一種複合益菌肽及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-07 04:42:54

一種複合益菌肽及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種複合益菌肽及其製備方法和應用，它由菌酶復配發酵劑添加到豆粕中發酵而成，所述菌酶復配發酵劑由四種益生菌、四種蛋白酶和碳源複合而成，四種益生菌分別為丁酸梭菌、短小芽孢桿菌S3、植物乳桿菌和布拉酵母菌；四種蛋白酶分別為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶和多肽蛋白酶。並提供了複合益菌肽的具體製備方法和在用於製備乳仔豬飼料添加劑中的應用。所述複合益菌肽產品，富含多種益生菌，可有效降解抗原蛋白產生多肽、胺基酸等小分子物質，並在發酵過程中產生了多種益生性有機酸、生物素等風味性、拮抗性物質，不僅增加了適口性、安全性，且顯著提高了豆粕利用率和飼料營養價值，還可顯著降低乳仔豬腹瀉率。
CGMCC No. 9161
2014.05.13
【專利說明】一種複合益菌肽及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物酶解與發酵領域，涉及肽的製備方法，具體涉及一種複合益菌肽 及其製備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 豆柏作為一種重要的植物蛋白源，有著重要的應用和研究價值。但大豆中的蛋白 酶抑制劑、植物凝集素、大豆抗原蛋白、脲酶、植酸、大豆低聚糖等抗營養物質的存在，不但 極大地阻礙動物對營養成分的消化、吸收和利用，而且嚴重地危害動物的健康和生長發育。 大豆抗原蛋白是大豆加工製品中殘留量最高，抗營養作用最強的一種大豆抗營養因子，可 引起嬰幼兒以及小鼠、仔豬、犢牛等動物發生腸道及其它器官的過敏反應，並導致腸黏膜損 傷，小腸形態結構發生損傷性變化，進而引起腹瀉、生產性能下降甚至死亡，是世界公認的 八大食物過敏原之一。大豆抗原蛋白主要包括Iis大豆球蛋白和7S0-大豆伴球蛋白，兩 者佔大?蛋白含量的70 %左右。
[0003] 目前的豆柏的生物處理方法中，微生物發酵法與酶處理法已經較為普遍，本發明 將四種菌、四種酶與碳源結合起來，將豆柏作為一種培養微生物的基質，促進四種益生菌大 量繁殖，並在生物處理過程中，有效降解並利用豆柏大分子抗原蛋白，幾乎將其完全降解為 多肽、胺基酸等小分子物質，易於動物吸收，並產生了多種益生性有機酸等風味性物質，生 物素、酪酸梭菌素等拮抗性物質，在增加了適口性、安全性的同時，還顯著提高了豆柏的蛋 白利用率和營養價值，並可降低乳仔豬腹瀉率，具備了一定的功能性。


【發明內容】

[0004] 本發明提供了一種複合益菌肽及其製備方法和應用，所述複合益菌肽可以滿足乳 仔豬對豆柏原料的特殊營養需求。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明採用以下技術方案予以實現：
[0006] -種複合益菌肽，它由菌酶復配發酵劑添加到豆柏中發酵而成，所述菌酶復配發 酵劑由四種益生菌、四種蛋白酶和碳源複合而成，所述四種益生菌分別為丁酸梭菌、短小 芽孢桿菌S3、植物乳桿菌和布拉酵母菌；所述四種蛋白酶分別為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、 鹼性蛋白酶和多肽蛋白酶；所述短小芽孢桿菌S3的分類命名為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，其保藏編號為：CGMCC No. 9161。
