融合；e)分離形成的融合產物，在適當的培養基中培養，然後克隆陽性雜合細胞；和f)將克隆的雜合細胞按產生單克隆抗體的能力進行篩選，選擇具有所要求性質的克隆。
本發明還涉及產生能與昆蟲腸刷狀緣膜小泡結合的抗體、尤其是單克隆抗體或其片段的方法，包括使產生所述抗體的雜交瘤細胞在適當的培養基中體內或體外生長，及分離生產的抗體。
本發明還涉及產生能與昆蟲腸刷狀緣膜小泡結合的雜合毒素的方法，所述雜合毒素包括本發明的單克隆抗體或單克隆抗體結合片段和與其有效連接的毒素部分，該方法包括克隆所述抗體的可變區並將所述可變區與毒素部分連接。
本發明進一步包括編碼本發明單克隆抗體的DNA的製備方法，其包括用針對恆定區保守DNA序列和可變區的支架區的引物，從雜交瘤細胞克隆相應的抗體基因。
本發明還包括產生轉基因植物細胞和轉基因植物的方法，分別包括用一種或多種上述編碼本發明雜合毒素的DNA序列轉化所述植物細胞或植物，所述雜合毒素包括與靶昆蟲的腸結合而不與哺乳動物的刷狀緣膜或植物微粒體結合的單克隆抗體或其結合域和與其有效結合的毒素部分。
本發明提供了對抗昆蟲腸中蛋白的抗體和單克隆抗體，包括其能夠以該抗體或單克隆抗體的特異性結合的片段。這種抗體與昆蟲腸細胞結合，但不與哺乳動物刷狀緣膜小泡(BBMV)結合，也不與植物微粒體結合。
本發明的抗體包括單克隆抗體和其保留與昆蟲腸蛋白結合能力的片段。如果一種抗體、單克隆抗體或其片段能夠與一分子特異地反應，從而將該分子結合到抗體上，則可以說該抗體能夠與該分子結合。術語「抗體」(Ab)或「單克隆抗體」(Mab)意指完整的分子以及其能夠結合半抗原的片段或結合區或域(例如包括Fab和F(ab)2片段)。這種片段一般是通過用蛋白酶裂解產生的，例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。或者，半抗原結合片段可以通過應用重組DNA技術或通過合成化學來產生。
製備本發明抗體的方法總體上是已知的。例如，見抗體實驗室手冊，EdHarlow和Lane編，冷泉港實驗室，紐約(1988)，及其中所引用的文獻。關於免疫學一般原理的標準參考著作包括Klein，免疫學雜誌細胞-非細胞判別的科學，John WileySons，紐約(1982)；Dennett，R.等.單克隆抗體，雜交瘤生物分析中的新手段，Plenum出版社，紐約(1980)；和生物化學和分子生物學的實驗室技術，13卷，Burdon等編，Elsevier，Amsterdam(1984)中Campbell，A.的」「單克隆抗體技術」。還可參見美國專利4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4,720,459。
可以利用昆蟲腸特別是昆蟲刷狀緣膜作為抗原製備本發明的抗體和單克隆抗體。這種昆蟲腸膜可以通過本領域的已知方法來製備。一般，刷狀緣膜可以這樣製備從昆蟲幼蟲切下腸並勻化，然後用氯化鈣沉澱膜。例如見，Wolfrsberger(1986)化合物-生物化學-生理學86A301-308。
可以認識到，利用本文描述的方法可以製備對具體靶昆蟲特異的抗體。靶昆蟲意指本發明抗體與其腸中蛋白結合的昆蟲。也就是說，可以製備能夠結合只在靶昆蟲中存在的蛋白的抗體。
靶昆蟲可以是任何昆蟲，包括選自下列各目的昆蟲鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目和毛翅目等。因此可以選擇任何昆蟲害蟲，並製備對該昆蟲特異的抗體。尤其有意義的昆蟲是沒有Bt蛋白與其結合併將其殺死的那些，如玉米根葉甲。
本發明產生抗體和單克隆抗體的細胞系是當用昆蟲刷狀緣膜小泡作為抗原產生Mab系時所產生的所有單克隆抗體中的一部分。產生理想單克隆抗體的細胞系的結合特徵是通過對所有針對靶昆蟲BBMV的各種單克隆抗體進行區別篩選而確定的。
本發明的區別篩選能鑑別出與哺乳動物BBMV和/或植物微粒體結合的抗體系。棄去與哺乳動物BBMV和/或植物微粒體結合的單克隆抗體細胞系。區別篩選還能鑑別出與非靶昆蟲種別的昆蟲BBMV結合的單克隆抗體細胞系。因此，本發明的抗體是只對靶昆蟲特別是靶昆蟲的腸顯示高特異性結合的那些抗體。
具有理想結合特異性的MAb亞系可以用作克隆特異單克隆抗體cDNA的信使RNA源。利用針對恆定區保守DNA序列和可變區的支架區的引物可從雜交瘤細胞克隆抗體基因。然後利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增克隆的DNA。已成功地利用了Kabat等收集的小鼠重鏈和輕鏈序列資料庫來產生用於抗體基因克隆的同型特異性引物和降解引物(Kabat，E.A.等，1987，美國健康和人體事物部，美國政府出版局，和Jhons，S.T.和Bendig，M.，1991，生物技術988-89)。另外，已知許多關於克隆具有原始抗體結合特性的抗體小片段的技術。
克隆的DNA然後可以用本領域的已知方法測序。例如見，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約(1989)，1-3卷，和其中引用的文獻。從核苷酸序列可以推定所選單克隆抗體的結合區的蛋白序列。
本發明的抗體和單克隆抗體可用於產生雜合毒素分子。「雜合毒素分子」或「雜合毒素」意指包括單克隆抗體或抗體片段和與其有效結合的毒素部分並能夠與昆蟲的腸結合的融合蛋白或免疫毒素。即，當結合在一起時，單克隆抗體或抗體片段保持其結合特性，毒素部分保持其細胞毒特性。
可以用許多細胞毒性蛋白作為毒素部分。這包括但不限於芽孢桿菌毒素，包括內毒素和營養期殺蟲蛋白。例如見1993年3月25日申請的美國申請08/037,057和WO93/07278，將其併入本文作為參考。其他毒素包括催化性核糖體滅活劑如gelonin、假單胞菌內毒素A或商陸素(假單胞菌內毒素的結構已被鑑定，Chaudhary等，(1990)生物化學雜誌26516303-16310)；細胞代謝阻斷劑如核糖核酸酶(例如見Mariani(1990)自然347737-741)；Barnase毒素(或PE-Bar)，一種由假單胞菌內毒素A和核糖核酸酶衍生的嵌合毒素(見Prior等(1991)細胞641017-1023)；在膜中能造成孔的親水性蛋白(見Frohlich和Wells(1991)肽蛋白研究國際雜誌372-6)等。
因此，本發明的雜合毒素分子含有使該分子與昆蟲腸結合的區域(抗體區)和實施殺死靶細胞並最終殺死靶昆蟲的毒性區。通過雜合毒素中的單克隆抗體或其片段，雜合毒素與靶昆蟲的腸結合，從而只對該昆蟲起毒性作用。這種雜合毒素的結合特徵來自單克隆抗體的結合區，而這種雜合毒素的毒性效應來自所用的毒素部分。
連接抗體或抗體片段和毒素的方法是本領域已知的。這種方法包括用於單鏈抗體免疫毒素的接頭(Chandhary等(1989)自然339394-397；Chardhary等(1990)PNAS 879491-9494；Batra等1991，分子和細胞生物學112200-2205；Brinkmann等(1991)，PNAS 888616-8620；Brinkma等(1992)PNAS 893075-3079；Whitlow等(1993)，蛋白工程6989-995)。一種特別有用的接頭基於人IgAl鉸鏈區，見Hallewell等(1989)，生物化學雜誌2645260-5268並如SEQ ID NO43中所述。
雜合毒素的活性可能取決於幾種因素，可以優化這些因素。可以使用暫時表達的玉米原生質體產生的蛋白測定該活性。按此方法，將表達雜合毒素的玉米原生質體攙入昆蟲食物中進行活性測定。一般的昆蟲測定方法見Marrone(1985)，經濟昆蟲學.78290-293，Maclntosh等(1990)，無脊椎動物病理雜誌56258-266和其中所引用的文獻。
這樣就可以測試雜合毒素分子對靶昆蟲的殺蟲活性。那些顯示活性的分子可進一步開發以供農業應用。
還可以認識到可以構建各種不同的雜合毒素分子。例如，雜合毒素可以由分別編碼抗體分子重鏈和輕鏈的兩個表達盒來編碼。例如這種二元雜合毒素可以利用細胞的正常加工機制進行體內組裝，以產生抗體結合位點。雜合毒素的毒素部分可以有效地連接在輕鏈或重鏈的N或C末端，或者置於兩種鏈恆定區的任何部分。毒素部分也可以插入在抗體鏈的恆定區中或兩個恆定區之間。這種分子可用標準的分子技術製得。例如見Sambrook等.分子生物學實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約(1989)1-3卷，和其中引用的文獻。
可以在植物中產生本發明的雜合毒素，包括二元毒素。按此方法，以能夠組裝功能抗體的方法在植物中克隆和表達抗體基因。例如見Hiatt等(1989)自然34276-78，During等(1990)，植物分子生物學雜誌15281-293和PCT申請WO91/06320。據報導二價抗體的表達水平高達菸草中可溶蛋白的1％。認為可以使用抗體分子或抗體片段如Fab和Fv片段。已證明較小的Fab和Fv片段(12kDa-50kDa)完全保持了結合親和力。其中Vh和VI區由一親水柔性肽連接的單鏈Fv片段已成功地用於靶酶，並對特異細胞有毒性(Bird(1988)科學423423-426和Huston(1988)PNAS 855879-5883)。小至20個胺基酸稱為最小識別單位(mru)的單鏈Vh區(Dab)和單鏈互補決定區也用於抗原結合(Ward(1989)自然341544-546和Taub(1989)，生物和化學雜誌.264259-265和Willams(1989)PNAS 865537-5541)。這些抗體片段的應用提供了將來自單克隆抗體的昆蟲特異結合區縮小到很小的可能性。編碼能與昆蟲腸結合的抗體或抗體區的DNA片段也包括在本發明範圍內。在一優選實施方案中，這些DNA片段編碼單克隆抗體的結合區，該單克隆抗體是針對靶昆蟲的BBMV的，並經篩選保證不與哺乳動物的BBMV或植物微粒體結合。這種DNA片段可用於構建編碼上述新雜合毒素分子的基因。
編碼雜合毒素分子毒素部分的DNA序列是本領域已知的。見Lamb等(1995)歐洲生物化學雜誌.148275-170(蓖麻毒)；Gray等(1984)PNAS812645-2649(假單胞菌毒素DNA序列)；Hindley和Berry(1988)核酸研究.164168(B.sphaericus毒素基因)；Bauman等(1988)，細菌學雜誌.1702045-2050，Baumann等(1987)，細菌學雜誌.1694061-4067，Berry和Hindley(1987)核酸研究.155891，Berry等(1989)，核酸研究.177516(B.sphaericus)；WO 9309130-A(gelonin)；EP466222-A，U.S.Patent No.5,128,460(核糖體活化蛋白)；EP 412911-A(barnase)；Heernstadt等(1987)基因5737-46(cryIIIA)；Brizzard和Whiteley(1988)核酸研究162723-2724(cryIB)；和Geiser等(1986)基因48109-118(cryIA(b))。也見於Porter等(1993)，微生物學綜述57838-861；Hofte和Whiteley(1989)微生物學綜述53242-255；和WO 93/07278。
可以優化本發明的雜合毒素基因以提高在植物中的表達。例如見WO93/07278；EPA 0359472；EPA 0385962；WO91/16432；Perlak等(1991)，美國全國學院科學進展.883324-3328；和Murray(1989)核酸研究17477-498。按此方法，可以用植物優選的密碼子合成該基因。特異宿主的優選密碼子是在該宿主中最常用來編碼胺基酸的單一密碼子。對於具體胺基酸，玉米的優選密碼子來自玉米的已知基因序列。玉米植物的28種基因的密碼子選用見於Murray(1989)核酸研究17477-498，其公開內容併入本文作為參考。還可以基於特異宿主對特異胺基酸使用的密碼子分布來合成基因。
按照該方法可以為在任何植物中的表達優化核苷酸序列。認為可以優化或合成所有基因序列或其任何部分。也就是說可以使用合成的、部分優化的或天然的序列。
轉化植物細胞的方法和繁殖被轉化植物的方法是本領域內熟知的。為了將外源DNA引入植物，使用了Ti質粒載體以及直接DNA吸入法、脂質體法、電穿孔法、微注射法和使用微發射物的方法。這些方法已被公開在下列文獻中，例如Guerche等，(1987)植物科學52111-116；Neuhause等，(1987)理論和應用遺傳學。7530-36』；Klein等，(1987)自然32770-73；Howell等，(1980)科學2081265；Horsch等，(1985)科學2271229-1231；DeBlock等，(1989)植物生理學91694-701；植物分子生物學方法(Weissbach和Weissbach編)學院出版社(1988)；和植物分子生物學方法(Schuler和Zielinski編)學院出版社(1989)。也見於EPA 0193259和EPA0451878A1。可以理解轉化方法將取決於待轉化的植物細胞。
還可以修飾含有目標序列的表達盒中的成分以提高在植物和植物細胞中的表達。例如可以使用截短序列、核苷酸取代或其他修飾辦法。例如見Perlak等(1991)美國全國學院科學進展883324-3328；Murray等(1989)核酸研究17477-498；和WO 91/16432。
該結構中還可以包括任何其他必須的調節序列，如終止子(Guerineau等，(1991)，分子和普通遺傳學，226141-144；Proudfoot，(1991)，細胞，64671-674；Sanfacon等，(1991).基因進展，5141-149；Mogen等，(1990)，植物細胞，21261-1272；Munroe等(1990)，基因，91151-158；Ballas等(1989)，核酸研究，177891-7903；Joshi等(1987)，核酸研究，159627-9639)；植物翻譯保守序列(Joshi，C.P.，(1987)，核酸研究，156643-6653)，內含子(Luehrsen和Walbot，(1991)，分子和普通遺傳學，22581-93)等，它們與核苷酸序列有效地連接。在表達盒結構中包含5』引導序列是有益的。這種引導序列可以起到增強翻譯的作用。翻譯引導序列在本領域中是已知的，包括細小核糖核酸病毒引導序列，例如EMCV引導序列(腦心肌炎病毒5』非編碼區)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.(1989)PNAS美國866126-6130)；Potyvirus引導序列，例如TEV引導序列(菸草Etch病毒)(Allison等(1986)；MDMV引導序列(玉米矮化花葉病毒)；病毒學，154；9-20)，和人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，(Macejak，D.G.和Sarnow，P.，(1991)，自然，353；90-94；苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA的非翻譯引導序列(AMV RNA4)，(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，(1987)，自然，325622-625；菸草花葉病毒引導序列(TMV)，(Gallie，D.R.等，(1989)，RNA的分子生物學，237-256頁；和玉米矮黃斑駁病毒引導序列(MCMV)(Lommel，S.A.等(1991)，病毒學，81382-385。也見於Della-Cioppa等，(1987)，植物生理學，84965-968。
表達盒中可以使用植物終止子。見Rosenberg等(1987)，基因，56125；Guerineau等(1991)，分子和普通遺傳學，226141-144；Proudfoot，(1991)，細胞，64671-674；Sanfacon等，(1991)，基因進展，5141-149；Mogen等，(1990)，植物細胞，21261-1272；Munroe等(1990)，基因，91；151-158；Ballas等(1989)，核酸研究，177891-7903；Joshi等(1987)，核酸研究，159627-9639。
為了進行組織特異性表達，可將本發明的核苷酸序列與組織特異性啟動子有效連接。例如見US WO 93/07278，將其併入本文作為參考。
本發明還包括通過上述方法轉化的轉基因植物，特別是轉基因能育植物和其仍含有編碼本發明單克隆抗體或雜合毒素的DNA分子的無性和/或有性繁殖後代。從本發明的轉化植物材料培育的成熟植物進行自交或遠交以產生種子。
本發明的轉基因植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。優選的單子葉植物是禾本科的植物，包括麥屬、玉米屬、小麥屬、Triticale、高粱屬、甘蔗屬、雀麥屬、稻屬、燕麥屬、大麥屬、黑麥屬和狗尾草屬植物。
特別優選轉基因玉米、小麥、大麥、帚蜀黍、黑麥、燕麥、草地草和稻。
本發明特別優選的雙子葉植物有大豆、棉花、菸草、甜菜、油耔油菜和向日葵。
「後代」一詞應理解為包括轉基因植物的「無性」和「有性」繁殖後代。這一定義還包括通過已知方法例如細胞融合或突變選擇可獲得的、仍顯示原轉基因植物特徵特性的所有突變體和變異體，以及該轉基因植物材料的所有雜交和融合產物。
本發明的另一目的是轉基因植物的繁殖材料。
轉基因植物的繁殖材料在本發明中定義為可以在體內或體外進行有性或無性繁殖的任何植物材料。本發明中特別優選原生質體、細胞、calli、組織、器官、種子、胚、花粉、卵細胞、合子、塊莖、穀粒、果實以及可從轉基因植物獲得的其他繁殖材料。
來自轉基因植物的植物部分如花、莖、果、葉、根或其後代也包括在本發明範圍內，所述轉基因植物按本發明方法進行過轉化，因而至少部分由轉基因細胞組成。
