一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒及其使用方法與流程

2023-10-04 00:56:19

本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：微滴式數字PCR(DropletDigitalTMPCR)被稱為第三代PCR技術，通常在人體體液例如血漿、尿液等樣本中的miRNA分子豐度普遍不高，常規PCR技術在檢測這類miRNA分子時存在誤差較大或難以測出的問題，正由於數字PCR在微量檢測技術上的重大創新和突破，目前已成為液體活檢中認知度最高的技術手段。基於數字PCR平臺，在人體體液例如血清或血漿miRNA檢測過程中，需要經過總miRNA提取，miRNA反轉錄，miRNA檢測三大步驟。不同於人體組織或細胞中的miRNA檢測可以使用U6或RNU6B等作為內參基因，目前還沒有明確定論統一可用的血清或血漿miRNA內參，並且微滴式數字PCR採用的是絕對定量的方式，檢測結果顯示為樣品中待檢測分子的具體拷貝數濃度，因此，miRNA提取效率和miRNA反轉錄效率對數字PCR最終的檢測結果影響甚大，但目前還沒有一種方便快捷的用於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制的試劑盒。技術實現要素：本發明的目的在於克服現有技術的缺點，提供一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒；本發明的第二目的在於提供基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒的使用方法。本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒，其特徵在於，它包括人工合成的miRNA、反轉錄引物、檢測上引物、檢測下引物和DEPC水，所述人工合成miRNA引物序列如SEQIDNo.1所示，具體為：5』-UCACCGUGUGUAGAUCAGCUUG-3』；所述反轉錄引物序列如SEQIDNo.2所示，具體序列為：5』-GTCGTATCCAGTGCCACACGTCCTCGAGGCTTAAGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3』；所述檢測上引物序列如SEQIDNo.3所示，具體序列為：5』-AGTGGCTCACCGTGTGTAGATC-3』；所述檢測下引物序列如SEQIDNo.4所示，具體序列為：5』-GTATCCAGTGCCACACGTCCT-3』。進一步地，所述人工合成的miRNA濃度為3×106copies/μl，所述反轉錄引物的濃度為5μM，所述檢測上引物和檢測下引物的濃度為10μM，所述DEPC水的質量百分比濃度為1％。進一步地，所述人工合成的miRNA體積為8μl，所述反轉錄引物、檢測上引物和檢測下引物的體積各為1μl，所述DEPC水的體積為1ml。一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒的使用方法，它包括以下步驟：S1.用DEPC水稀釋人工合成的miRNA至原濃度的1/10倍；S2.提取生物體體液的總miRNA為樣品，加入裂解液類buffer裂解樣品中RNA酶後，樣品中加入4μl稀釋後的人工合成的miRNA；S3.設定提取樣品中總miRNA最終溶解體積為A，配製對照樣品，具體步驟為：吸取4μl稀釋後的人工合成的miRNA溶於A-4μl體積的DEPC水中；S4.在反轉錄樣品中待檢測靶miRNA同時，單獨將樣品和對照樣品進行反轉錄人工合成的miRNA，每10μL反應體系中加入1μl反轉錄引物；S5.在數字PCR檢測樣品中待檢測靶miRNA同時，單獨對樣品和對照樣品進行數字PCR染色法檢測人工合成的miRNA，反應體系中每20μl加入檢測上引物和檢測下引物各0.5μl；S6.設定數字PCR檢測樣品最終結果為Xcopies/μl，對照樣品最終結果為Ycopies/μl，按下述結果進行判斷：A.X/Y＝0.8～1，表示本次實驗檢測的靶miRNA結果真實可靠；B.X/Y＜0.8，表示本次實驗檢測的靶miRNA結果誤差大，重新提取miRNA；C.X/Y＞1，表示對照樣品配製存在問題，重新配製後實驗。