[0007] 對上述技術方案的進一步改進：所述四種益生菌在菌酶復配發酵劑中的含菌量分 別是：丁酸梭菌：不低於IX l〇6CFU/g ;短小芽孢桿菌S3 :不低於IX 106CFU/g ;植物乳桿菌： 不低於IX l〇6CFU/g ;布拉酵母菌：不低於IX 105CFU/g。
[0008] 對上述技術方案的進一步改進：所述四種蛋白酶在菌酶復配發酵劑中的含量分別 是：酸性蛋白酶：不低於500U/g ;中性蛋白酶：不低於1000U/g ;鹼性蛋白酶：不低於4000U/ g ;多肽蛋白酶：不低於4500U/g。
[0009] 對上述技術方案的進一步改進：所述碳源為佔菌酶復配發酵劑質量9% -10%的 葡萄糖。
[0010] 本發明還提供了所述的複合益菌肽的製備方法，它包括如下步驟：
[0011] (1)在豆柏中添加佔豆柏質量50-60%的水形成發酵底料，接種佔豆柏質量10% 的所述菌酶復配發酵劑，混合均勻形成發酵物料；
[0012] (2)將所述發酵物料儲存於錫箔密封袋內，於200°C封口，置於37°C恆溫培養箱 內，發酵72h ;
[0013] (3)發酵完成後，低溫烘乾，粉碎過篩，形成所述複合益菌肽。
[0014] 對上述技術方案的進一步改進：所述步驟（3)中發酵物料於40°C低溫烘乾，粉碎 過60目篩。
[0015] 本發明進一步提供了所述的複合益菌肽在製備用於飼餵乳仔豬的飼料添加劑中 的應用。
[0016] 所述複合益菌肽以佔飼料質量比為5-15%的比例添加到飼料中，所述複合益菌肽 拮抗豬糞大腸菌群。
[0017] 與現有技術相比，本發明方法的優點和技術效果是：
[0018] 1、本發明所用的菌酶復配發酵劑，是在生物酶解發酵理論基礎上，結合多年實踐 經驗，針對生產常用豆柏原料特點，自行配製的專一性發酵劑；採用所述的專一性菌酶復配 發酵劑，生物處理豆柏來製備複合益菌肽產品。
[0019] 2、本發明所製備的複合益菌肽產品，富含多種益生菌，包括丁酸梭菌，短小芽孢杆 菌S3,植物乳桿菌，布拉酵母菌。在其酶解發酵過程中，可有效降解豆柏中抗原蛋白產生多 肽、胺基酸等小分子物質，並產生多種益生性有機酸、生物素等風味性、拮抗性物質，不僅增 加了適口性、安全性，且芽孢類益生菌具有很好的保存穩定性。
[0020] 3、本發明所製備的複合益菌肽產品，可顯著提高豆柏利用率和飼料營養價值，具 有豬糞大腸菌群抗性，還可顯著降低仔豬腹瀉率。
[0021] 4、本發明所涉及菌、酶等，都屬於飼料添加劑範疇，來源廣泛，安全易得，成本低 廉。
[0022] 5、本發明所述方法步驟簡單合理，操作快捷，具有良好的工業化實施前景。
[0023] 結合附圖閱讀本發明的【具體實施方式】後，本發明的其他優點將變得更加清楚。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1表明1號豆柏經生物處理後製備的複合益菌肽-益生菌菌量組成與半年穩定 性。
[0025] 圖2表明2號豆柏經生物處理後製備的複合益菌肽-益生菌菌量組成與半年穩定 性。
[0026] 圖3表明豆柏原料經生物處理後製備為複合益菌肽的抗原蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0027] 圖4表明豆柏原料經生物處理後製備為複合益菌肽富含益生性有機酸。
[0028] 圖5表明豆柏原料經生物處理後製備為複合益菌肽可拮抗豬糞大腸菌群。