在植物繁殖材料(果實、塊莖、穀粒、種子)特別是種子作為商品出售之前，通常用保護劑包衣材料處理以防止由細菌、真菌和動物害蟲造成的損害，所述保護劑包衣材料包括除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或數種這些製劑的混合物，必要時還可以包括載體、表面活性劑或通常用於製劑領域中的應用促進佐劑。
為處理種子，可以通過液體製劑浸泡塊莖或穀粒或通過用溼或幹混合製劑對其進行包衣而將保護劑施於種子。在特殊情形下也可能使用其他方法，例如直接處理芽或果。
含有編碼本發明單克隆抗體或雜合毒素的DNA序列的本發明植物種子可以用種子保護劑包衣材料處理，後者包括種子處理化合物如captan，carboxin，thiram(TMTD)，methalaxyl(Apron)和pirimiphos-methyl(Actellic)和其他常用於種子處理的其他化合物。
本發明的另一目的是提供用常用於種子處理的種子保護劑包衣材料處理過的用於培育植物的植物繁殖材料，尤其是植物種子。
本發明的雜合毒素可用於保護農作物和產品不受害蟲侵害。或者可以通過適當的載體將編碼雜合毒素的基因引入微生物宿主中，並將該宿主施用於環境或植物或動物。微生物宿主可選自已知佔據一種或多種目標作物「植物圈」(葉面、葉圍、根際和/或根系)的微生物。選擇這些微生物使其在具體環境中能與野生型微生物成功地競爭，穩定地保持並表達多肽殺蟲劑的基因，最好是提高對該殺蟲劑的保護以抵抗環境降解和滅活。
這種微生物包括細菌、藻類和真菌。特別有意義的微生物例如有細菌如芽孢桿菌、柄桿菌、Agmenellum、假單胞菌、歐文氏菌、沙雷氏菌、科雷伯氏菌、黃單胞菌、鏈黴菌、根瘤菌、紅假單胞菌、Metylius、農桿菌、醋桿菌、乳桿菌、節桿菌、固氮菌、明串珠菌和產鹼菌；真菌特別是酵母如酵母、隱球酵母、克魯維酵母、擲孢酵母、紅酵母和短梗黴。特別是下列植物圈細菌種類如丁香假單胞菌、螢光假單胞菌、粘質沙雷氏菌、木醋桿菌、球形紅假單胞菌、野油菜黃單胞菌、苜蓿根瘤菌、真養產鹼菌、Clavibacter xyli和維涅蘭德固氮菌；和植物圈酵母種類，如深紅酵母、紅酵母、海濱紅酵母、橙黃紅酵母、淺白隱球酵母、流散隱球酵母、變黃羅倫隱球酵母、羅斯酵母、普地酵母、釀酒酵母、擲孢酵母、香氣擲孢酵母、佛地克魯維酵母和出芽短梗黴。特別是那些產色素微生物。
微生物重組菌株中新型雜合毒素基因的應用示於實施例7中。應該認識到本發明分離的新型雜合毒素基因可以轉移到任何微生物宿主中並用該宿主提供其殺蟲特性。本發明新型雜合毒素基因的替代宿主的選擇要適應以下目的克隆目的，鑑定基因或所編碼蛋白的形式和功能的目的，用作發酵宿主以提高雜合毒素蛋白產量的目的，更有效地將至少一種雜合毒素蛋白輸送至靶昆蟲害蟲的目的，或將該新型雜合毒素基因引入昆蟲病原體如杆狀病毒[一種多核型多角體病毒，如[苜蓿銀紋夜蛾病毒]以提高其效力的目的。
可以用本領域所認同的各種方法將新型雜合毒素基因或其重組形式轉化至這種替代宿主中。一種優選方法是微生物細胞電穿孔法，如Dower(美國專利5,186,800)中所述。另一種優選方法是Schurter等描述的方法(分子和普通遺傳學.218177-181(1989))，這種方法的描述還見於EP-A0342633，其整個內容併入本文作為參考。
預想這種替代宿主可施用於環境、植物或動物以防蟲害。微生物宿主可選自已知佔據一種或多種目標作物「植物圈」(葉面、葉圍、根際和/或根系)的微生物。選擇這些微生物使其在具體環境中能與野生型微生物成功地競爭，穩定地保持並表達多肽殺蟲劑的基因，最好是提高對該殺蟲劑的保護以抵抗環境降解和滅活。
本發明還提供殺蟲組合物，其中含有作為活性成分的至少一種本發明新型雜合毒素或含有至少一種重組形式的新毒素基因的重組微生物，以及農用佐劑如載體、稀釋劑、表面活性劑或應用促進佐劑。該組合物還可以含有其他生物活性化合物。這種化合物可以是肥料或微營養提供劑或其他影響植物生長的製劑。它還可以是選擇性除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或這些製劑中幾種的混合物，適當時還可以包含其他通常用於製劑領域中的農用載體、表面活性劑或應用促進佐劑。適當載體和佐劑可以是固體或液體並相當於製劑技術中通常使用的物質，例如天然或再生的礦物質、溶劑、分散劑、潤溼劑、增稠劑、粘合劑或肥料。
該組合物可含有0.1-99％(重量)的活性成分，1-99.9％(重量)的固體和液體佐劑，和0-25％(重量)的表面活性劑。包括至少一種本發明的新型雜合毒素或含有至少一種重組形式新毒素基因的重組微生物的活性成分或含有所述活性成分的組合物，可以與某些其他殺蟲劑或化學物質一起使用於待保護的植物或作物而不喪失其效力(1993作物保護化學品目錄，化學品和藥品出版社，加拿大)。可以用粉塵劑、懸浮劑、可溫性粉末或其他適於農業應用的任何形式來施用。
本發明還提供控制或抑制昆蟲害蟲的方法，包括將含至少一種本發明的新型雜合毒素或含有至少一種重組形式新毒素基因的重組微生物的活性成分或含有所述活性成分的組合物施用於(a)該害蟲可能存在的環境，(b)植物或植物部分以保護所述植物或植物部分免受害蟲的侵害，或(c)種子以保護從所述種子發生的植物免受害蟲的侵害。
植物保護方面一種優選的施用方法是施用於植物的葉上(葉施用)，使用數量和頻率取決於待保護的植物和目標害蟲侵害的機率。但是如果用液體製劑浸潤植物栽種地或者將活性成分以固體形式摻入植物栽種地如以顆粒形式摻入土壤中(土壤施用)，活性成分也可以通過根滲透到植物中(系統作用)。對於稻田，可以向澆灌後的稻田中施用定量的這種粒劑。
本發明的組合物還適用於保護植物繁殖材料免受蟲害，例如種子如果實、塊莖或穀粒，或植物切塊。這些繁殖材料在種植前可以用製劑處理例如種子在播種前進行敷裹(dressed)處理。還可以將本發明活性成分施用於穀粒(包衣)，用液體製劑浸泡穀粒或用固體製劑進行包衣。當植物材料進行栽種時還可以將該製劑施用於栽種地，例如播種時用於種子的犁溝中。本發明還涉及處理植物繁殖材料的方法和這樣處理後的植物繁殖材料。
含有作為活性成分的含至少一種重組形式新毒素雜合基因的微生物的本發明組合物，可以用任何已知方法用細菌菌株處理種子或土壤。例如見美國專利4,863,866。甚至非活體微生物菌株也可以對害蟲防治有效。但優選使用活體微生物。
本發明範圍內待保護的靶作物包括，例如下列植物種類穀物(小麥、大麥、黑麥、燕麥、稻、帚蜀黍和相關的作物)，甜菜(甜菜和抹甜菜)，糧草(鴨茅、田邊草等)，核果，梨果和軟果(蘋果、梨、李子、桃子、杏、櫻桃、草莓、覆盆子和黑梅)，豆科植物(豆、扁豆、豌豆、大豆)，油料植物(油菜、芥菜、罌粟、橄欖、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生)，瓜類植物(黃瓜、食用葫蘆、甜瓜)，纖維植物(棉花、亞麻、大麻、黃麻)，柑橘水果(橘子、檸檬、柚子、橘)，蔬菜(菠菜、萵苣、蘆筍、甘藍和其他芥科植物、洋蔥、番茄、馬鈴薯、幹紅椒)，月桂科(鱷梨、胡蘿蔔、肉桂、樟腦)，楓樹和針葉樹(如菩提樹、紫杉樹、赤楊、白楊、樺樹、樅樹、落葉松、松樹)，或諸如玉米、菸草、漿果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄樹、蛇麻草和天然橡膠的植物，以及裝飾植物(包括植物組合)。
含有至少一種重組形式新基因的重組微生物一般以殺蟲組合物的形式施用，可以與其他生物活性化合物一起同時或相繼施用於作物區或待處理的植物。這些化合物可以是肥料或微營養提供劑或其他影響植物生長的製劑。它們還可以是選擇性除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或這些製劑中幾種的混合物，適當時還可以包含其他通常用於製劑領域中的農用載體、表面活性劑或應用促進佐劑。
本發明的活性成分可以以原始形式使用或與任何適當的農用載體一起使用。這種載體是通常用於農業製劑領域中的佐劑，從而可以按一種方法配製成可乳化濃液、可包衣漿液、可直接噴霧的或可稀釋的溶液、稀乳液、可溼性粉末、可溶性粉末、粉塵劑、粒劑以及包囊製劑，如聚合物包囊。像組合物的性質一樣，施用方法如噴霧、噴灑、撒粉、分散或灌注，要根據目標物和分布環境來選擇。有利的施用量一般是每公頃(ha，約2.471英畝)約50克-5千克活性成分(a.i.)，優選約100克-2千克活性成分/公頃。重要的施用量是約200克-1千克活性成分/公頃，和200克-500克活性成分/公頃。種子覆裹的有利用量是每100千克種子0.5克-1000克活性成分，優選3克-100克活性成分/100千克種子，或10克-50克活性成分/100千克種子。
適當載體和佐劑可以是固體或液體並相當於製劑技術中通常使用的物質，例如天然或再生的礦物質、溶劑、分散劑、潤溼劑、增稠劑、粘合劑或肥料。製劑，即包含作為活性成分的含重組形式新基因的重組微生物、或還含其他活性成分、適當時還含有固體或液體佐劑的殺蟲組合物、製劑或混合物，按已知方法製備，例如將活性成分與補充劑如溶劑、固體載體和有時使用的表面活性劑混勻和/或研磨。
適當的溶劑是芳香烴，優選含8-12個碳原子的級分，如二甲苯混合物或取代的萘，鄰苯二甲酸酯如鄰苯二甲酸二丁酯或鄰苯二甲酸二辛酯，脂肪烴如環己烷或石蠟，醇或二元醇和其醚和酯如乙醇、乙二醇單甲醚或單乙醚，酮如環己酮，強極性溶劑如N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亞碸或二甲基甲醯胺，以及植物油或環氧化的植物油如環氧化椰子油或豆油；或水。
例如用於粉塵劑和可分散粉末的固體載體一般是天然無機填料，如方解石、滑石、高嶺土、蒙脫石或白土。為了改進物理性能還可能加入高分散矽酸或高分散吸附性聚合物。適當的吸附性顆粒載體是多孔型的，例如浮石、碎磚、海泡石、膨潤土；和適當的非吸附性載體是諸如方解石和沙子等材料。另外可以使用許多預製粒的無機或有機材料，例如白雲石或粉碎的植物殘體。
根據要配製的活性成分的性質，適當的表面活性化合物是具有良好的乳化、分散和潤溼特性的非離子型、陽離子型和/或陰離子型表面活性劑。「表面活性劑」一詞還可以理解為包括表面活性劑混合物，陰離子表面活性劑既可以是水溶性皂也可以是水溶性合成表面活性化合物。適當的皂是高級脂肪酸(C10-C22)的或可從如椰子油或脂油獲得的天然脂肪酸混合物的鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或取代或未取代的銨鹽。適當的表面活性劑還有脂肪酸甲基牛膽鹼鹽以及改性或未改性的磷脂。
但更常用的是所謂的合成表面活性劑，尤其是脂肪磺酸鹽、脂肪硫酸鹽、磺化的苯並咪唑衍生物或烷基芳基磺酸鹽。脂肪磺酸鹽或脂肪硫酸鹽一般是鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或取代或未取代的銨鹽形式，一般含有8-22個碳原子的烷基殘基，這也包括醯基的烷基部分，例如木素磺酸的、十二烷基硫酸的或從天然脂肪酸得到的脂肪醇硫酸酯混合物的鈉鹽或鈣鹽。這些化合物還包括硫酸酯的和磺酸的脂肪醇/環氧乙烷加合物的鹽。磺化苯並咪唑衍生物優選含有2個磺酸基團和1個含約8-22個碳原子的脂肪酸殘基。烷基芳基磺酸鹽的實例有十二烷基苯磺酸的、二丁基萘磺酸的或萘磺酸/甲醛縮合產物的鈉鹽、鈣鹽或三乙醇胺鹽。相應的磷酸鹽也適用，例如對壬基苯酚與4-14摩爾環氧乙烷的加合物磷酸酯的鹽。
非離子型表面活性劑優選是脂肪醇或環脂醇的、或飽和或不飽和脂肪酸及烷基苯酚的聚乙二醇衍生物，所述衍生物包含3-30個乙二醇醚基團，烴基部分包含8-20個碳原子，烷基苯酚的烷基部分含6一18個碳原子。
其他非離子型表面活性劑有聚環氧乙烷與聚丙二醇，乙二胺基聚丙二醇和烷基鏈中含1-10個碳原子的烷基聚丙二醇的水溶性加合物，該加合物含有20-250個乙二醇醚基團和10-100個丙二醇醚基團。這些化合物通常含有1-5個乙二醇單元/丙二醇單元。非離子型表面活性劑的代表性實例是壬基苯酚聚乙氧基乙醇，蓖麻油聚乙二醇醚，聚氧化丙烯/聚氧化乙烯加合物，三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。聚氧乙烯脫水山梨糖醇的脂肪酸酯如聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯也是適用的非離子型表面活性劑。
陽離子表面活性劑優選是季銨鹽，其中作為N-取代基含有至少一個C8-C22烷基，作為其他取代基含有滷代的或未取代的低級烷基、苄基或羥基低級烷基。這種鹽優選是滷化物、甲基硫酸鹽或乙基硫酸鹽形式，例如硬脂基三甲基氮化銨或苄基二-(2-氯乙基)乙基溴化銨。
製劑領域中常用的表面活性劑在下列文獻中有述，例如Ridgewood，N.J.的MC出版公司1979出版的「McCutcheon』表面活性劑和乳化劑手冊」；Helmut Stache博士的「表面活性劑手冊」Cart Hanser Verlag，慕尼黑/Vienna。
本發明殺蟲劑組合物的另一特別優選的特徵是施用於植物和土壤時的活性成分的持久性。引起活性損失的可能原因包括紫外線、熱、葉的滲出液和pH的滅活作用。本發明殺蟲組合物的製劑可以通過加入有助於防止活性成分損失的添加劑或將物料以保護活性成分不被滅活的方式進行包囊從而解決這些問題。可以用化學方法(McGuire和Shasha，經濟昆蟲學雜誌851425-1433，1933)或生物方法(Bames和Cummings，1986；EP-A 019239)進行包囊。化學包囊法包括將活性成分用聚合物包衣，而生物包囊法包括雜合毒素基因在微生物中的表達。對於生物包囊，在製劑中使用含有雜合毒素蛋白的完整微生物作為活性成分。加入紫外防護劑可有效地降低輻射破壞。通過加入適當的添加劑可以控制由熱導致的失活。
本發明有效的製劑包含營養細胞或更優選孢子形式(如果有的話)的微生物作為活性成分，例如適當的製劑可以由用多價陽離子交聯並含有這些微生物的聚合物凝膠組成。這種方法例如在「植物病理學」75卷7期774-777頁(D.R.Fravel等，1985)有述，其中用藻酸鹽作為聚合物材料。從該出版物還已知載體材料可以同時使用。這種製劑一般是通過混合天然或合成的成膠聚合物如藻酸鹽和多價金屬離子的鹽水溶液形成單一的小滴形式，微生物可能懸浮在兩種反應溶液的一種或兩種中。以液滴形式混合時開始形成凝膠、然後可能幹燥這些凝膠顆粒。這種方法稱為離子膠凝。根據乾燥的程度，形成了緊密而堅固的聚合物顆粒，其結構通過多價陽離子交聯並含有微生物，並且載體可控制地均勻分布在其中。顆粒大小可達到5mm。
在EP-A1-0097571中描述了一種基於部分交聯多糖的組合物，其中除微生物外例如還可以含有研細的矽酸作為載體材料，例如通過二價鈣離子進行交聯。這種組合物的水活性不超過0.3。W.J.Cornick等在一篇綜述中[生物防治方法的新趨勢抑制農業害蟲和疾病的替代方法，345-372頁，Alan R.Liss公司，1990]描述了各種製劑系統，提到了用蛭石作為載體的顆粒和通過離子膠凝方法製備的藻酸鹽密珠。D.R.Fravel在殺蟲劑製劑和應用系統第11卷，ASTM STP 1112(美國測試和材料協會，費城，1992)173-179頁中也描述了這種組合物，這可以用來配製本發明的重組微生物。
本發明殺蟲組合物一般含有約0.1-99％，優選約0.1-95％，最優選約3-90％的活性成分，約1-99.9％，優選1-99％，最優選約5-95％的固體或液體佐劑，和約0-25％，優選0.1-25％，最優選0.1-20％的表面活性劑。
在優選實施方案中本發明殺蟲組合物一般含有0.1-99％，優選0.1-95％的含至少一種重組形式新基因的重組微生物或其與其他活性成分的混合物，1-99.9％的固體或液體佐劑，和0-25％，優選0.1-20％的表面活性劑。
但商業產品一般配製成濃液形式，最終使用者一般使用濃度很低的稀製劑。該殺蟲組合物還可以含有其他成分，例如穩定劑、防泡劑、粘度調節劑、粘合劑、增稠劑以及肥料或其他活性成分以獲得特殊效果。
存在幾種在穩定保持和表達基因的條件下將雜合毒素表達基因引入微生物宿主的方法。例如，可以構建這樣的表達盒，其中目標DNA構建物與下列元件有效地連接為表達該DNA構建物的轉錄和翻譯調節序列，與宿主序列同源的DNA序列以發生整合，和/或在宿主中起作用的複製系統，以產生整合和穩定保持。
轉錄和翻譯調節信號包括但不限於啟動子、轉錄起始位點、操縱子、活化子、增強子、其他調節元件、核糖體結合位點、起始密碼子、終止信號等。例如見美國專利5039523；美國專利4853331；EPO 0480762A2；Sambrook等，同上；分子克隆試驗室手冊，Maniatis等編，冷泉港試驗室，紐約(1982)；高級微生物遺傳學，Davis等編，冷泉港試驗室，紐約(1980)；和其中引用的文獻。
下列實施例用於說明本發明但無意於限制本發明。
試驗實施例1單克隆抗體的產生1.1免疫
將適量的抗原(大約50微克玉米根葉甲BBMV)在非油基佐劑中乳化，用於免疫一組10隻Balb/c小鼠，每兩周加強免疫。第三次加強免疫注射7天後，從小鼠取血清樣品，用如下所述的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定相對血清抗體滴度。滴度最高的一組4隻小鼠進行最後為期3天的低劑量抗原加強免疫方案(約為常規免疫中所有劑量的十分之一)，用作下述融合試驗的脾供體。
1.2融合選擇4隻比抗體滴度大於1∶5000的小鼠用於兩個融合試驗。無菌條件下取出脾，機械分散並按下述方法分離淋巴細胞。通過在0.017MTRIZMA鹼中的0.155M氯化銨溶液(Sigma化學公司，St.Louis，MO)中保溫，裂解紅細胞。細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗兩次，按下述密度梯度離心進一步純化淋巴細胞。將細胞小心地置於比重為1.065的Ficoll溶液上(Sigma化學公司，St.Louis，MO；Van Mourik等，酶學方法，121174-182(1986))，450×g離心20分鐘。含有密度大於1.065的細胞層中富集淋巴細胞，用於與骨髓餾細胞融合。