進一步地，步驟S3中所述A為10～60μl。本發明具有以下優點：本發明試劑盒提供的人工合成miRNA序列在人體中絕對不存在類似序列，避免了可能出現的PCR假陽性擴增，不但可作為數字PCR檢測的外源性內參miRNA用於質量控制，且由於miRNA分子自身結構穩定、不易降解的特點有利於其長期穩定保存。此外，本試劑盒提供的反轉錄莖環引物和檢測引物在數字PCR平臺檢測時均驗證可得到穩定可靠的檢測結果。本發明試劑盒的使用方法操作簡單、使用方便，適用於大批量檢測。附圖說明圖1為miRNA-122數字PCR檢測結果；圖2為人工合成miRNA數字PCR檢測結果。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護範圍不局限於以下所述。實施例1：一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒，它包括人工合成的miRNA、反轉錄引物、檢測上引物、檢測下引物和DEPC水，所述人工合成miRNA引物序列如SEQIDNo.1所示，所述反轉錄引物序列如SEQIDNo.2所示，所述檢測上引物序列如SEQIDNo.3所示，所述檢測下引物序列如SEQIDNo.4所示；所述人工合成的miRNA濃度為3×106copies/μl，體積為8μl，所述反轉錄引物的濃度為5μM，體積為1μl；所述檢測上引物和檢測下引物的濃度為10μM，體積各為1μl；所述DEPC水的質量百分比濃度為1％，體積為1ml。實施例2：一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒的使用方法，它包括以下步驟：S1.用DEPC水稀釋人工合成的miRNA至原濃度的1/10倍；S2.提取生物體體液的總miRNA為樣品，加入裂解液類buffer裂解樣品中RNA酶後，樣品中加入4μl稀釋後的人工合成的miRNA；S3.設定提取樣品中總miRNA最終溶解體積為10～60μl(體積A)，配製對照樣品，具體步驟為：吸取4μl稀釋後的人工合成的miRNA溶於(A-4μl)體積的DEPC水中；S4.在反轉錄樣品中待檢測靶miRNA同時，單獨將樣品和對照樣品進行反轉錄人工合成的miRNA，每10μL反應體系中加入1μl反轉錄引物；S5.在數字PCR檢測樣品中待檢測靶miRNA同時，單獨對樣品和對照樣品進行數字PCR染色法檢測人工合成的miRNA，反應體系中每20μl加入檢測上引物和檢測下引物各0.5μl；S6.設定數字PCR檢測樣品最終結果為Xcopies/μl，對照樣品最終結果為Ycopies/μl，按下述結果進行判斷：A.X/Y＝0.8～1，表示本次實驗檢測的靶miRNA結果真實可靠；B.X/Y＜0.8，表示本次實驗檢測的靶miRNA結果誤差大，重新提取miRNA；C.X/Y＞1，表示對照樣品配製存在問題，重新配製後實驗。實施例3：基於數字PCR平臺檢測健康人血漿中的miRNA-122的表達水平過程中的質量控制1、樣本採集及處理使用Streck的Cell-FreeDNABCTTM管採集健康人血液一份共5ml。將血液轉移至新的15ml離心管中，4℃2000g離心10min，吸取上層血漿至一新的15ml離心管中。再將血漿4℃4000g離心20min，吸取上層血漿至一新的15ml離心管中。吸取200μL血漿於一新的1.5mlEP管中，使用QIAGEN的miRNeasySerum/PlasmaKit進行總RNA的提取。其中，在加入QIAzolLysisReagent靜置5min後，加入本試劑盒的4μL按10倍稀釋後的人工合成miRNA(後簡稱Skm-QCmiR)，後續試驗操作按照操作說明書進行，最終溶解體積為40μL。然後配製對照樣品(圖中簡稱Skm-QCmiR-C)，吸取4μL的稀釋後的Skm-QCmiR溶於36μL體積的DEPC水中。同一份血漿共提取三次，每次均200μL，由不同的三個實驗人員分別進行操作(圖中簡稱樣品1、樣品2、樣品3)，紫外分光光度計測定濃度均在40～50ng/μL。