[0029] 圖6表明豆柏原料經生物處理後製備為複合益菌肽可顯著降低乳仔豬腹瀉率。 圖7為短小芽孢桿菌S3的生產工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0030] 為更好地了解該複合益菌肽產品的功能，下面結合附圖和具體實施例對本發明的 產品引用特點做進一步詳細的說明。
[0031] 實施例1
[0032] 一、短小芽孢桿菌S3的分離篩選
[0033] 2013年5月至2013年9月，從膠州沿海多處採集蝦養殖區域的水樣、底泥、對蝦腸 道糞便。底泥、對蝦腸道糞便樣品分別於無菌生理鹽水中10倍稀釋，充分研磨，取上清為樣 品液；水樣直接作為樣品液；樣品液分別接種於2216E液體培養基中30°C富集培養48h後 稀釋，塗布於2216E平板中進行菌株的分離、純化，共篩選出26株純菌。
[0034] 已純化單菌株採用平板點種法篩選頡頏菌。以副溶血弧菌為指示菌，將副溶血弧 菌接種於2216E液體培養基中培養18h，稀釋製備成105-106CFU/mL的菌懸液，取0. ImL塗布 2216E平板，備用。用無菌牙籤挑取待篩選的菌株，點接於含菌平板中，25°C恆溫培養24h， 觀察點接菌落周圍是否出現明顯的抑菌圈或覆蓋區。
[0035] 對分離到的26株細菌採用點種法篩選到3株對副溶血弧菌具有頡頏作用的菌株， 其中S3對副溶血弧菌具有較強的頡頏作用，能明顯抑制病原菌的生長，在病原菌周圍產生 明顯清晰的抑菌圈。
[0036] 經細菌生理生化方法初步鑑定，菌株S3為芽孢桿菌屬，其生物學特性：革蘭氏染 色陽性，在營養瓊脂平板上形成的菌落直徑約2mm，邊緣整齊光滑，中間褶皺，乳白色。菌體 形態呈杆狀，芽孢橢圓形，中生。
[0037] 二、短小芽孢桿菌的分子遺傳學分類鑑定
[0038] 首先提取菌株S3的DNA，以該DNA為模板，16S rRNA通用引物為引物，對16SrRNA 片段進行擴增，擴增片段進行序列測定。測序結果用Blast軟體與GenBank中相關屬種的 16S rRNA序列進行比對，結果顯示該菌株16S rRNA序列與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬 中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率達到99%。通過DNAMAN6.0 對Genbank中已有的芽孢桿菌屬的16S rRNA序列進行遺傳進化分析，結果顯示，菌株S316S rRNA與Bacillus pumilus同源性最高，判定該菌株為芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌。
[0039] 將篩選到的菌株S3進行菌種保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心（CGMCC);地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所；保藏日期=2014年5月13日；短小芽孢桿菌Bacillus pumilus的保藏編號為CGMCC No. 9161。
[0040] 三、複合益菌肽的組成
[0041] 本發明所述複合益菌肽由菌酶復配發酵劑添加到豆柏中發酵而成，所述菌酶復配 發酵劑由四種益生菌、四種蛋白酶和碳源複合而成，所述四種益生菌分別為丁酸梭菌，短小 芽孢桿菌S3,植物乳桿菌，布拉酵母菌；所述四種蛋白酶分別為酸性蛋白酶，中性蛋白酶， 鹼性蛋白酶，多肽蛋白酶；所述短小芽孢桿菌S3的分類命名為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，其保藏編號為：CGMCC No. 9161。所述碳源為佔菌酶復配發酵劑質量9%-10%的 葡萄糖，添加的葡萄糖作物載體與碳源，以滿足各種菌的生長需求，並促進乳酸、乙酸、丁酸 等益生性有機酸的產生。
