增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用的製作方法
2023-10-04 19:47:19 2
專利名稱：增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術中的基因免疫，特別是涉及能增強基因免疫效果的載體與方法及其在抗體生產、疫苗製備及免疫接種方面的應用。
本發明的原理是根據APC介導B細胞及T細胞免疫反應的基本原理、抗原-抗體複合物增強APC抗原呈遞效果的事實，將抗原與Fc段融合，借Fc段將抗原導向APC，從而增強對抗原的免疫反應，並通過這種增強了的免疫反應，使DNA疫苗產生更好的保護性或治療效果，同時還可以用核酸免疫製備高效價的抗血清。
本發明所述的APC介導B細胞及T細胞免疫反應的基本原理是通過基因免疫誘導機體產生加強的免疫反應，一般都涉及到多種細胞及分子的複雜過程。DNA疫苗可以通過幾個不同的途徑誘導機體的免疫系統，其中一個途徑是DNA疫苗進入注射部位的細胞(比如肌細胞或上皮細胞)，這些細胞表達並釋放疫苗編碼的抗原，根據疫苗載體的不同，表達的抗原或者通過分泌過程以完整的蛋白而釋放，或者表達在這些細胞的膜表面。假若這些細胞因某種原因而死亡，其表達的蛋白也會釋放出來。這些不同來源的細胞外抗原與細胞表面(通過細胞表面IgM或非Ig受體)結合，然後抗原與受體的複合物被吞噬細胞外抗原也可通過胞飲機理進入APC系統。在與APC結合之前、之後或過程中，抗原有被細胞外間隙的蛋白酶降解的可能。總之，DAN疫苗產生的抗原進入APC，在APC內被加工，與MHCI及MHCII型抗原相結合形成抗原-MHC複合物，然後活化CD4+T(Th1及/或Th2)細胞，從而調節免疫反應。由於B細胞的活化、增殖、分化以及其Ig類型轉換都需要CD4+T細胞的協助，將抗原以抗原-MHC II複合物的方式呈遞給B細胞，對產生抗原特異性抗體至關重要。正就是通過這一途徑，DNA疫苗除了具有能夠活化CD8+CTL的功能外，還能夠刺激CD4+T細胞。
另外一個平行的途徑是DNA疫苗進入APC或其它組織細胞並表達抗原，抗原在APC胞漿內被蛋白酶降解，由此產生的蛋白片段被TAP-1及TAP-2所識別，轉運至粗面內質網(RER)腔，與MHC I形成複合物並表達於APC表面，被具有特異性T細胞受體的CD8+CTL識別，在與其它適當因子的協調下，這種CD8+CTL分化為具有活性功能的CTL。
DNA疫苗還可以誘導那些結合了或者吞噬了其編碼的抗原的細胞因子。APC與抗原的相互作用會刺激對相關細胞具有正反饋效果的細胞因子，比如使CD4+Th細胞分化增殖為Th1及Th2的細胞因子。因此，在DNA疫苗中除了抗原的基因外，有的還包括一種或幾種編碼細胞因子的基因。
總之，B細胞參與體液免疫，產生抗體；T細胞參與細胞免疫並輔助B細胞成為可以產生抗體的漿細胞。一個高效價、長期的保護性免疫需要T細胞的活化。其它免疫活性細胞包括巨噬細胞、單核細胞、以及其它APC在介導B細胞的成熟、T細胞的活化等免疫反應中也起著至關重要的作用。不同的APC可以誘導T細胞不同程度的反應。之所以有這種量上的差別，其釋放的細胞因子的作用不可忽視。
本發明所述的抗原-抗體複合物增強APC抗原呈遞效果的事實為疫苗的免疫效果取決於對淋巴細胞的抗原呈遞的有效性。由於網狀內皮細胞可以通過激活靜態T細胞而誘發初次免疫反應，因此網狀內皮細胞具有抗原呈遞效果。將抗原導向APC上的特異性受體可以影響抗原在細胞內的加工過程，從而也會影響到所產生的多肽片段的性質，以及這些片段與MHC I、MHC II分子結合的效果，還有它們刺激的T細胞的類型。所以，將抗原特異地導向APC是增強疫苗免疫效果的有力措施。
本發明所述的增強對抗原的免疫發應的原理是抗原和其它可與APC表面結合的導向分子相連接可增強APC對抗原的攝取。這些導向分子包括C3b、β-2微球蛋白、IgFc受體特異性抗獨特型抗體、以及MHC II型分子等。免疫球蛋白Fc片段可與APC以及B細胞表面的特異性Fc受體(FcR)相結合。Fc片段位於每一免疫球蛋白的重鏈恆定區，由鉸鏈區一部分、CH2、及CH3功能區組成。不同類型的免疫球蛋白的Fc段的DNA序列具有交叉同源性。單核細胞及網狀內皮細胞等APC細胞表面的FcR介導的抗原呈遞反應具有不可忽視的作用，它們可以有效地引起T細胞的活化。當抗原-抗體複合物與單核巨噬細胞表面的FcR結合後，抗原進入細胞內，接著被加工、呈遞，使其活化T細胞的效應大大增強，只需1/100至1/10的抗原量就可引起同樣強大的T細胞反應。
本發明的具體技術方案如下本發明是採用含有嵌合DNA的質粒在體內表達可以導向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段組成的以肽鍵聯結的融合蛋白，並用編碼抗原的核酸免疫。