用分離的淋巴細胞和來自Balb/c的缺乏HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)的SP2/0漿細胞餾細胞系進行聚乙二醇介導的融合。淋巴細胞和骨髓餾細胞以4∶1的比例混合。徹底混合細胞混合物，離心並按下述方法融合(Oi等，Michell，B.B.和Shiigi，S.M.編的「細胞免疫學中選擇的方法」一文(Freeman，San Francisco)351-371(1980)；Fazekas等，免疫學方法雜誌，351-21(1980))。將細胞層小心地懸浮在1毫升50％聚乙二醇(PEG)中，不停地攪拌1分鐘。用無血清RPMI培養基(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)稀釋細胞，逐漸降低聚乙二醇的濃度。融合後，將融合細胞以80×g離心5分鐘，重新懸浮並以每孔105-106的總細胞密度放置在96孔板上。加入通過用20微克/毫升絲裂黴素C處理非免疫脾細胞製得的脾飼養細胞，以向融合細胞提供補充生長因子。幾天後用含有17.6微克/毫升氨基喋呤的HAT(次黃嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶)培養基選擇雜交瘤。最早在融合後3或4天，在倒置顯微鏡下篩選生長的菌落。但直到融合後10-14天才出現肉眼可見的菌落。在此階段測定每孔上清液中的比抗體分泌量。
1.3篩選當檢測在HAT選擇中存活的雜交瘤菌落時，上清液用酶聯免疫吸附試驗篩選(Engvall，酶學方法，70419(1980)，Engvall等，免疫化學，8871(1971))。簡單地講，在每孔含有大約500納克抗原的96孔微滴定板中培養雜交瘤細胞。如Engvall等在文獻中描述的那樣，適當的洗滌步驟後，用與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的羊抗鼠第二抗體鑑定結合的抗體。再經洗滌步驟後，用產色底物定量測定每孔中的酶活性。用自動ELISA讀數器測定492nm處的吸光度(OD492)，以鑑定陽性菌落。對那些與玉米根葉甲BBMV強結合的雜交瘤細胞系再進行三次ELISA篩選，以排除那些也與哺乳動物或植物結合的單克隆抗體。更具體地講，使用兔腸刷狀緣膜和玉米葉微粒體膜製劑進行這些ELISA。還包括一次鑑定與歐洲玉米鑽蛀蟲BBMV有交叉活性的細胞系的ELISA。
按下述方法克隆那些其分泌的抗體與玉米根葉甲BBMV抗體結合但不與哺乳動物和植物蛋白結合的雜交瘤菌落。
1.4克隆在此階段，將那些分泌具有顯著抗原特異性之抗體的雜交瘤，在96孔板中以0.5、1和5個細胞/孔的靶濃度培養並克隆。提供生長因子(Sugasawara等，免疫學方法雜誌，79276-275(1985))以促進雜交瘤細胞從限定的密度生長。2-3周後克隆足夠大時，用「篩選」中描述的ELISA方法鑑定陽性克隆。然後擴增代表性的克隆以產生抗體。
1.5腹水生產將該雜交瘤作為姥鮫烷致敏的Balb/c小鼠(Brodeur等，免疫學方法雜誌，71265-272(1984))中的腹水瘤生長，從而大量地產生適當的單克隆抗體。收集腹水，透析後的腹水通過蛋白A色譜部分純化抗體。形成的抗體製劑分成等份冷凍。
能產生在本發明中有用的單克隆抗體的細胞系列於表1中。這些雜交瘤細胞繫於1994年4月19日保藏在美國典型培養物保藏中心(美國，12301 Parldawn Drive，Rockville，MD20852)，ATCC保藏號示於表1中。
表1玉米根葉甲BBMV單克隆系
實施例2刷狀緣膜小泡(BBMV)的分離2.1玉米根葉甲BBMV的分離基於Wolfersberger等描述的(化合物·生化·生理，86A301-308(1987))、English和Readdy(昆蟲生物化學，19145-152(1989))改進的方法製備這些小泡。將第三齡幼蟲的腸用Potter-Elvenhem勻漿器在冰冷的50mM蔗糖、2mM Tris-Cl(pH7.4)、0.1mM苯基甲磺醯氟中勻漿化。加入氯化銫至10mM，在冰上攪拌勻漿物15分鐘。4℃下4300×g離心10分鐘，棄去沉澱。上清液以27000×g離心10分鐘，將沉澱重新懸浮在0.32M的蔗糖中。將此懸浮液通過一27號針，於-70℃下保存。
2.2歐洲玉米鑽蛀蟲BBMV的分離從第5齡歐洲玉米鑽蛀蟲(ECB)切出腸，縱向切開除去其中的食物和圍食膜。用上述方法分離ECB的BBMV。
2.3植物微粒體的分離玉米植物(黑暗中，28℃生長72小時)的葉或根組織，用研缽和杵在等體積的0.3M磷酸鉀pH7.4，5mM DTT和1％(重量/體積)PVPP中研磨。將混合物用四層薄棉布過濾，然後以10000×g離心15分鐘。上清液再以100000×g離心60分鐘，將沉澱重新懸浮在0.1M磷酸鉀pH7.4中。
2.4哺乳動物腸BBMV的分離用與分離昆蟲腸刷狀緣膜小泡相似的方法，從兔十二指腸和基質(Kessler等，BBA 506136-154(1978))的黏膜表面製備哺乳動物的刷狀緣膜。洗滌新鮮的兔十二指腸和下胃的黏膜襯，從基質下分離黏膜層。將該材料懸浮在十倍體積的冰冷的50mM蔗糖，0.1mM PMSF，2mM Tris-HCl(pH7.4)中，用15衝程(stroke)勻化器在冰上勻化。加入氯化鈣至終濃度為10mM，在冰上攪拌混合物15分鐘，4℃下以4300×g離心勻漿10分鐘。收集上清液再以27000×g離心10分鐘。將沉澱重新懸浮在0.32mmol蔗糖中，-70℃冷凍。
實施例3玉米根葉甲BBMV單克隆細胞系的鑑定將ELISA中與玉米根葉甲BBMV強結合的單克隆細胞系進行進一步篩選，以選擇不與玉米微粒體也不與哺乳動物微粒體交叉反應的克隆。用玉米葉和根微粒體和兔腸膜小泡進行進一步的ELISA。所有的細胞系同時對歐洲玉米鑽蛀蟲BBMV蛋白進行篩選。從篩選的78個細胞系中分離到了對玉米根葉甲特異的11個系。除此之外還分離到與歐洲玉米鑽蛀蟲BBMV交叉反應的4個系。這15個細胞系代表分泌IgG1、Ig2a、IgG2b、IgG3和IgM的單克隆細胞系。通過western印跡分析這些單克隆細胞系以證實其玉米根葉甲特異性和對兔微粒體或玉米微粒體的無交叉反應性。還鑑定了抗體與各種玉米根葉甲BBMV蛋白的特異結合，示於

圖1中。發現了5中不同的結合方式兩種是對一種或兩種蛋白特異的，其他三種代表與7-15種蛋白的結合。與7-15種蛋白結合的這一組基於其結合方式進一步分為A、B、C三小類。
3.1單克隆細胞系的western分析按如上所述製備刷狀緣膜小泡並在8-16％丙烯醯胺SDS蛋白凝膠(Novex，San Diego，CA)上進行電泳。將蛋白轉印到硝基纖維素膜上(Burnette，W.N.，Western印跡，112195(1981))，然後與雜交瘤細胞系的上清液結合。抗體與印跡蛋白的結合用標準方法顯影(例如見，抗體實驗室手冊，E.Harlow和D.Lane，冷泉港，1988，和其中所引的文獻)。
實施例4玉米根葉甲結合性抗體域的克隆獲取玉米根葉甲特異性抗體基因的各種方法是已知的。一種方法是在噬菌體中克隆一個抗體基因的隨機文庫並針對與玉米根葉甲腸蛋白的結合能力篩選該文庫。另一已知方法是製備與玉米根葉甲腸蛋白結合的單克隆抗體，然後從這種抗體系克隆抗體基因。本實施例中使用第二種方法。利用恆定區中的保守DNA序列和可變區的支架區作為引物並用聚合酶鏈反應擴增，可以從雜交瘤細胞克隆得到抗體基因。這種方法的一般性描述見Mullis等，酶學方法，155335-350(1987)；Erlich(編)，PCR技術，Stockton出版社(紐約1989)。已成功地利用了Kabat等收集的小鼠重鏈和輕鏈序列資料庫來產生用於抗體基因克隆的同型特異性引物和降解引物(Kabat，E.A.等，1987，美國Dept Health and Human Services，美國政府出版局，和Jhons等，1991，生物技術988-89)。另外，克隆較小的具有原始抗體結合特性的抗體片段(Fab)的技術是熟知的。全抗體是大分子(150kDa)，但是小得多的Fab和Fv抗原結合片段(12kDa-50kDa)已顯示保留了全部結合親和力。其中Vh和VI區由一親水柔性肽連接的單鏈Fv片段已成功地用於靶酶，並對特異細胞有毒性(Bird(1988)科學423423-426和Huston(1988)PNAS 855879-5883)。小至20個胺基酸稱為最小識別單位(mru)的單鏈Vh區(Dab)和單鏈互補決定區也用於抗原結合(Ward(1989)自然341544-546和Taub(1989)，生物化學雜誌.264259-265和Willams(1989)PNAS 865537-5541)。因此，可以將玉米根葉甲特異結合區減小到很小的片段。
4.1通過PCR克隆抗體基因使用聚合酶鏈反應技術和特異寡核苷酸引物克隆免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的某個區。從上述Kabat資料庫選擇了對IgM和三種IgG同型的重鏈和輕鏈特異的PCR引物。設計成熟可變區氨基末端編碼區的引物使其從第一支架區起始，並在製備中使用一些密碼子簡併，使它們可用作「通用引物」。用於可變區特異PCR擴增的3』』引物是從重鏈和輕鏈的第一恆定域(CH1)的保守序列設計得來的。對免疫球蛋白同型IgG1(3B1和17F6)、IgG3(10B6)和IgM(2B5)使用一種不同的3』引物。可以用IgG1所用的相同引物擴增同型IgG2A和IgG2B。將抗體可變區克隆到含有內質網信號肽和分別含IgG1輕鏈和重鏈的輕鏈(pCIB4612)和重鏈(pCIB4611)表達載體中。
表2顯示用於PCR克隆小鼠免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區的引物結構。或者，可以使用的引物序列可以在出版的文獻中找到(Coloma等，生物技術，11152-156，1991；Jones等，生物技術，988-89，1991)。用下述標準條件在應用生物系統DNA合成儀380B(應用生物系統，福斯特城，CA)合成寡核苷酸。這些PCR引物含有限制性位點，在擴增和消化後克隆到CaMV 35S啟動子控制下的一種植物表達載體中。選擇的限制性位點是已知在已測序的抗體基因中不存在的。
表2用於抗體基因擴增的PCR引物pCIB4614，pCIB4616，pCIB4625，pCIB4636和pCIB4617中的3B1，2B5，10B6，14G1和17F6輕鏈可變區NC925』引物5＇-GTC TCG AGG AYA TYS WGM TSA CCC ART CT-3』(SEQ ID NO37)NC1303』引物5＇-GCA GAT CTA GTT GGT GCA GCA TCA GCC CG-3』(SEQ ID NO38)pCIB4613和pCIB4609中的3B1和17F6重鏈可變區NC915』引物5＇-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3』(SEQ ID NO39)NC1143』引物5＇-GCA GAT CTA GAT CCA GGG GCC AGT GGA TA-3』(SEQ ID NO40)pCIB4615中的2B5重鏈可變區NC915』引物5＇-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3』(SEQ ID NO39)NC1113』引物5＇-GCA GAT CTG CAG GAG ACG AGG GGG AAG ACA TT-3』(SEQ ID NO41)pCIB4637中的10B6重鏈可變區DB915』引物5＇-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3』(SEQ ID NO48)NC1173』引物5＇-GCA GAT CTG CAG CCA GGG ACC AAG GGA TA-3』(SEQ ID NO42)pCIB4635中的14G1重鏈可變區DB915』引物5＇-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3』(SEQ ID NO48)DB1143』引物5＇4CAA TTC GCA TAT GAG ATC CAG GGG CCA GTG GAT A-3』(SEQ ID NO49)Y＝C或T；S＝C或G；W＝A或T；M＝C或A；R＝A或G從雜交瘤細胞系分離的Poly-A+RNA用於產生cDNA第一鏈以用於以後的PCR反應。利用快速微量mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司，SanDiego，CA)，基於硫氰酸胍裂解和oligo(dT)纖維素純化的方法，從108個雜交瘤細胞中提取Poly-A+RNA。從108個細胞中提取的RNA中約十分之一用於產生cDNA第一鏈。將RNA與脫氧核苷酸(每種dNTP 0.2mM)、5微克作為引物的隨機六聚物pd(N6)(Pharmacia LKB生物技術公司，Piscataway，NJ)、50單位莫落尼氏白血病毒逆轉錄酶(Pharmacia LKB生物技術公司，Piscataway，NJ)和1×PCR緩衝液的混合物在42℃保溫30分鐘，然後於95℃加熱5分鐘，反應體積為100微升。該cDNA第一鏈反應液用苯酚-氯仿提取，並通過大小排阻旋轉柱(Chroma Spin30，Clontech實驗室，Palo Alto，CA)以除去隨機六聚物。然後，按照Perkin-Elmer Cetus擴增試劑盒的說明，向含有免疫球蛋白特異性引物的50微升PCR反應混合物中加入十分之一(或10微升)的cDNA第一鏈反應液。用Perkin-ElmerCetus Thermal Cycler擴增該混合物20個循環。PCR所有的溫度和時間如下94℃變性1分鐘；52℃退火1.5分鐘；72℃延伸1分鐘。PCR產物在6％丙烯醯胺凝膠(Novex，Encinitas，CA)上電泳，從凝膠條上純化DNA。將凝膠條在200微升TE中研細，通過Ultrafree-MC Millipore柱(Millipore，Bedford，MA)離心而純化。洗脫液用50微克/毫升蛋白酶K在37℃處理30分鐘，用苯酚-氯仿-異戊醇(50∶48∶2)提取，然後用氯仿提取並用乙醇沉澱。將DNA懸浮在40微升TE中，用適當的限制酶消化。抗體可變區的PCR產物用XhoI和Bgl II消化，按上述方法再用6％丙烯醯胺凝膠純化。最後將Xho I/BglII片段連接到用Xho I和Bgl II消化的輕鍊表達載體(pCIB4612)或重鍊表達載體(pCIB4611)中。表達載體pCIB4612含有CaMV 35S啟動子和終止序列，及19個胺基酸信號肽序列和輕鏈恆定區CH1。輕鏈可變區克隆在Xho I/Bgl II位點以表達全長的輕鏈。
所有抗體基因除10B6的重鏈和14G1的重鏈和輕鏈外都按上述方法克隆。後幾種抗體基因從PCR產物克隆，但產物在6％丙烯醯胺TBE凝膠上分離，從凝膠上切下的片段用0.7M LiCl+2mM EDTA洗脫，沉澱並重新懸浮在10mM Tris+2mM EDTA(pH7.5)中。分離的PCR產物直接連接到來自pUC的克隆質粒pTBlue T(Novagen公司)中。因為Taq DNA聚合酶使反應產物具有單鏈3』A-核苷酸粘端(Clark，核酸研究，169677(1988))，這些產物可以直接克隆到含有相容性單鏈T-核苷酸粘端的載體中(Marchuk等，核酸研究，191154(1990))。