[0042] 所述四種益生菌在菌酶復配發酵劑中的含菌量分別是：丁酸梭菌：不低於 I X 106CFU/g ;短小芽孢桿菌S3 :不低於I X 106CFU/g ;植物乳桿菌：不低於I X 106CFU/g ;布 拉酵母菌：不低於lX105CFU/g。所述四種蛋白酶在菌酶復配發酵劑中的含量分別是：酸性 蛋白酶：不低於500U/g衝性蛋白酶：不低於1000U/g ;鹼性蛋白酶：不低於4000U/g ;多肽 蛋白酶：不低於4500U/g。
[0043] 本發明所使用的丁酸梭菌、植物乳桿菌和布拉酵母菌均為市售商品化的菌粉，所 使用的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶和多肽蛋白酶均為市售商品化的酶製劑，而所 述短小芽孢桿菌S3是自行篩選並保存的，其生產工藝流程如圖7所示。
[0044] 四、本發明所述的複合益菌肽的製備方法包括如下步驟：
[0045]
[0046]
[0047] (1)在豆柏中添加佔豆柏質量50-60 %的水形成發酵底料，接種佔豆柏質量10% 的所述菌酶復配發酵劑，混合均勻形成發酵物料；
[0048] (2)將所述發酵物料儲存於錫箔密封袋內，於200°C封口，置於37°C恆溫培養箱 內，發酵72h。
[0049] 所述步驟（2)中發酵物料處於完全密封環境中，前24h內，物料中仍殘存有氧氣， 好氧的短小芽孢桿菌S3與兼性好氧的布拉酵母菌迅速生長；24h-48h時，隨著氧氣的不斷 消耗與其他氣體的逐漸產生，兼性厭氧的植物乳桿菌逐漸佔據優勢，酵母菌菌也逐漸進入 發酵模式，此間可產生乳酸、乙酸等多種益生性有機酸；48h-72h時，當氧氣完全耗盡後，完 全厭氧菌丁酸梭菌逐漸佔據優勢，並分泌丁酸，有利於改善動物腸道。在完全密封的環境 下，72h內實現了四種特性益生菌的接力生長，可產生多種益生性物質。
[0050] 所述步驟（2)中發酵物料處於完全密封環境中，不同時間段內不同的菌優勢生 長，造成環境PH也是逐漸變化的，基本為降低的趨勢。前期pH高於5時，鹼性蛋白酶與多 肽蛋白酶可發揮一定酶解作用，後期PH低於5後，主要由中性蛋白酶與酸性蛋白酶發揮生 物降解功能。四種酶的酶切位點各不相同，可有效降解抗原蛋白，大幅提高酸溶蛋白、鹼解 蛋白比例，增加游離胺基酸含量，提高產品的體外蛋白消化率。
[0051] 所述步驟（2)中發酵物料處於完全密封環境中，pH逐漸降低，四種酶交替起作用， 且酶切位點各不相同，可有效降解抗原蛋白，大幅提高酸溶蛋白、鹼解蛋白比例，增加游離 胺基酸含量，提高產品的體外蛋白消化率。
[0052] (3)發酵完成後，於40°C低溫烘乾，粉碎過60目篩，形成複合益菌肽產品；
[0053] 所述步驟（3)中，低溫烘乾處理前後，最終的複合益菌肽產品與發酵溼料相比，丁 酸梭菌、短小芽孢桿菌S3、植物乳桿菌、布拉酵母菌等都有一定比例的存活，芽孢菌存活率 高於89 %，且半年內室溫條件下活菌存活率高於90 %。
[0054] 所述複合益菌肽產品富含益生菌、有機酸等，並具有雜菌抗性，用於乳仔豬飼料配 制，以5-15%比例添加，可顯著降低仔豬腹瀉率。
[0055] 所述複合益菌肽產品，具備一定的豬糞大腸菌群抗性。
[0056] 以本發明所述方法，對1號與2號兩種豆柏原料（均為市售的常見豆柏原料）進 行生物處理，得到1號與2號兩種複合益菌肽。
