優化的豬圓環病毒orf2截短基因的製作方法
2023-10-04 07:30:59 2
優化的豬圓環病毒orf2截短基因的製作方法
【專利摘要】本發明公開了優化的豬圓環病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQIDNO．1。所述基因在枯草芽孢桿菌中表達。所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。本發明採用以上技術方案，通過將去除NLS片段並根據密碼子偏好性優化後的截短基因，能夠成功的在枯草芽孢桿菌中得到表達。
【專利說明】優化的豬圓環病毒0RF2截短基因
【技術領域】
[0001]本發明屬於屬於生物【技術領域】，特別涉及優化的豬圓環病毒0RF2截短基因。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒(PCV)是一種小的、二十面體對稱、無囊膜、共價閉合、單股環狀DNA病毒，是引起斷奶仔豬多系統衰竭症候群的主要病原。根據PCV的致病性及全基因組序列，可分為兩個血清型:PCV1與PCV2。PCV2含有兩個主要開放閱讀框ORFl和0RF2。其中0RF2為702bp，編碼233個胺基酸，是病毒的主要結構蛋白，具有良好的免疫原性，是構建重組疫苗的首選基因。
[0003]PVC2的0RF2基因編碼Cap蛋白，為病毒的外殼蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市場上已經有以Cap蛋白為主要成份的疫苗產品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆蟲細胞表達系統生產。還未見微生物發酵生產的疫苗產品。[0004]大腸桿菌是得到廣泛應用的蛋白生產菌種。0RF2外殼蛋白在大腸桿菌中的表達已經有不少研究報導。比如，孫繼國2009，查振林2005，周倫江2008，陳德坤2010，zhangGaiping2012。但所有上述報導均未能表達0RF2的全長基因序列，而是去除信號肽NLS的截短序列。目前認為，其原因是0RF2外殼蛋白在N端的一段NLS序列，含有大腸的稀有密碼子。
[0005]在研究人員的努力下，已有少數研究組成功的在大腸桿菌中成功的表達了 0RF2基因。Celer2007報導，成功的在大腸桿菌的特殊菌種BL21-C0D0N-PLUS中表達了 0RF2全長基因序列。其成功在於運用了特殊的菌種，這種菌種被插入了多個野生型大腸桿菌不具備的稀有密碼子基因。另一個技術路徑是通過改變原0RF2基因的密碼子使用方法，得到優化的適於在大腸桿菌中表達的基因。Bumba2009首先報導了一個優化的序列(GenbankEU376523)，使得0RF2蛋白在大腸桿菌BL21中獲得了 10mg/L的表達量。Huang2012等人又報導了一個優化的序列(Genbank AY885225)，同樣獲得了全長蛋白的成功表達。這兩個序列是目前已知的兩個優化的0RF2-NLS序列。
[0006]枯草芽孢桿菌作為很有吸引力的外源基因表達的宿主，是目前原核表達系統中表達和分泌外源蛋白較理想的宿主。國內外在開發和使用枯草芽孢桿菌作為克隆和表達系統方面做了許多研究，但是到目前為止尚未有枯草芽孢桿菌表達PCV2-0RF2基因序列的的報導。
【發明內容】
[0007]為了解決現有技術中的不足，本發明的目的為提供能夠在枯草芽孢桿菌中成功得到表達的優化的豬圓環病毒0RF2截短基因。
[0008]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0009]優化的豬圓環病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0010]所述基因在枯草芽孢桿菌中表達。[0011]所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。
[0012]本發明採用以上技術方案，通過將去除NLS片段並根據密碼子偏好性優化後的截短基因，能夠成功的在枯草芽孢桿菌中得到表達。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]下面將結合【專利附圖】
【附圖說明】和【具體實施方式】對本發明做進一步詳細的說明。
[0014]圖1為本發明優化的豬圓環病毒0RF2截短基因的表達載體質粒PHT43-0RF2雙酶切後經瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.PHT43-0RF2經雙酶切的電泳條帶；2.PHT43-0RF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0015]圖2為本發明優化的豬圓環病毒0RF2截短基因的表達質粒PHT43-0RF2成功轉化枯草芽孢桿菌168後，提取表達菌株中質粒經BamHl和Smal雙酶切後經瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.BS168/PHT43-0RF2經雙酶切的電泳條帶；2.BS168/PHT43-0RF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0016]圖3為本發明優化的豬圓環病毒0RF2截短基因的表達質粒PHT43-0RF2成功轉化枯草芽孢桿菌WB800後，提取表達菌株中質粒經BamHl和Smal雙酶切後經瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.WB800/PHT43-0RF2經雙酶切的電泳條帶；2.WB800/PHT43-0RF2未酶切的電泳條帶；3.DL2000DNA Ladder Marker)；