pCIB4612載體是將來自小鼠IgK鏈的155個鹼基對的Dde I/Sty I輕鏈恆定區(Schulze-Gahmen等，1988，生物化學雜誌，26317100-17106；Katat等，美國健康和人體事物部，美國政府出版局(1987))以四種方式與71bp的Xho I/Dde I片段、101bp的Sty I/Bgl II片段和來自pCIB4610的3.8Kb的Xho I/Bgl II載體片段連接製得的。寡核苷酸KE109A28和KE110A28雜交以製備具有Sty I和Bam HI交錯切割末端的101bp片段。KE109A285＇-CAA GGA CGA GTA TGA ACG ACA TAA CAG CTA TAC CTGTGA GGC CAC TCA CAA GAC ATC AAC TTC ACC CAT TGT CAA GAG CTTCAA CAG GAA TGA GTG TTA GG- 3＇(SEQ ID NO19)KE110A285＇-GAT CCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACAATG GGT GAA GTT GAT GTC TTG TGA GTG GCC TCA CAG GTA TAG CTGTTA TGT CGT TCA TAC TCG TC- 3＇(SEQ ID NO20)寡核苷酸KE111A28和KE112A28雜交以製備具有Xho I和Dde I交錯切割末端的71bp片段。KE111A285＇-TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GTA TCC ATC TTCCCA CCA TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC-3＇(SEQ IDNO21)KE112A285＇-TGA GGC ACC TCC AGA TGT TAA CTG CTC ACT GGA TGGTGG GAA GAT GGA TAC AGA TCT AGA GCT CGG TAC CC-3＇(SEQ IDNO22)載體pCIB4611含有重鏈恆定區CH1-CH3，同樣可以將重鏈可變區克隆到Xho I/Bgl II位點，以表達全長的重鏈。pCIB4611是這樣製備的將來自小鼠IgGG1γ鏈的Nco I/Bst XI902bp重鏈恆定區(Honjo等，1979，自然，277627-633；Katat等，美國健康和人體事物部，美國政府出版局(1987))與兩個40bp的雜交寡核苷酸片段連接，將最後的982bp片段連接到用Bgl II和Xho I消化的pCIB4610中。其中一個40bp片段從寡核苷酸KE106A28和KE107A28雜交得到並具有Xho I/Nco I交錯切割末端，另一個40bp片段從寡核苷酸KE108A28和KE105A28雜交得到並具有BstXI/Bam HI交錯切割末端。KE106A285＇-TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GCT GCC CAA ACTAAC TO-3＇(SEQ ID NO23)KE107A2285＇-CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AGA TCT AGA GCT CGGTAC CC-3＇(SEQ ID NO24)KE108A285＇-CTG GTA AAG GCG GCC GCA TCG ATT AAG TCG ACC CGCGGG- 3＇(SEQ ID NO25)KE105A285＇-GAT CCC CGC GGG TCG ACT TAA TCG ATG CGG CCG CCTTTA CCA GGA GA- 3＇(SEQ ID NO26)pCIB4610載體在CaMV 35S啟動子和CaMV 35S終止子序列之間含有19胺基酸小鼠內質網信號肽序列。pCIB4610載體通過Bam HI和HpaI消化的pCIB4600與83bp的PCR產生的Bam FI和Hpa I消化片段連接而製成。該PCR片段是用pCIB4600作為模板用引物KE102A28和KE101A28製得的。pCIB4610和pCIB4600的區別僅在於CaMV 35S啟動子後的非翻譯引導區。pCIB4610含有植物的保守翻譯起始序列AACAATG(SEQ ID NO27)，其中ATG是翻譯起始處，pCIB4600含有序列TCCG ATG(SEQ ID NO28)。
KE102A285＇-CGA AGT TAA CAG ATC TAG AGC TCG G-3＇(SEQ ID NO29)KE101A285＇-CGG GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TT-3＇(SEQ ID NO30)通過用Bam HI和Sac I消化的CaMV 35S表達載體pCIB710(Rothstein等，1987，基因，53153-161)衍生物與編碼內質網信號肽的86bp Bam HI/Sac I(Katat等，美國健康和人體事物部，美國政府出版局(1987))片段連接製備載體pCIB4600。該86bp片段含有下列序列5＇-GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCAGTT GTT ACC CTA CCT CGA CCT AGA AAG AGA AGG AGG ACA GTG GAGCTG CAG GTG TCC ATT GCC TAC TCG AGG GTA CCG AGC TCC TCG ACGTCC ACA GGT AAC GGA TGA GCT CCG ATG GC- 3＇(SEQ ID NO31)從玉米根葉甲單克隆抗體系將重鏈和輕鏈可變區克隆到表達載體中產生下列構建物pCIB46133B1重鏈可變區pCIB46143B1輕鏈可變區pCIB46152B5重鏈可變區(NRRL B-21216)pCIB46162B5輕鏈可變區(NRRL B-21217)pCIB460917F6重鏈可變區(NRRL B-21215)pCIB461717F6輕鏈可變區(NRRL B-21218)pCIB463710B6重鏈可變區(NRRL B-21279)pCIB462510B6輕鏈可變區(NRRL B-21219)pCIB463514G1重鏈可變區(NRRL B-21277)pCIB463614G1輕鏈可變區(NRRL B-21278)pCIB46313B1輕鏈和重鏈可變區(NRRL B-21220)後面注有NRRL號的上述表達載體已於1994年3月7日保藏在「北方地區研究中心」的農業研究部專利培養物保藏中心(NRRL)(美國伊利諾州，61604，Peoria，北方大學街1815)，其中pCIB4637、pCIB4635和pCIB4636是在1994年6月3日保藏的。
表3列出了可變區序列的序列號。pCIB4613、pCIB4617、pCIB4625、pCIB4637、pCIB4635和pCIB4636的序列是完整的可變區，從可變區的第一支架區的第一個密碼子開始以第四支架區的最後一個密碼子結束。pCIB4609是不完整的，編碼序列的5』末端被截去，從可變區的第二個CDR區開始。
表3
抗體鏈DNA序列SEQ ID NO13B1重鏈可變區DNASEQ ID NO23B1重鏈可變區蛋白SEQ ID NO33B1輕鏈可變區DNASEQ ID NO43B1輕鏈可變區蛋白SEQ ID NO52B5重鏈可變區DNASEQ ID NO62B5重鏈可變區蛋白SEQ ID NO72B5輕鏈可變區DNASEQ ID NO82B5輕鏈可變區蛋白SEQ ID NO917F6重鏈可變區DNASEQ ID NO10 17F6重鏈可變區蛋白SEQ ID NO11 17F6輕鏈可變區DNASEQ ID NO12 17F6輕鏈可變區蛋白SEQ ID NO13 10B6重鏈可變區DNASEQ ID NO14 10B6重鏈可變區蛋白SEQ ID NO15 10B6輕鏈可變區DNASEQ ID NO16 10B6輕鏈可變區蛋白SEQ ID NO17 3B1輕鏈可變區DNASEQ ID NO18 3B1輕鏈可變區蛋白SEQ ID NO44 14G1重鏈可變區DNASEQ ID NO45 14G1重鏈可變區蛋白SEQ ID NO46 14G1輕鏈可變區DNASEQ ID NO47 14G1輕鏈可變區蛋白4.2 DNA寡聚物的合成利用應用生物系統380B型DNA合成儀和標準的操作步驟合成DNA寡聚物。在一0.2μmol寬孔小量ABI柱進行新式的SSCAF3循環。最後的步驟是去除三苯甲基並用380B自動裂解循環將寡聚物從柱上解下。然後寡聚物在過量氫氧化銨中55℃解封8-12小時。然後在一蒸發器中用氮氣乾燥，再將寡聚物重新懸浮在0.25-0.5ml去離子水中。
4.3合成DNA寡聚物的純化將每種寡聚物的等份與等體積藍染料/甲醯胺混合物混合，終溶液中含有0.05％的溴酚藍、0.05％的二甲苯苯胺FF和25％的甲醯胺。將混合物在95℃加熱10分鐘使寡聚物退火。上樣於含7M脲的12％聚丙烯醯胺-脲(Sambrook等)上。用Vertical Slab Gel Unit(Hoefer科學儀器，舊金山，CA)在300-400伏電泳3-4小時後，用紫外顯示儀確定凝膠上正確大小片段的位置，然後用剃鬚刀片切下。將純化的凝膠片段切碎並在0.4MLiCl，1mM EDTA(pH8)緩衝液中37℃保溫過夜。
使用下列兩種方法中的任何一種從聚丙烯醯胺凝膠殘留物中分離寡聚物Gel/X(Genex公司，Gaitherburg)微孔聚乙烯過濾單元或Milliporeultrafree-MC0.45微米過濾單元。純化的寡聚物用乙醇沉澱，在微量離心管中4℃離心20分鐘回收，最後重新懸浮在TE(10mM Tris，1mMEDTA，pH8.0)中。按照260nm處的吸光度讀數，調節粘端至50納克/微升。
4.4激酶處理寡聚物每20微升激酶反應液中使用1pmol的純化寡聚物，緩衝液中含有7.0mM Tris pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，0.5mM DTT，50μg/ml BSA，3000μCi(3pmol)32P-γ-ATP和8單位的T4聚核苷酸激酶。激酶反應液在37℃保溫1小時，然後用苯酚/氯仿提取，用糖原作為載體進行三次乙醇沉澱(Tracy，製備和生物化學，11251-268(1981))。
4.5雜交寡聚物用於直接克隆將要進行雜交的寡聚物合併在一起(總DNA1-20微克)，在含有30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT和1mM dATP的1×Promega連接緩衝液中37℃下激酶處理1小時。根據總DNA的量，在該反應混合物中使用1-20單位的T4聚核苷酸激酶。將該反應置於開水浴上5分鐘終止該激酶化反應。合併寡聚物與雜交緩衝液的體積是50-100微升，調節最終鹽濃度為100mM NaCl，120mM Tris pH7.5和10mMMgCl2。合併激酶化和未激酶化的寡聚物，在開水浴中加熱5分鐘，在約4小時內慢慢冷卻到室溫。雜交的寡聚物用苯酚/氯仿提取，乙醇沉澱，並重新懸浮在17微升的TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中。用它組成終體積20微升的連接反應液(30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mMDTT、1mM ATP和3單位T4 DNA連接酶(Promega，Madison，WI))。該連接反應液在室溫保持約2小時。在用限制性內切酶酶切前和/或後和克隆到載體之前，雜交/連接片段一般在2％Nusieve瓊脂糖(FMC生物產品公司，Roclland，ME)凝膠純化。用100納克-500納克的每種片段和約等摩爾量的DNA在30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mMATP和3單位T4 DNA連接酶(Promega，Madison，WI)中組成20微升連接反應液。該連接反應液在室溫下保持2小時。連接後，用標準方法(Sambrook等)將DNA轉化到冷凍的感受態大腸桿菌細胞中，在含100微克/毫升氨苄青黴素的LB-瓊脂(Sambrook等)上挑選轉化子(見下文)。
實施例5單鏈抗體(SCA)分子的構建pCIB4631含有對玉米根葉甲BBMV特異的與抗體重鏈恆定區融合的單鏈抗體(SCA)的基因。該SCA基因包含抗體3B1輕鏈和重鏈可變區片段(來自對玉米根葉甲BBMV特異的單克隆抗體系3B1)與19胺基酸內質網信號序列的融合。在輕鏈和重鏈Fv片段之間是10個胺基酸(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO32)的接頭區(Huston等，PNAS 855879-5883(1988))。連接4.1Kb Xba I/Xho I片段(Fv重鏈恆定區CaMV 35S終止區來自pCIB4613的載體片段)、1.4Kb Xba I/Bgl II片段(CaMV 35S啟動子來自pCIB4614的輕鏈Fv片段)和具有Bgl II/Xho I交錯切割的限制酶位點末端的雜交的36鹼基對接頭片段，製得pCIB4631。
寡核苷酸KE147A28和KE182A28一起雜交以製備36鹼基對的接頭KE147A285′-GAT CTG GTG GCG GTG GCT CGG GCG GTG GTG GGTCGC-3′(SEQ ID NO33)KE182A285＇-TCG AGC GAC CCA CCA CCG CCC GAG CCA CCG CCA CCA-3′(SEQ ID NO34)如上所述在12％聚丙烯醯胺/7M脲凝膠上純化寡聚物，按標準方法利用紫外顯示儀切下正確大小的寡聚物。如上所述將寡聚物激酶化和雜交。
表達載體pCIB4631已於1994年3月7日保藏在「北方地區研究中心」的農業研究部專利培養物保藏中心(NRRL)(美國伊利諾州，61604，Peoria，北方大學街1815)，保藏號為NRRL B-21220。
實施例6單鏈抗體結合特性的鑑定單鏈抗體蛋白在分離的玉米原生質體中表達，並在Western印跡中和免疫截面實驗中的玉米根葉甲中腸橫截面上顯示與玉米根葉甲BBMV蛋白結合(Bravo等，1992，病理調查雜誌，60237-246，Bravo等，1992，病理調查雜誌，60247-253)。
6.1玉米懸浮細胞原生質體的分離將來自「汽巴種子」玉米近交系(B72型)或黑墨西哥甜菜未成熟胚培養物的胚發生懸浮培養物在27℃130rpm搖床上保持在補有3％蔗糖和2毫克/升2，4-D的N6基礎培養基中(Chu等，1975)，每周分培。分培1-2天後收集懸浮細胞並重新懸浮在酶溶液中(3％纖維素酶RS+1％macerozymeR10溶於KMC8.7g/l KCl，12.5g/lCaCl2，16.4g/l MgSO4，5g/lMES，pH5.7)，每20毫升酶溶液加2毫升體積的壓緊細胞。將細胞分裝在100×25mm的培養皿中，在室溫50rpm的搖床上培養4小時。
6.2原生質體的轉化分離原生質體分離後立即以6百萬/毫升的密度重新懸浮在RS緩衝液中(0.45M甘露醇，15mM CaCl2，0.1％MES，pH5.7)。向17×100mm的聚苯乙烯管中加入0.5毫升，然後加入50微克pCIB4631 DNA和50微克CaMV 35S GUS作為轉化對照，例如來自克隆技術實驗室(Palo Alto，CA)的pB1221。向每管中加入0.5毫升PEG溶液(40％PEG6000，0.4M甘露醇，0.1M Ca(NO3)2)，輕輕地搖動與原生質體混合。室溫培養30分裝後，用1毫升、2毫升、5毫升和10毫升W5(9.0g/l NaCl，18.5g/l CaCl2，0.37g/lKCl，0.9g/l葡萄糖，pH5.6)以5分鐘的間隔逐步稀釋原生質體，沉降，重懸於鋪板培養基中(MS鹽，B5維生素，3％蔗糖，2mg/l 2，4，-D，0.3M甘露醇)，密度為2×106原生質體/毫升。黑暗中26℃培養原生質體。18-22小時後將原生質體收集在Eppendorf管中，沉降，並重懸於0.4毫升提取緩衝液中(100mM KHPO4pH7.8，1mM DTT)。然後超聲處理樣品10秒鐘，離心沉降碎片。
6.3單鏈抗體與玉米根葉甲BBMV的結合如上所述製備刷狀緣膜小泡並在8-16％丙烯醯胺SDS蛋白凝膠上(Novex，San Diego，CA)電泳。將蛋白轉移到硝基纖維素膜上(Burnette，W.N.，Western印跡，112195(1981))，並讓其與含有單鏈抗體蛋白的玉米原生質體提取物結合。在Western印跡上，由pCIB4631表達的玉米根葉甲BBMV特異性3B1單鏈抗體蛋白與原始3B1單克隆抗體結合相同分子量的BBMV蛋白。在免疫截面試驗中，玉米原生質體表達的單鏈抗體也與玉米根葉甲中腸的橫截面結合(Bravo等，1992，病理調查雜誌，60237-246，Bravo等，1992，病理調查雜誌，60247-253)。
實施例7玉米根葉甲特異性免疫毒素的構建將玉米根葉甲特異性單鏈抗體與假單胞菌內毒素A的毒性區融合。假單胞菌內毒素A已用於合成治療癌症和免疫疾病的重組雜合抗體-毒素融合蛋白(Pastan，I和FitzGerald，D.，1989，生物化學雜誌，26415157-15160，和Pastan，I等，生物化學年度綜述，1992，61331-54)。假單胞菌內毒素的結構已被完全鑑定，其作用方式是已知的。抗體雜合毒素作為殺蟲劑的概念是新穎的，此類途徑沒有先例。
假單胞菌內毒素(PE)是由假單胞菌P.aeruginosa分泌的單鏈毒素。它通過催化不可逆的ADP-核糖基化和滅活翻譯延長因子2(EF-2)來殺死細胞。PE的結構已完全鑑定(Chaudhary，V.K.，1990，生物化學雜誌，26516303-16310)，它由三個結構域組成。結構域Ia負責細胞識別和PE與靶細胞的結合，ADP-核糖基化活性轉移到胞液中需要結構域II，結構域III是ADP-核糖基化活性。當毒素進入細胞時被內吞小泡內在化，此時發生裂解產生37KD的結構域III「活化毒素」。結構域Ia缺少就去除了細胞結合區，產生了細胞毒性「極低」的40kD蛋白(PE40)。抗體與PE40融合已用於製備許多治療癌症的重組免疫毒素。相信抗體-PE40融合物結合後必然通過受體介導的細胞內吞作用內在化，以適當地活化PE40和隨後進入胞液的通道。
將玉米根葉甲3B1單鏈抗體的重鏈羧基末端與PE毒性區融合，因為已證明PE40氨基末端的融合能保持細胞毒性。也可能設計這樣的融合物，其中單鏈抗體與PE40的氨基末端融合(Prior等，細胞，64卷1017-1023)。在大腸桿菌表達載體中製備和檢測單鏈抗體融合物，使用p-FLAG表達載體，其中含有IPTG可誘導的tac啟動子和隨後的編碼ompA信號肽(引導向外周胞質分泌的信號肽)的序列和編碼8胺基酸FLAG表位序列，所述表位有利於通過抗體親和色譜分離重組蛋白。從p-FLAG表達載體中純化單鏈抗體融合蛋白。將純化的SCA融合蛋白攙入玉米根葉甲的食物中進行活性測定。
通過將包括PE40和含有3B1單鏈抗體的790bp Hind III/Sph I片段的約1.2Kb Sph I/Eco RI片段連接到Hind III/Eco RI消化的5.37Kb pFLAG載體(IBI，New Haven，CT)上，來製備與PE40融合的單鏈抗體。PE40片段來自pWW20，後者是一種在pUC9載體(Wels等，1992，癌症研究526310-6317)中含有在可誘導Lac啟動子控制下的假單胞菌內毒素毒性結構域的載體。通過用pCIB4631作為模板用寡聚物NC200和NC202為引物進行PCR產生含有3B1單鏈抗體的700bp片段。