[0057] 實施例2
[0058] 分別測定發酵72h時發酵終點溼料、低溫烘乾後的所述複合益菌肽產品、室溫存 放6月後的複合益菌肽產品中四種菌的含量。利用胰腖-亞硫酸鹽-環絲氨酸培養基，採 用夾層培養法，測定丁酸梭菌菌量；利用營養瓊脂培養基，採用稀釋塗布法，測定短小芽孢 桿菌S3菌量；利用MRS培養基，採用傾注培養法，測定植物乳桿菌菌量；利用YH)培養基，採 用稀釋塗布法，測定布拉酵母菌菌量。鑑於四種菌菌量差異較大，以log CFU/g表示菌量。
[0059] 圖1展示了 1號豆柏經生物處理後製備的複合益菌肽-益生菌菌量組成與半年 穩定性，圖2展示了 2號豆柏經生物處理後製備的複合益菌肽-益生菌菌量組成與半年 穩定性。低溫烘乾處理前後，最終的複合益菌肽產品與發酵溼料中各菌都有一定比例的存 活，其中芽孢菌烘乾存活率高於89%，且室溫條件下存放半年後，活菌存活率高於90%。 1號複合益菌肽的發酵溼料中，丁酸梭菌菌量達I. 08X 106CFU/g，低溫烘乾後，含丁酸梭 菌9. 7 X 105CFU/g，烘乾存活率達89. 81 %，且半年後菌量仍保持8. 8 X 105CFU/g，存活率達 90. 72%，說明該產品中丁酸梭菌耐熱性強，穩定性好，這極大地提高了該菌在動物體內發 揮作用的可能性；短小芽孢桿菌S3與丁酸梭菌類似，發酵溼料中菌量達4. 5X 107CFU/g， 低溫烘乾後菌量達4. 2 X 107CFU/g，烘乾後存活率達93. 34 %，室溫存放半年後菌量仍保持 4X 107CFU/g，活菌存活率達95. 24%，說明其孢子經過烘乾過程有所選擇，耐受性更強，具 有較好的穩定性，可增強該產品的應用潛力；1號複合益菌肽的發酵溼料中，植物乳桿菌菌 量達3. 3X 107CFU/g，在烘乾過程中下降1個數量級，菌量為3. 83X 106CFU/g，室溫存放半 年後，仍保持I. 96X 106CFU/g，活菌菌量數量級未變，存活率達51. 17%，說明複合益菌肽 產品中含有較多植物乳桿菌，雖有損失但能耐受一定時間的存儲；1號複合益菌肽的發酵 溼料中，布拉酵母菌量可達7. 5X105CFU/g，但其耐受性較差，低溫烘乾粉碎產品中菌量達 3. 5X 104CFU/g，室溫存放半年後酵母菌僅達4. I X 103CFU/g。2號複合益菌肽中各菌的含 量與比例、烘乾前後存活率、室溫存放半年前後活菌存活率等指標，與1號複合益菌肽中類 似，但其植物乳桿菌菌量略高，其他菌菌量略低。
[0060] 實施例3
[0061] 利用SDS-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳）定性確定抗原蛋白的降解情況，利用 ELISA(酶聯免疫吸附測定法）試劑盒定量測定抗原蛋白的去除率。利用TCA(三氯乙酸浸 提法）測定酸溶蛋白（佔粗蛋白，％ );參考GB/T19541-2004飼料用大豆柏，利用0.2% KOH測定KOH溶解度，參考國標GBT-8314-2002游離胺基酸總量測定，測定游離胺基酸含量； 利用中國農科院北京畜牧獸醫研究所研發的SDS- II單胃動物仿生消化系統，模擬測定體 外蛋白消化率。
[0062] 抗原蛋白的SDS-PAGE定性測定結果如圖3所示，ELISA定量測定結果如表1所示。 1號與2號豆柏原料不同蛋白亞基的條帶深淺略有差異，大豆球蛋白、β-大豆伴球蛋白、抗 原蛋白的具體測定值也略有不同，但豆柏原料與生物處理後的複合益菌肽產品之間的對比 趨勢是類似的：經生物處理後，複合益菌肽的大分子抗原蛋白幾乎完全降解為小分子蛋白 (蛋白分子量低於HKDa)，從1號與2號豆柏原料到複合益菌肽產品，ELISA試劑盒測定的 抗原蛋白去除率也分別達到91. 98%與93. 21%。