2、反轉錄miRNA-122和Skm-QCmiR將健康人樣品反轉錄miRNA-122和Skm-QCmiR，對照樣品反轉錄Skm-QCmiR。使用ABI公司的MicroRNAReverseTranscriptionKit進行實驗操作，miRNA-122的反轉錄引物和探針使用TaqManTMMicroRNAAssays試劑盒(貨號：002245)，反轉錄加樣體系參照說明書進行，其中TotalRNASample加樣1μL，Skm-QCmiR的反轉錄引物使用本發明試劑盒，反應加樣體系如表1所示：表1：成分體積100mMdNTPs(withdTTP)0.15μLMultiScribeTMReverseTranscriptase,50U/μL1μL10XRTBuffer1.5μLRNaseInhibitor0.188μLNucleaseFreeWater9.662μL本發明試劑盒反轉錄引物1.5μL健康人TotalRNASample或Skm-QCmiR-C1μLTotal15μLmiRNA-122和Skm-QCmiR的反轉錄反應條件均按反轉錄試劑盒說明書上進行操作。3、數字PCR檢測miRNA-122和Skm-QCmiR將健康人反轉錄後的樣品進行miRNA-122和Skm-QCmiR的檢測，對照樣品進行Skm-QCmiR的檢測。使用Bio-rad公司的QX200TMDropletDigitalTMPCR儀器平臺和相配套的ddPCRTMSupermix、DropletGenerationOil、DG8TMCartridges、DG8TMGaskets和ddPCRTMDropletReaderOil試劑耗材進行檢測。miRNA-122的檢測探針使用TaqManTMMicroRNAAssays試劑盒(貨號：002245)，檢測反應體系參照說明書進行加樣。Skm-QCmiR的檢測使用本發明試劑盒中的檢測上引物和下引物，反應加樣體系如表2所示：表2：成分體積QX200TMddPCRTMEvaGreenSupermix10μL本發明試劑盒檢測上引物0.5μL本發明試劑盒檢測下引物0.5μL健康人或Skm-QCmiR-C反轉錄後樣品1μLNucleaseFreeWater8μLTotal20μLmiRNA-122和Skm-QCmiR的PCR反應條件如表3所示：表3：4、結果及計算miRNA-122檢測結果如圖1所示，每組反應最終檢測的微滴數在14000～19000之間，均大於10000，表示結果有效。檢測結果顯示樣品1的miRNA-122含量為8.8copies/μL，樣品2的miRNA-122含量為8.7copies/μL，樣品3的miRNA-122含量為6.9copies/μL。Skm-QCmiR檢測結果如圖2所示，每組反應最終檢測的微滴數在12000～16000之間，均大於10000，表示數字結果有效。檢測結果顯示樣品1的Skm-QCmiR含量為82copies/μL，樣品2的Skm-QCmiR含量為84copies/μL，樣品3的Skm-QCmiR含量為74copies/μL，Skm-QCmiR-C的Skm-QCmiR含量為96copies/μL。通過質量標準計算公式可知，樣品1、樣品2和樣品3的得分分別為82/96＝0.854，84/96＝0.875，74/96＝0.771，因此本次實驗樣品1、樣品2檢測的miRNA-122結果真實可信，誤差較小，而樣品3檢測的miRNA-122結果可能存在檢測誤差較大情況。上述實施例中人工合成的miRNA簡稱為Skm-QCmiR，對照樣品簡稱為Skm-QCmiR-C。SEQUENCELISTING成都仕康美生物科技有限公司一種基於數字PCR平臺的miRNA檢測質量控制試劑盒及其使用方法20164PatentInversion3.5122RNA人工序列1ucaccguguguagaucagcuug22256DNA人工序列2gtcgtatccagtgccacacgtcctcgaggcttaagcactggatacgaccaagctga56322DNA人工序列3agtggctcaccgtgtgtagatc22421DNA人工序列4gtatccagtgccacacgtcct21當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp