一種DNA聚合酶促進劑的製備方法及其應用與流程
2023-10-17 10:01:24 1
本發明屬於蛋白質工程和核酸擴增技術領域，尤其是涉及一種DNA聚合酶促進劑的製備方法及其應用。
背景技術：
聚合酶鏈式反應（PCR）是一項在生命科學研究中廣泛應用的分子生物學技術，用於擴增、檢測各種核酸片斷。各種耐高溫DNA聚合酶廣泛應用於PCR，主要分為A型和B型DNA聚合酶。A型DNA聚合酶沒有校正活性，擴增DNA的忠實度遠低於B型DNA聚合酶。B型DNA聚合酶具有校正活性，擴增DNA的忠實度高。PCR在高溫下進行，高溫導致DNA中的dC、dA鹼基脫氨基生成dU、dI鹼基。B型DNA聚合酶對DNA中dU、dI鹼基的結合力很高，造成DNA合成反應停滯在dU、dI鹼基處，因此B型DNA聚合酶活性會被DNA中的dU、dI鹼基所抑制。如果把這部分被抑制的B型DNA聚合酶釋放出來將會提高PCR中的有效聚合酶濃度，大大提高PCR產量。另外dU鹼基會導致G:C→A:T突變，dI鹼基導致A:T→T:A/G:C/C:G突變。切除修復dU、dI鹼基還可以提高聚合酶催化PCR的忠實度。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對B型DNA聚合酶的缺點，提供一種新型的DNA聚合酶促進劑，該DNA聚合酶促進劑為熱穩定性尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）、次黃嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和內切核酸酶IV的混合物。其中UDG和AlkA可以有效的切除PCR中生成的dU和dI鹼基，生成脫鹼基位點，釋放出B型DNA聚合酶去催化PCR，從而提高PCR產量。然而UDG和AlkA生成的脫鹼基位點會在PCR中引入鹼基突變，降低PCR的忠實度。在本發明中，熱穩定性內切核酸酶IV具有脫鹼基位點特異性的內切酶活性，切斷脫鹼基位點，消除脫鹼基位點導致的鹼基突變，恢復PCR的忠實度。因此該DNA聚合酶促進劑為熱穩定性尿嘧啶糖苷酶（UDG）、次黃嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和內切核酸酶IV的混合物，其使用簡便，促進效果好、通用性強，對所有B型DNA聚合酶均有促進效果。同時也可用於A型DNA聚合酶，此時促進劑雖然不能夠提高PCR產量，但DNA糖苷酶和內切核酸酶IV的聯合作用可以修復dU、dI鹼基，顯著提高A型聚合酶合成DNA的忠實度；另外內切核酸酶IV還具有校正活性（3』外切酶活性），該校正活性可以補充A型DNA聚合酶缺失的校正活性，進一步提高其催化PCR的忠實度。
為了實現上述目的，本發明的技術方案是設計一種DNA聚合酶促進劑的製備方法，包括步驟：首先製備熱穩定尿嘧啶糖苷酶（UDG）、次黃嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和內切核酸酶IV。然後將尿嘧啶糖苷酶（UDG）、次黃嘌呤DNA糖苷酶（AlkA）和內切核酸酶IV混合溶解於蛋白儲存液（20 mM Tris-HCl pH8.0，1 mM DTT，100 mM KCl，50%甘油）中，製備成DNA聚合酶促進劑。在PCR中DNA聚合酶促進劑的工作濃度為50－500納克/50微升反應。
本發明的具體步驟如下：
1、熱穩定性UDG的製備。首先將udg基因克隆到原核表達載體中，構建UDG的重組表達載體。然後將UDG重組表達載體轉化到大腸桿菌等原核表達宿主中表達UDG蛋白。最後從原核表達宿主的細胞裂解液中純化UDG蛋白。
2、熱穩定性AlkA的製備。熱穩定性DNA糖苷酶AlkA的製備方法與熱穩定性UDG相似，只是克隆的基因為alka，其他步驟完全相同。具體操作參照步驟1。