[0063] 表2顯示了兩種豆柏經處理製備為複合益菌肽產品後，酸溶蛋白（佔粗蛋白，％ )、 KOH溶解度、游離胺基酸、單胃動物體外仿生消化率等指標的變化。從1號與2號豆柏原料 到複合益菌肽產品，酸溶蛋白/cp的增幅分別為27. 64%與29. 15%，KOH溶解度的增幅分 別為14. 13%與16. 81%，游離胺基酸的增幅分別為9. 34%與9. 26%，體外蛋白消化率的增 幅分別為13. 82%與13. 51%。這些指標的變化，主要得益於專一性菌酶復配發酵劑對豆柏 的生物酶解與發酵處理，也與之前的大分子蛋白幾乎完全降解為小分子蛋白試驗結果相對 應。該複合益菌肽產品用於乳仔豬料的製備，更加有利於蛋白類營養的吸收與消化，並可有 效避免大分子抗原蛋白引起的應激性反應。
[0064] 表1表明豆柏原料經生物處理後製備為複合益菌肽的抗原蛋白ELISA試劑盒測 定結果

【權利要求】
1. 一種複合益菌肽，其特徵在於它由菌酶復配發酵劑添加到豆柏中發酵而成，所述菌 酶復配發酵劑由四種益生菌、四種蛋白酶和碳源複合而成，所述四種益生菌分別為丁酸梭 菌、短小芽孢桿菌S3、植物乳桿菌和布拉酵母菌；所述四種蛋白酶分別為酸性蛋白酶、中 性蛋白酶、鹼性蛋白酶和多肽蛋白酶；所述短小芽孢桿菌S3的分類命名為短小芽孢桿菌 應其保藏編號為：CGMCC No. 9161。
2. 根據權利要求1所述的複合益菌肽，其特徵在於：所述四種益生菌在菌酶復配發酵 劑中的含菌量分別是：丁酸梭菌：不低於IX 1〇6 CFU/g ;短小芽孢桿菌S3 :不低於IX 106 CFU/g ;植物乳桿菌：不低於1 X 106 CFU/g ;布拉酵母菌：不低於1 X 105 CFU/g。
3. 根據權利要求1所述的複合益菌肽，其特徵在於：所述四種蛋白酶在菌酶復配發酵 劑中的含量分別是：酸性蛋白酶：不低於500U/g ;中性蛋白酶：不低於1000U/g ;鹼性蛋白 酶：不低於4000U/g ;多肽蛋白酶：不低於4500U/g。
4. 根據權利要求1所述的複合益菌肽，其特徵在於：所述碳源為佔菌酶復配發酵劑質 量9% -10%的葡萄糖。
5. 權利要求1-4任一項所述的複合益菌肽的製備方法，其特徵在於它包括如下步驟： (1) 在豆柏中添加佔豆柏質量50-60%的水形成發酵底料，接種佔豆柏質量10%的所述 菌酶復配發酵劑，混合均勻形成發酵物料； (2) 將所述發酵物料儲存於錫箔密封袋內，於200°C封口，置於37°C恆溫培養箱內，發 酵 72h ; (3) 發酵完成後，低溫烘乾，粉碎過篩，形成所述複合益菌肽。
6. 根據權利要求5所述的複合益菌肽的製備方法，其特徵在於：所述步驟（3)中發酵 物料於40°C低溫烘乾，粉碎過60目篩。
7. 權利要求1-4任一項所述的複合益菌肽在製備用於飼餵乳仔豬的飼料添加劑中的 應用。
8. 根據權利要求7所述的複合益菌肽在製備用於飼餵乳仔豬的飼料添加劑中的應用， 其特徵在於：所述複合益菌肽以佔飼料質量比為5-15%的比例添加到飼料中。
9. 根據權利要求7所述的複合益菌肽在製備用於飼餵乳仔豬的飼料添加劑中的應用， 其特徵在於：所述複合益菌肽拮抗豬糞大腸菌群。
【文檔編號】A23K1/14GK104222493SQ201410360547
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】李慧芬, 張大偉, 馬成 申請人:青島尚德生物技術有限公司