[0017]圖4為本發明優化的豬圓環病毒0RF2截短基因的表達菌株誘導表達重組蛋白的ffestern-blot 分析結果(1.BS168/PHT43-0RF2 誘導表達的重組蛋白；2.WB800/PHT43-0RF2誘導表達的重組蛋白；3.B S168/PHT43-0RF2未誘導；4.WB800/PHT43-0RF2未誘導)。
【具體實施方式】
[0018]本發明的優化的豬圓環病毒0RF2截短基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ IDN0.1。
[0019]為便於後續純化，在本發明的優化的豬圓環病毒0RF2截短基因的3』末端引入6XHis標籤後，再在其兩端分別引入BamHl和Smal的酶切位點送生物公司合成此序列。
[0020]所述基因在枯草芽孢桿菌中表達。
[0021]所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。
[0022]為了驗證本發明的優化的豬圓環病毒0RF2截短基因能夠在枯草芽孢桿菌中得到表達，本發明採用以下試驗進行驗證。
[0023]膠回收試劑盒、質粒回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司；BamHl、Smal、T4DNA Ligase、DL2000核酸分子量標準物、低分子量蛋白標準物均購自TaKaRa公司。
[0024]主要溶液和試劑的配製:
[0025]I)鹼裂解法製備質粒DNA所用溶液:
[0026]溶液1:50mM glucose, 25mM Tris-HCl (pH8.0)，IOmM EDTA (pH8.0)。
[0027]溶液II:0.2M NaOH, 1%SDS (m/v)(現配現用)。
[0028]溶液III:3M KAC60.0mL，冰醋酸 11.5mL, H2O 定容至 100mL。
[0029]2)0.1M CaCl2:1.47g CaCl2 溶於 100ml 純水中，滅菌，4°C保存備用。
[0030]3)枯草芽胞桿菌感受態細胞製備用培養基[0031]IOX 最低鹽溶液=K2HPO4.3Η2091.7g, KH2P0430g, (NH4)2SO4IOg,檸檬酸鈉 5g，MgSO4.7H201g，在蒸餾水中依次溶解，定容至500mL。
[0032]GM I 溶液:1X 最低鹽溶液 95mL, 50%glucoselmL, 5%Casamino Acid0.4mL,10%Yeast extract ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 2.5mL。
[0033]GM II 溶液:I X 最低鹽溶液 195mL, 50%glucose2mL, 5%Casamino Acid0.16mL,10%Yeast extract0.08mL,0.5M MgCl2ImL, 0.1M CaCl2ImL, 2mg/mL L_trp 溶液 lmL。
[0034]1.質粒PHT43-0RF2的小量提取
[0035]I)取1.5mL菌液於離心管中，12000rpm離心2min,棄上清。
[0036]2)菌體沉澱重懸於100 μ L溶液I中，室溫下放置5-10min。
[0037]3)加入新配製的溶液II 200 μ L，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管數次，混勻，冰浴5min，使細胞膜裂解。
[0038]4)加入150 μ L預冷的溶液III,見白色絮狀沉澱,於冰上放置5min。
[0039]5) 12000rpm離心lOmin，上清液移入乾淨離心管中，加入等體積(450 μ L)的酚/氯仿，振蕩混勻，12000rpm離心5min。
[0040]6)小心移出上清(約400 μ L)於一新微量離心管中，加入2倍體積(800 μ L)預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2_5min, 12000rpm離心lOmin。
[0041]7)棄上清,加入1ιΛ70%乙醇洗沉澱一次，12000rpm離心5min。
[0042]8)吸除上清液，室溫乾燥，將沉澱質粒PHT43-0RF2溶於20 μ LTE緩衝液中進行保`存。
[0043]2.大腸桿菌感受態TOPlO細胞的製備及轉化
[0044]I)挑取TOPlO單菌落於LB培養基中，37°C培養過夜。
[0045]2)第二天，按1:100轉接到新的LB培養基中，培養至OD6tltl為0.3-0.5。
[0046]3)取 ImL 菌液，冰浴 lOmin, 12000rpm 離心 lmin。
[0047]4)棄上清，加入ImL0.1M的CaCl2,混勻，冰浴30min。
[0048]5) 12000rpm離心lmin,棄上清,加入100 μ L0.1M的CaCl2,混勻，即為大腸桿菌感受態TOPlO細胞。
[0049]6)適量DNA立即加入100 μ L製備好的大腸桿菌感受態TOPlO細胞中，冰浴30min。
[0050]7) 42°C熱擊45s，冰浴2min，再加入500 μ L不含抗生素的LB培養基，37°C培養Ih。
[0051]8)菌液塗布在含氨苄抗性的平板上，37°C培養過夜，次日檢查和驗證大腸桿菌感受態TOP10細胞轉化子。
[0052]3.枯草芽孢桿菌spizizen法感受態細胞的製備及轉化
[0053]I)芽孢桿菌劃線在LB平板上，37°C培養過夜。