NC2005′-CGA AGC TTG ACA TTG TGC TGA CCC AG-3′(SEQ ID NO35)NC2025′-GCC CTC TAG AAG CAT GCC TGA GGA GAC GGT GAC TGA-3′(SEQ ID NO36)實施例8植物中的轉化和表達按常用的方法將由抗體區與毒素區融合組成的雜合毒素轉化到植物中，如WO 93/07278，08/008006和08/037057中所述。由兩個獨立的抗體鏈或抗體區與毒素融合組成的二元毒素用一般細胞加工方法在植物中表達和組裝。可以在植物胞質中表達單鏈抗體-毒素蛋白以作用於植物的非原質體，或者雜合毒素具有細胞毒性時在植物細胞中表達以作用於細胞器(Taviadorali等，1993，自然，366469-472；Owen等，1992，生物技術，10790-794；Firek等，1993，植物分子生物學，23861-870)。使用文獻中已知的技術通過內質網將蛋白定向於葉綠體或液泡。在文獻中描述了羧基端前肽形式的液泡靶向信號(Bednarek S.等，1991，植物細胞，31195-1206；Neuhaus J-M等，1991，PNAS8810362-10366；Bednarek S.等，1992，植物分子生物學，20133-150；Chrispeels M.J.等，1992，細胞，68613-616；Nakamura K等，1993，植物生理學，1011-5；Dombrowski J.E.等，1993，植物細胞，5587-596；Schroeder M.R.等，1993，植物生理學，101451-458)。文獻中描述了N-末端轉移肽形式的葉綠體靶向信號(VanDen Broeck G.等，1985，自然313358-363；Smeekens S.等1987，植物分子生物學，9377-388；Szabo L.J.等，1987，在T.Hohn和J.Schell編的植物DNA感染劑(紐約，Springer Verlag，Wein)中321-339頁；Keegstra K.等，植物生理植物分子生物學年度綜述，40471-501)。
本發明提供構建靶向特異昆蟲的毒素分子的材料和方法。特別是靶向那些能逃脫毒素結合和Bt內毒素的細胞毒作用的昆蟲。另外，構建了對具體害蟲有特異性的毒素分子。本說明書中提到的所有出版物和專利申請說明與本發明有關的領域中技術人員的技術水平。所有出版物和專利申請引入本文作為參考，其引用程度如同每篇特異地單獨地引入。雖然前文為清楚理解的目的以說明和實施例的方式比較詳細地描述了本發明，但很顯然可以在權利要求範圍內進行某些改變和修改。
實施例9製劑實例下列製劑實例中使用的活性成分是按實施例7製備的純化SCA融合蛋白。
A1.可溼性粉末
a) b) c)活性成分 25％50％ 75％木素磺酸鈉 5％ 5％-月桂基硫酸鈉3％ - 5％二異丁基萘磺酸鈉- 6％ 10％辛基苯酚聚乙二醇醚 - 2％-(7-8摩爾的環氧乙烷)高分散的矽酸5％10％ 10％高嶺土 62％27％-將孢子與佐劑徹底混合，將混合物在適當的磨中徹底研磨形成可溼性粉末，它可以用水稀釋得到理想濃度的懸浮液。
A2.可乳化濃液活性成分10％辛基苯酚聚乙二醇醚(4-5摩爾的環氧乙烷)3％十二烷基苯磺酸鈣 3％蓖麻油聚乙二醇醚(36摩爾的環氧乙烷) 4％環己酮 30％二甲苯混合物50％用水稀釋可以從該濃液得到任何所需濃度的乳液。
A3.粉塵劑a) b)活性成分 5％ 8％滑石 95％ -高嶺土 - 92％
將活性成分與載體混合併在適當的磨中研磨得到即用的粉塵劑。
A4.擠出顆粒活性成分10％木素磺酸鈉 2％羧甲基纖維素 1％高嶺土 87％將活性成分或其組合與佐劑混合，然後混合物用水潤溫。將混合物擠出、制粒並在空氣流中乾燥。
A5.包衣顆粒活性成分 3％聚乙二醇(分子量200)3％高嶺土94％在一混合機中將活性成分或其組合均勻地施於用聚乙二醇潤溼的高嶺土上。這樣得到了非粉塵的包衣顆粒。
A6.懸浮濃液活性成分 40％乙二醇 10％辛基苯酚聚乙二醇醚(15摩爾的環氧乙烷)6％木素磺酸鈉 10％羧甲基纖維素1％37％甲醛水溶液0.2％75％水溶液形式的矽氧烷油 0.8％水 32％
活性成分與佐劑緊密混合得到懸浮濃液，用水稀釋可從中製得任何所需濃度的懸浮液。
附圖的簡要說明圖1丙烯醯胺凝膠電泳後，單克隆抗體與玉米刷狀緣膜小泡結合的Western印跡分析。在此分析中使用了來自細胞系3B1、2B5、17F6和10B6的抗體。MW＝分子量標準。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)國家瑞士(F)郵政編碼4002(G)電話+4161691111(H)傳真+41616967976(I)電傳962991(ii)發明名稱與昆蟲腸蛋白結合的抗體和其應用(iii)序列數49(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度357鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置1..357(D)其他信息/注＝「來自pCIB4613的3B1重鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO1CAG GTC AAA CTG CAG GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG 48Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly1 5 10 15TCA TTG AAA CTC TCA TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe20 25 30GCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT 144Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45GCT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT 192Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp50 55 60TCA GTG AAA GAC AGG TTC ACC GTC TCCAGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG 240Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met65 70 75 80TTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT 288Phe Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr85 90 95TAC TGT GTG AGG GTA GTA TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 336Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 357Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度119胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe20 25 30Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp50 55 60Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met65 70 75 80Phe Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr85 90 95Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度333鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..333(D)其他信息/注＝「來自pCIB4614的3B1輕鏈可變區(#21 Fv Ab)」(xi)序列描述SEQ ID NO3GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT CAT TAT 96Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr20 25 30GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC 192Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala50 55 60AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT TTC TGT CAG CAA AGT AGG 288Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg85 90 95GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC ACG CTG GAA ATA AAA 333Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度111胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr20 25 30Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Set Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg85 90 95Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度372鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..372(D)其他信息/注＝「來自pCIB4615的2B5重鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO5CAG GTG CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT 48Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30TAT ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CIT GAG TGG TTG 144Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45GGT TTT ATT AGA CAC AAA GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAA TAC AGT GCA 192Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala50 55 60TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAC ATC 240Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ile65 70 75 80CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT GAG GAC AGT GCC ACT TAT 288Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr85 90 95TAC TGT GCA AGA GAT ATA TGC TAT GGT TAC GAC GTT GGG GCT CTG GAC 336Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp100 105 110TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 372Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度124胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ile65 70 75 80Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度330鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..330(D)其他信息/注＝「來自pCIB4616的2B5輕鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO7GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCT GCT TCC TTA GCT ATA TCT CTG GGG 48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Gly1 5 10 15CAG AGG GCC ACC ATC TCA TAC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT 96Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45AGA CTC CTC ATC TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC 192Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG 288Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95GAG CTT ACA CGT TCG GAG GGG GGA CCA AAG CTG GAA ATA AAA 330Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度110胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO8Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度165鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..165(D)其他信息/注＝「 17F6重鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO9TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA CAA AGT ACT 48Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Thr1 5 10 15GTC TAC CTG GAG ATG AAC ACG CTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 96Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr20 25 30TAT TGT TGT AGA GGG GGG GAG GAG GGG TTT CCT TAC TGG GGG CAA GGG 144Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly35 40 45ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 165Thr Leu Val Thr Val Ser Ala50 55(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度55胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Thr1 5 10 15Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr20 25 30Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly35 40 45Thr Leu Val Thr Val Ser Ala50 55(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度339鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..339