本發明所述的嵌合DNA分子是插在含有蛋白轉錄及翻譯的調控序列的真核表達載體中的，比如啟動子及多聚A等；嵌合DNA分子含有SP、IE、靶蛋白(抗原)及Fc。
本發明所述的Fc段來源於不同類型的免疫球蛋白的重鏈恆定區包括鉸鏈區在內的C-端部分，其含有與FcR全部或者部分結合序列的結合位點，能與抗原融合併將其導向B細胞及APC而促進APC對抗原的攝取及加工。
本發明所述的靶抗原包括病毒、細菌抗原、真菌抗原、原蟲及其它寄生蟲抗原、腫瘤抗原、自身免疫性抗原、過敏性抗原、移植排斥抗原、任何異源性(抗原性)蛋白質等。
本發明嵌合DNA分子的SP是位於融合蛋白N-端的任何蛋白的信號肽，有助於融合蛋白的翻譯、加工、轉運及釋放。分泌的蛋白質經多肽酶的作用除去SP。
本發明嵌合DNA分子的IE是由T細胞抗原位點組成並位於SP之後激活T細胞。如果抗原本身含有SP，則可直接將抗原與Fc融合而不要載體提供的SP；或者可除去抗原的SP，再將不含SP的抗原與載體的SP-IE相連。如果抗原分子足夠大，並有較強的T細胞位點，可不要載體上的IE。如果抗原是個小分子並缺乏T細胞位點，載體上的IE就會起到很大的作用。
本發明所述的載體是指由常規真核表達載體所具有的關鍵構件和抗原與Fc段的融合體之前的一個信號肽片段SP及一個免疫增強片段IE組成，本發明將上述載體稱為pseFc(見
圖1)。
本發明所述的常規真核表達載體是指任何含有抗原及Fc、可以自我複製、含有基因表達以及質粒在原核細胞內增殖的關鍵部件的核酸序列，包括線型核酸、質粒、噬菌體及各種不同的DNA和/或RNA病毒載體。
本發明所述的蛋白質是指由肽鍵聯在一起的與長度及翻譯後是否修飾(如糖基化、磷酸化)無關的兩個或兩個以上的胺基酸。
本發明所述的編碼抗原的核酸片段是指編碼已知的和/或未知的蛋白的基因片段，比如病原體抗原以及腫瘤抗原等，抗原可以是一個，也可以是多個同源或異源性抗原的串聯。
本發明所述的機體包括嚙齒類及非嚙齒類，即所有的脊椎動物，如靈長類及人類。
本發明在免疫方面的應用如下A、通過將來自同屬或者不同種屬的編碼抗原的基因片段與編碼免疫球蛋白Fc段的基因片段可以前後順序互換地連接到一起，誘導機體對抗原產生高效的細胞免疫反應及保護性抗體反應。
B、通過非蛋白類抗原在體內製備出用於科研或者疾病的診斷和治療的抗體。
C、通過在體內表達的抗原-Fc融合體來直接製備不需在體內表達及純化的已知抗原的抗體或者未知抗原的抗體。
D、通過核酸免疫製備高效價的抗血清。
附圖及圖面說明圖1 pseFc載體結構示意2 HIV-1gp120基因疫苗結構示意3 HIV-1gp120 誘導的抗體反應圖4 HIV-1Gag基因疫苗結構示意5 HIV-1Gag 誘導的抗體反應圖6 pesMucl基因疫苗結構示意7 誘導的抗體反應本發明的抗原與Fc是通過重組DNA技術在體內直接產生並以肽鍵相連接的，其結合牢固而穩定，既提供了高效的機體保護性反應，同時又對機體無副作用；利用基因製備的抗體，其抗原不需在體外表達及純化；通過在體內表達抗原-Fc融合蛋白的增強DNA疫苗，不是用抗原免疫，而是用編碼抗原的核酸免疫機體，可在體內產生分泌性蛋白，不管這種分泌性融合蛋白是由APC還是非APC產生，它都可被導向APC，從而提高了抗原的穩定性，增高了抗原的免疫原性，加強了抗原與APC的相互作用以及APC對抗原的攝取和呈遞。
以4隻3周大的Balb/c小鼠為一組，於前腿肌肉注射100微克的pse120Fc、pse120或pseFc，2周後用同一質粒再加強免疫一次。初次免疫後第4周採血，用ELISA夾心法檢測HIV-lgp120的特異性抗體。結果pse120Fc及pse120組血清中HIV-lgp120的特異性抗體效價分別為16561和1234；pseFc組的血清中沒有HIV-1gp120的特異性抗體(見圖3)。
實施例2HIV-lGagDNA疫苗對Balb/c小鼠的免疫原性把HIV-1pNL4-3毒株Gag的基因插於pseFc載體的KpnI和XhoI位點，IE及Fc之間，或者插於pseFc載體的KpnI和XhoI位點，IE之後而無Fc，形成的疫苗分別叫做pseGagFc及pseGag(見圖4)。質粒DNA是由Qiagen公司的Max試劑盒製備。
以4隻3周大的Balb/c小鼠為一組，於前腿肌肉注射100微克的pseGagFc、pseGag或pseFc，2周後用同一質粒再加強免疫一次。初次免疫後第4周採血，用裂解的HIV-1Gag病毒顆粒為抗原通過Western雜交法檢測對HIV-1Gag的特異性抗體。結果以pseGagFc組的HIV-1Gag的特異性抗體效價為100，pseGag組的血清中HIV-1Gag的特異性抗體效價則為12；pseFc組的血清中沒有HIV-1Gag的特異性抗體(見圖5)。