[0054]2)用接種針接一單菌落於5mL GM I溶液中，30°C，IOOrpm振蕩培養過夜。
[0055]3)次日取0.5mL菌液轉接到4.5mL GM I溶液中，37°C，200rpm培養3.5h。
[0056]4)取3mL上一步驟的培養液轉接到27mL GM II溶液中，37°C IOOrpm繼續培養
1.5h, 5000g離心IOmin收集菌體。
[0057]5)用3mL原培養液上清輕輕懸浮菌體，懸浮後的菌體即為感受態細胞。
[0058]6)將感受態細胞分裝成每管0.5mL，每管菌液中加入適量DNA。於37°C，200rpm振蕩培養60min後塗布到氯黴素抗性平板上。[0059]7)待菌液被吸收後，倒置平板，37°C過夜培養過夜，次日檢查和驗證枯草芽孢桿菌的轉化子。
[0060]4.表達載體的構建
[0061]優化的豬圓環病毒0RF2截短基因經BamHl和Smal雙酶切後，經瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠，電壓電泳90v，電泳時間為25min)，然後進行切膠，並用膠回收試劑盒回收目的基因0RF2。
[0062]大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒載體PHT43經BamHl和Smal雙酶切，切膠回收約8000bp左右的質粒骨架。[0063]用T4DNA連接酶將0RF2與質粒骨架連接起來，通過轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，得到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達質粒PHT43-0RF2。質粒PHT43-0RF2經BamHl和Smal雙酶切後，通過瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠，電壓電泳90v，電泳時間為25min)進行驗證，由圖1中可以看出質粒PHT43-0RF2質粒雙酶切後在大約600bp位置有目標條帶,說明大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒載體PHT43已經成功連接上0RF2，送去invitrogen公司測序後,測序結果正確。
[0064]5.表達載體轉化枯草芽抱桿菌BS168或WB800
[0065]驗證正確的質粒PHT43-0RF2，通過Sp i z i zen化學轉化法，轉化枯草芽孢桿菌BS168或WB800，構建枯草芽孢桿菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2。分別提取質粒BS168/PHT43-0RF2或質粒WB800/PHT43-0RF2經BamHl和Smal雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠，電壓電泳90v，電泳時間為25min)進行驗證，由圖2和圖3中可以看出雙酶切後在大約600bp位置有目標條帶，說明質粒BS168/PHT43-0RF2或質粒WB800/PHT43-0RF2已經成功轉化枯草芽孢桿菌BS168或WB800，送去invitrogen公司測序後，測序結果正確。
[0066]6.重組蛋白的表達
[0067]將枯草芽孢桿菌工程菌BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2以1%的接種量轉接表達菌株得重組蛋白BS168/PHT43-0RF2或重組蛋白WB800/PHT43-0RF2，當培養OD6tltl至0.6時，進行Western-blot分析，具體步驟如下，分別在重組蛋白BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2中加ImM ITPG誘導6h，將誘導後和作為對照未進行誘導的陽性菌分別離心重懸於ddH20，以2:1加上樣處理緩衝液(2%SDS，0.1%溴酚藍10%甘油)混勻後，沸水煮沸lOmin，離心去菌體，取上清液進行SDS-PAGE，採用120v電壓，電泳時間為2h，割膠轉印至硝酸纖維素膜後，加入5%脫脂牛奶10mL，於37°C封閉Ih ;加組氨酸標籤一抗IOmL (1:2500稀釋)，於4°C孵育過夜(12h以上)；加山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP)抗體IOmL (1:2500稀釋)37°C作用lh，在ImL 二氨基聯苯胺(DAB)緩衝液中顯色。從圖4可以看出陽性菌均沒有條帶，而BS168/PHT43-0RF2或WB800/PHT43-0RF2分別在在23.2kD左右有明顯蛋白條帶，與預期重組蛋白大小一致，從而說明本發明的豬圓環病毒0RF2截斷基因能夠成功表達Cap蛋白。
【權利要求】
1.優化的豬圓環病毒0RF2截短基因，其特徵在於:所述基因的核苷酸序列為SEQIDN0.1。
2.根據權利要求1所述的優化的豬圓環病毒0RF2截短基因，其特徵在於:所述基因在枯草芽孢桿菌中表達。
3.根據權利要求2所述的優化的豬圓環病毒0RF2截短基因，其特徵在於:所述枯草芽孢桿菌為BS168或WB800。
【文檔編號】C12N15/75GK103834670SQ201410061725
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月24日 優先權日:2014年2月24日
【發明者】呂暾, 陳靈豔, 陳晟生, 林拱陽, 喬春曉, 俞建萍, 包松英 申請人:福州大北農生物技術有限公司, 福州大學