(D)其他信息/注＝「17F6輕鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO11GAC ATC GTG CTG ACC CAA TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GTA GGA 48Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACC ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTT TTC GAC AGT 96Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser20 25 30GGA AAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45CCT CCT AAA CTA TTG ATC TAC GGG ACA TCC ACT AGG GAT TCT GGG GTC 192Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80ATC AGT GGT ATA CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT 288Ile Ser Gly Ile Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95GAT CAT TAT TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG ATA 336Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110AAA 339Lys(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度113胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO12Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Gly Ile Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵
(A)長度357鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬否(iv)反義否(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..357(D)其他信息/注＝「10B6重鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO13GAG GTG AAG GTG GAT GAG AGT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15TCT CTG AAA CTC TCC TGT GAA ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT TAT TAT 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr20 25 30TGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144Trp Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45GCT GTG ATT AAA GTC AAA TCT GCT AAT TAT GGA TCA AAT TAT GCA GAG 192Ala Val Ile Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu50 55 60TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA AAT AGC GGT 240Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly65 70 75 80GTC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAA GAA GAC ACT GCC ACT TAT 288Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95TAT TGT AGT AGA GGG GGG GCC CCC GGG TTT CCT TAT TGG GGC CAA GGG 336Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度119胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO14Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr20 25 30Trp Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Val Ile Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly65 70 75 80Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度339鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..339(D)其他信息/注＝「10B6輕鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO15GAT ATC GTG ATC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTA AGT GTG TCT TTA GGA 48Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACT TTG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTT ACC GGT 96Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Thr Gly20 25 30GGA GAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA GCA GGG CAG 144Gly Asp Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln35 40 45CCT CCT AGA CTG TTG ATC TAC GGG ACT TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT GCC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala65 70 75 80ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GGT TAT TAC TGT CAG AAT 288Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95GAT CAT AGT TAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA ATG TTG GAA GTA 336Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val100 105 110AAA 339Lys(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度113胺基酸
(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO16Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Thr Gly20 25 30Gly Asp Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln35 40 45Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val100 105 110Lys(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度1797鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..1797(D)其他信息/注＝「來自pCIB4631的3B1單鏈抗體」(xi)序列描述SEQ ID NO17ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA GCT GCA GGT 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly1 5 10 15GTC CAT TGC CTA CTC GAG GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT 96Val His Cys Leu Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser20 25 30TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC 144Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser35 40 45GAA AGT GTT GAT CAT TAT GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG 192Glu Ser Val Asp His Tyr Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln50 55 60AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA 240Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln65 70 75 80GGA TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 288Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT 336Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr100 105 110TTC TGT CAG CAA AGT AGG GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC 384Phe Cys Gln Gln Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr115 120 125ACG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT AGA TCT GGT GGC 432Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Arg Ser Gly Gly130 135 140GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG CTC GAG CAG GTC AAA CTG CAG GAG 480Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Lys Leu Gln Glu145 150 155 160TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TCA TTG AAA CTC TCA TGT 528Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys165 170 175GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC GCC ATG AAC TGG GTC CGC 576Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala Met Asn Trp Val Arg180 185 190CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT GCT CGC ATA AGA AGT AAA 624Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys195 200 205AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT TCA GTG AAA GAC AGG TTC 672Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe210 215 220ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG TTC TAT CTG CAA ATG AAC 720Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Phe Tyr Leu Gln Met Asn225 230 235 240AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGG GTA GTA 768Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val245 250 255TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 816Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser260 265 270TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT 864Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser275 280 285AGA TCT GCT GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC 912Arg Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val290 295 300AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC 960Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser305 310 315 320CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC1008Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu325 330 335TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC1056Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser340 345 350GAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG1104Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val355 360 365GAC AAG AAA ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT1152Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys370 375 380ACA GTC CCA GAA GTA TCA TCT GTC TTC ATC TTC CCC CCA AAG CCC AAG1200Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys385 390 395 400GAT GTG CTC ACC ATT ACT CTG ACT CCT AAG GTC ACG TGT GTT GTG GTA 1248Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val405 410 415GAC ATC AGC AAG GAT GAT CCC GAG GTC CAG TTC AGC TGG TTT GTA GAT 1296Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp420 425 430GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC 1344Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe435 440 445AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG GAC 1392Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp450 455 460TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC 1440Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe465 470 475 480CCT GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA ACC AAA GGC AGA CCG AAG 1488Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys485 490 495GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT CCA CCT CCC AAG GAG CAG ATG GCC AAG 1536Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys500 505 510GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC 1584Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp515 520 525ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG AAT GGG CAG CCA GCG GAG AAC TAC AAG 1632Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