實施例3Mucl20肽DNA疫苗對Balb/c小鼠的免疫原性人的Mucl基因編碼一個20胺基酸的多肽(PDTRPAPGATAPPAHGVTSA)，我們把Mucl 20個胺基酸的編碼基因插於pseFc載體的HindIII和XhoI位點，IE及Fc之間，或者插於pseFc載體的HindIII和XhoI位點，IE之後而無Fc，形成的疫苗分別叫做pseMuclFc及pseMucl(見圖6)。質粒DNA是由Qiagen公司的Max試劑盒製備。
以4隻3周大的Balb/c小鼠為一組，於前腿肌肉注射100微克的pseMuclFc、pseMucl或pseFc，2周後用同一質粒再加強免疫一次。初次免疫後第4周採血，用細菌表達的GST-Mucl蛋白通過Western雜交法檢測對Mucl的特異性抗體。結果以pseMuclFc組的Mucl特異性抗體效價為100，pseMucl組血清中Mucl的特異性抗體效價則小於2；pseFc組的血清中沒有Mucl的特異性抗體(見圖7)。
本發明的抗原與Fc以肽鍵相連接，其結合牢固而穩定，既提供了高效的機體保護性反應，同時又對機體無副作用；利用基因製備的抗體，其抗原不需在體外表達及純化；加強的DNA疫苗不是用抗原免疫，而是用編碼抗原的核酸免疫機體，可在體內產生分泌性蛋白，不管這種分泌性融合蛋白是由APC還是非APC產生，它都可被導向APC，從而提高了抗原的穩定性，增高了抗原的免疫原性，加強了抗原與APC的相互作用以及APC對抗原的攝取和呈遞。
權利要求
1.增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於採用含有嵌合DNA的質粒在體內表達可以導向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段組成的以肽鍵聯結的融合蛋白，並用編碼抗原的核酸免疫。
2.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於嵌合DNA分子是插在含有蛋白轉錄及翻譯的調控序列的真核表達載體中的。
3.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於Fc段來源於不同類型的免疫球蛋白的重鏈恆定區包括鉸鏈區在內的C-端部分，其含有與FcR全部或者部分結合序列的結合位點。
4.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於嵌合DNA分子的SP是位於融合蛋白N-端的任何蛋白的信號肽。
5.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於嵌合DNA分子的IE是由T細胞抗原位點組成並位於SP之後激活T細胞。
6.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於載體是指由常規真核表達載體所具有的關鍵構件和抗原與Fc段的融合體之前的一個信號肽片段SP及一個免疫增強片段IE組成。
7.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於通過將來自同屬或者不同種屬的編碼抗原的基因片段與編碼免疫球蛋白Fc段的基因片段可以前後順序互換地連接到一起，誘導機體對抗原產生高效的細胞免疫反應及保護性抗體反應。
8.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於通過非蛋白類抗原在體內製備出用於科研或者疾病的診斷和治療的抗體。
9.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於通過在體內表達的抗原-Fc融合體來直接製備不需在體內表達及純化的已知抗原的抗體或者未知抗原的抗體。
10.根據權利要求1所述的增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方面的應用，其特徵在於通過核酸免疫製備高效價的抗血清。
全文摘要
本發明公開了一種增強基因免疫效果的載體與方法及其在免疫方方面的應用，採用含有嵌合DNA的質粒在體內表達可以導向APC表面FcR的由抗原及Ig的Fc段組成的以肽鍵聯結的融合蛋白，從而增強抗原誘導的體液免疫及細胞免疫效應，通過增強的免疫反應，DNA疫苗可以產生更好的保護性或治療效果，同時，還可以用核酸免疫製備高效價的抗血清。
文檔編號C12N15/79GK1442482SQ0211342
公開日2003年9月17日 申請日期2002年3月6日 優先權日2002年3月6日
發明者餘力, 張明傑 申請人:餘曉紅