3、熱穩定性內切核酸酶IV的製備。熱穩定性內切核酸酶IV的製備方法與熱穩定性UDG相同，只是克隆的基因為內切核酸酶IV的基因，其他步驟完全相同。具體操作參照步驟1。
4、DNA聚合酶促進劑的製備。最後將熱穩定性UDG、AlkA、內切核酸酶IV三者混合在一起，並溶解在儲存液（20 mM Tris-HCl pH8.0，1 mM DTT，100 mM KCl，50%甘油）中，保存於-20度或-80度。
5、DNA聚合酶促進劑在PCR中的應用。聚合酶鏈式反應體系組成：熱穩定性DNA 聚合酶反應緩衝液、dNTPs、熱穩定性DNA聚合酶（A型或B型）、正向引物與反向引物、DNA模板分子、DNA聚合酶促進劑。將PCR反應混合物進行聚合酶鏈式反應，擴增DNA。PCR結束後，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA聚合酶促進劑對PCR擴增產量的促進效果。
本發明的優點和有益效果在於：本發明一種DNA聚合酶促進劑的製備方法及應用中製備得到的DNA聚合酶促進劑的與現有的DNA聚合酶促進劑相比有顯著的進步。主要優點如下：（1）通用性強，促進劑可以促進所有B型DNA聚合酶催化的PCR。（2）並不降低PCR的忠實度，DNA糖苷酶和內切核酸酶IV的聯合作用可以修復校正dU、dI鹼基，並消除AP位點導致的鹼基突變，從而進一步提高了B型DNA聚合酶催化PCR的忠實度。（3）可以用於A型DNA聚合酶催化的PCR，提高A型DNA聚合酶的忠實度。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用於更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護範圍。
實施例：
利用火球菌的UDG和AlkA兩種DNA糖苷酶和內切核酸酶IV製備DNA聚合酶促進劑及其在Pfu DNA聚合酶催化的PCR中的應用。
第一步，火球菌UDG的製備。將火球菌udg基因克隆到原核表達載體pET28a中，克隆位點為NdeI和BamHI，構建火球菌UDG的重組表達載體pET28a-udg。然後將表達載體pET28a-udg轉化到大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中，當大腸桿菌生長到OD600=0.5時加入終濃度0.5mM的IPTG誘導火球菌UDG蛋白的表達。最後超聲波破碎IPTG誘導的大腸桿菌，並利用鎳離子親和色譜純化表達的火球菌UDG。
第二步，火球菌AlkA的製備。火球菌熱穩定性DNA糖苷酶AlkA的製備方法與熱穩定性UDG相似，只是克隆到pET28a的基因為alka，其它操作完全相同，具體操作參照第一步。
第三步，火球菌內切核酸酶IV的製備。火球菌熱穩定性內切核酸酶IV的製備方法與熱穩定性UDG相似，只是克隆到pET28a的基因為內切核酸酶IV基因，其它操作完全相同，具體操作參照第一步。
第四步，火球菌DNA聚合酶促進劑的製備。最後將火球菌的熱穩定性UDG、AlkA、內切核酸酶IV三者混合在一起，並溶解在儲存液（20 mM Tris-HCl pH8.0，1 mM DTT，100 mM KCl，50%甘油）中，保存於-20度或-80度。
第五步，火球菌DNA聚合酶促進劑在Pfu DNA聚合酶催化的PCR中的應用。按下列組成配製PCR反應體系：Pfu DNA 聚合酶反應緩衝液、dNTPs、Pfu DNA聚合酶、正向引物與反向引物、DNA模板分子、火球菌DNA聚合酶促進劑。將PCR反應混合物按下列反應條件進行PCR：95度5分鐘；（95度30秒，50度30秒，72度1分鐘）×30循環，72度3分鐘。PCR結束後，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產量，評價DNA聚合酶促進劑的促進效果。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。