530 535 540AAC ACT CAG CCC ATC ATG AAC ACG AAT GGC TCT TAC TTC GTC TAC AGC 1680Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser545 550 555 560AAG CTC AAT GTG CAG AAG AGC AAC TGG GAG GCA GGA AAT ACT TTC ACC 1728Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr565 570 575TGC TCT GTC TTA CAT GAG GGC CTG CAC AAC CAC CAT ACT GAG AAG AGC 1776Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser580 585 590CTC TCC CAC TCT CCT GGT AAA 1797Leu Ser His Ser Pro Gly Lys595(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度599胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO18Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly1 5 10 15Val His Cys Leu Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser20 25 30Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45Glu Ser Val Asp His Tyr Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln65 70 75 80Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr100 105 110Phe Cys Gln Gln Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr115 120 125Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Arg Ser Gly Gly130 135 140Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Lys Leu Gln Glu145 150 155 160Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys165 170 175Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala Met Asn Trp Val Arg180 185 190Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys195 200 205Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe210 215 220Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Phe Tyr Leu Gln Met Asn225 230 235 240Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val245 250 255Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser260 265 270Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser275 280 285Arg Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val290 295 300Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser305 310 315 320Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu325 330 335Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser340 345 350Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val355 360 365Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys370 375 380Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys385 390 395 400Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val405 410 415Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp420 425 430Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe435 440 445Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp450 455 460Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe465 470 475 480Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys485 490 495Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys500 505 510Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp515 520 525Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys530 535 540Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser545 550 555 560Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr565 570 575Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser580 585 590Leu Ser His Ser Pro Gly Lys595(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度101鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4612 101bp Sty I/Bgl II片段的寡核苷酸KE109A28(xi)序列描述SEQ ID NO19CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC 60TTCACCCATT GTCAAGAGCT TCAACAGGAA TGAGTGTTAG G 101(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度101鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4612 101bp Sty I/Bgl II片段的寡核苷酸KE110A28(xi)序列描述SEQ ID NO20GATCCCTAAC ACTCATTCCT GTTGAAGCTC TTGACAATGG GTGAAGTGA TGTCTTGTGA60GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTTATGTCGT TCATACTCGT C 101(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵
(A)長度72鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4612 71bp Xho I/Dde I片段的寡核苷酸KE111A28(xi)序列描述SEQ ID NO21TCGAGGGTAC CGAGCTAG ATCTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 60TCTGGAGGTG CC 72(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度71鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4612 71bp Xho I/Dde I片段的寡核苷酸KE112A28(xi)序列描述SEQ ID NO22TGAGGCACCT CCAGATGTTA ACTGCTCACT GGATGGTGGG AAGATGGATA CAGATCTAGA 60GCTCGGTACC C71(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度41鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4611 40bp Xho I/Nco I片段的寡核苷酸KE106A28(xi)序列描述SEQ ID NO23TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGCTGCC CAAACTAACT C 41(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度41鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4611 40bp Xho I/Nco I片段的寡核苷酸KE107A28(xi)序列描述SEQ ID NO24CATGGAGTTA GTTGGGCAG CAGTCTAGA GCTCGGTACC C 41(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特徵(A)長度39鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4611 40bp BSt XI/Bam HI片段的寡核苷酸KE108A28(xi)序列描述SEQ ID NO25CTGGTAAAAGG CGGCCGCATC GATTAAGTCG ACCCGCGGG 39(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特徵(A)長度47鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於製備pCIB4611 40bp Bst XI/Bam HI片段的寡核苷酸KE105A28(xi)序列描述SEQ ID NO26GATCCCCGCG GGTCGACTTA ATCGATGCGG CCGCCTTTAC CAGGAGA 47(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特徵(A)長度7鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於pCIB4610的植物保守的翻譯起始序列(xi)序列描述SEQ ID NO27AACAATG 7(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特徵(A)長度7鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於pCIB4600的植物保守的翻譯起始序列(xi)序列描述SEQ ID NO28TCCGATG 7(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特徵(A)長度25鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於產生pCIB4610的83bp片段的PCR引物KE102A28(xi)序列描述SEQ ID NO29CGAAGTTAACAGATCTAGAGCTCGG 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於產生pClB4610的83bp片段的PCR引物KE101A28(xi)序列描述SEQ ID NO30CGGGATCCAACAATGGGATGGAGCTGGATCTT32(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特徵(A)長度164鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述編碼內質網信號肽的寡核苷酸，Kabat等，1987(xi)序列描述SEQ ID NO31GATCCAACAA TGGGATGGAG CTGGATCTTT CTCTTCCTCC TGTCAGTTGT TACCCTACCT 60CGACCTAGAA AGAGAAGGAG GACAGTGGAG CTGCAGGTGT CCATTGCCTA CTCGAGGGTA 120CCGAGCTCCT CGACGTCCAC AGGTAACGGA TGAGCTCCGA TGGC 164(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特徵(A)長度10胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞結構域(B)位置1..10
(D)其他信息/注＝「輕鏈和重鏈Fv片段之間的10胺基酸接頭」(xi)序列描述SEQ ID NO32Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於產生pCIB4631的36bp片段的寡核苷酸KE147A28(xi)序列描述SEQ ID NO33GATCTGGTGG CGGTGGCTCG GGCGGTGGTG GGTCGC 36(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於產生pCIB4631的36bp片段的寡核苷酸KE182A28(xi)序列描述SEQ ID NO34TCGAGCGACC CACCACCGCC CGAGCCACCG CCACCA 36(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特徵
(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於產生與PE40融合的3B1單鏈抗體編碼基因的700bp片段的PCR引物NC200(xi)序列描述SEQ ID NO35CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG26(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於產生與PE40融合的3B1單鏈抗體編碼基因的700bp片段的PCR引物NC202(xi)序列描述SEQ ID NO36GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGGACGGT GACTGA 36(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸
(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物NC92(xi)序列描述SEQ ID NO37GTCTCGAGGA YATYSWGMTS ACCCARTCT 29(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物NC130(xi)序列描述SEQ ID NO38GCAGATCTAG TTGGTGCAGC ATCAGCCCG 29(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物NC91(xi)序列描述SEQ ID NO39GTCTCGAGCA GGTSMARCTG CAGSAGTCWG30(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物NC114(xi)序列描述SEQ ID NO40GCAGATCTAG ATCCAGGGGC CAGTGGATA 29(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物NC111(xi)序列描述SEQ ID NO41GCAGATCTGC AGGAGACGAG GGGGAAGACA TT 32(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物NC117(xi)序列描述SEQ ID NO42GCAGATCTGC AGCCAGGGAC CAAGGGATA 29(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特徵(A)長度22胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬否(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞結構域(B)位置1..22(D)其他信息/注＝「輕鏈和重鏈Fv片段之間的另一可替代使用的接頭」(xi)序列描述SEQ ID NO43Gly Pro Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro1 5 10 15Thr Pro Ser Gly Pro Gly20(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特徵(A)長度357鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否(iv)反義否(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..357(D)其他信息/注＝「pCIB4635的14G1重鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO44GAG GTG AAG CTT GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15TCT CTG AAA CTC TCC TGT GTT ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAC 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30CGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144Arg Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45GCT GTA ATT ACA CTC AAA TCT GAT AAT TAT GGA ACA ATT TAT GCA GAA 192Ala Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Glu50 55 60TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACC ATT TCA AGA GAA GAT TCA GAA AGC AGC 240Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser65 70 75 80ATC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 288Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95TAC TGT AGT AGA GGT AGT GAC TGG GGA TTT CCT TAT TGG GGG CAA GGG 336Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110ACT CTG GTC ACT GTG TCT GCA 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特徵(A)長度119胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO45Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Arg Met His Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser65 70 75 80Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特徵(A)長度339鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否(iv)反義否(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..339(D)其他信息/注＝「pCIB4636的14G1輕鏈可變區」(xi)序列描述SEQ ID NO46GAT ATT GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GCA GGA 48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTA AAT AGT 96Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30GGA AAT CAA AAG CAC TAC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGC CAG 144Gly Asn Gln Lys His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45CCT CCT AAA CTG TTG ATC TAC GGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGG TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG AAT 288Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn85 90 95GAT CGT AGT TAT CCG TTC ACA TTC GCC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA 336Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110AAA 339Lys(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特徵(A)長度113胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO47Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn85 90 95Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物DB91(iii)假擬否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO48ACGTCTCGAG GARGTGAAGC TKRWKGARWC TG 32(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特徵(A)長度34鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述用於擴增抗體基因的PCR引物DB114(iii)假擬否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO49CAATTCGCAT ATGAGATCCA GGGGCCAGTG GATA 3權利要求
1.能與靶昆蟲的腸結合但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合的抗體或其片段。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或其結合片段。
3.權利要求2的單克隆抗體或其片段，其中所述單克隆抗體或其結合片段能與昆蟲的刷狀緣膜結合。
4.權利要求1或2的單克隆抗體，其中所述靶昆蟲選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目和毛翅目。
5.權利要求4的單克隆抗體，其中所述靶昆蟲是玉米根葉甲。
6.權利要求5的單克隆抗體，其中所述抗體選自2B5，3B1，10B6，17F6，14G1和16E4。
7.編碼權利要求2-6任一項的單克隆抗體或所述單克隆抗體的結合位點的DNA序列。
8.權利要求7的DNA序列，其中所述DNA序列選自SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46。
9.權利要求7或8的DNA序列，其中所述DNA序列與編碼毒素部分的DNA序列有效地連接。
10.權利要求9的DNA序列，其中所述毒素部分選自芽孢桿菌毒素、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
11.權利要求7-10任一項的DNA序列，其中所述DNA是植物基因組的一部分。
12.一種雜合毒素，其包括能與靶昆蟲的腸結合但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合的抗體或其片段和與其有效地連接的毒素部分。
13.一種雜合毒素分子，所述分子包含權利要求2的單克隆抗體或單克隆抗體結合片段和與其有效地連接的毒素部分。
14.權利要求12或13的雜合毒素，其中所述毒素部分選自芽孢桿菌毒素、假單胞菌內毒素、商陸素、gelonin、核糖核酸酶或核糖體滅活蛋白。
15.權利要求14的雜合毒素，其中所述芽孢桿菌毒素選自芽孢桿菌內毒素和營養期殺蟲蛋白。
16.權利要求15的雜合毒素，其中所述芽孢桿菌內毒素是Bt內毒素。
17.權利要求12的雜合毒素，其中所述單克隆抗體是權利要求2-6中任一項的抗體。
18.權利要求17的雜合毒素，其中所述單克隆抗體或其結合區能與昆蟲的刷狀緣膜結合。
19.權利要求18的雜合毒素，其中所述單克隆抗體選自2B5，3B1，10B6，17F6，14G1和16E4。
20.編碼權利要求12-19中任一項的雜合毒素的DNA序列。
21.權利要求20的DNA序列，該序列是植物基因組的一部分。
22.由第一表達盒組成的DNA序列，該表達盒包括編碼能夠指導在植物中表達的啟動子的DNA序列和與其有效連接的編碼單克隆抗體輕鏈或抗體結合域的DNA序列，其中所述單克隆抗體與靶昆蟲的腸結合。
23.權利要求22的DNA序列，其中所述表達盒還包括與編碼單克隆抗體輕鏈或抗體結合域的DNA序列有效連接的編碼毒素部分的DNA序列。
24.包含第二表達盒的DNA序列，該表達盒包括編碼能夠指導在植物中表達的啟動子的DNA序列和與其有效連接的編碼單克隆抗體重鏈或抗體結合域的DNA序列，其中所述單克隆抗體與靶昆蟲的腸結合。
25.權利要求24的DNA序列，其中所述表達盒還包括與編碼單克隆抗體重鏈或抗體結合域的DNA序列有效連接的編碼毒素部分的DNA序列。
26.權利要求22-25中任一項的DNA序列，其還包含在植物中有效的終止序列。
27.權利要求23或26的DNA序列，其中所述毒素部分選自芽孢桿菌毒素、假單胞菌內毒素、商陸素或核糖核酸酶。
28.權利要求22-27中任一項的DNA序列，其中所述DNA序列是植物基因組的一部分。
29.用權利要求7-11和20-21中任一項的DNA序列轉化的植物細胞。
30.用權利要求22-28中任一項的DNA序列轉化的植物細胞。
31.用權利要求7-11和20-21中任一項的DNA序列轉化的植物和其後代。
32.用權利要求22-28中任一項的DNA序列轉化的植物和其後代。
33.表達權利要求1-6中任一項的單克隆抗體的植物和其後代。
34.表達權利要求12-19中任一項的雜合毒素的植物和其後代。
35.權利要求31-34任一項的植物，它是玉米植物。
36.權利要求31-35任一項的植物，它是雜種植物。
37.用保護劑包衣處理過的權利要求31一36任一項中植物的繁殖材料。
38.權利要求37的繁殖材料，其包含選自除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或其混合物的製劑。
39.權利要求37或38的繁殖材料，其特徵在於它由種子組成。
40.用權利要求7-11和20-21中任一項的至少一種DNA序列轉化的重組微生物。
41.用權利要求22-28中任一項的至少一種分離DNA序列轉化的重組微生物。
42.包含至少一種編碼雜合毒素的DNA分子的重組微生物，其中雜合毒素包括與靶昆蟲的腸結合但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合的抗體或其片段和與其有效地連接的毒素部分，所述編碼單克隆抗體的DNA序列包含選自SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，44或46的序列。
43.權利要求40-42任一項的重組微生物，其中所述重組微生物選自細菌如芽孢桿菌、柄桿菌、Agmenellum、假單胞菌、歐文氏菌、沙雷氏菌、科雷伯氏菌、黃單胞菌、鏈黴菌、根瘤菌、紅假單胞菌、Metylius、農桿菌、醋桿菌、乳桿菌、節桿菌、固氮菌、明串珠菌和產鹼菌；真菌特別是酵母如酵母、隱球酵母、克魯維酵母、擲孢酵母、紅酵母和短梗黴；病毒如苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒。
44.含有殺蟲有效量的權利要求40-43任一項的重組微生物和適當載體的殺蟲組合物。
45.含有殺蟲有效量的權利要求12-19任一項的分離的雜合毒素分子和適當載體的殺蟲組合物。
46.用權利要求44-45任一項的殺蟲組合物處理過的植物繁殖材料。
47.權利要求46的繁殖材料，其特徵在於它是植物種子。
48.一種穩定轉化宿主生物的方法，包括將權利要求7-10或21或23-25或27-29中任一項的DNA序列引入所述宿主生物的基因組中。
49.權利要求33的方法，其中所述宿主生物是微生物。
50.權利要求33的方法，其中宿主生物是植物。
51.產生權利要求1的抗體或單克隆抗體的雜交瘤細胞系的製備方法，其包括a)用昆蟲腸，特別是昆蟲刷狀緣膜作為抗原；b)用所述抗原免疫供體動物；c)從被免疫的供體動物分離免疫成分B細胞；d)將所述免疫成分B細胞與能進行連續細胞分裂的腫瘤細胞融合；e)分離形成的融合產物，在適當的培養基中培養，然後克隆陽性雜合細胞；和f)將克隆的雜合細胞按產生單克隆抗體的能力進行篩選，選擇具有所要求性質的克隆。
52.權利要求11-20的雜合抗體一毒素分子的構建方法，包括克隆抗體的可變區並將該區與毒素部分連接。
53.一種製備能結合昆蟲腸刷狀緣膜小泡的單克隆抗體或其片段的方法，包括在適當的培養基中體內或體外培養產生所述抗體的雜交瘤細胞系，並分離形成的抗體。
54.一種產生編碼權利要求1單克隆抗體的DNA序列的方法，包括利用針對恆定區和可變區的支架區中保守DNA序列的引物從雜交瘤細胞分別克隆抗體基因。
55.產生權利要求2-6任一項的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
56.權利要求55的雜交瘤細胞系，其已按下列保藏號保藏ATCC HB11616，HB 11617，HB 11618，HB 11619和HB 11620。
全文摘要
提供了能與昆蟲腸的刷狀緣膜小泡結合的抗體、單克隆抗體或其片段和編碼這些蛋白質的基因。該單克隆抗體與靶昆蟲的腸結合但不與哺乳動物刷狀緣膜或植物微粒體結合。這些抗體和編碼它們的基因可用於構建防治害蟲的雜合毒素。
文檔編號C07K14/325GK1151759SQ95193817
公開日1997年6月11日 申請日期1995年6月20日 優先權日1994年6月28日
發明者N·B·卡洛茨, M·G·庫斯艾爾 申請人:希巴-蓋吉股份公司