一種輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒的製作方法

2023-10-04 08:29:39 4

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒。
背景技術：
：線粒體糖尿病是一種特殊類型糖尿病，臨床上有特徵性表現，如發病年齡早，母系遺傳，不伴有肥胖，常伴有耳聾和神經肌肉損害，胰島素分泌明顯不足，容易出現糖尿病併發症，由於線粒體功能缺陷，易發生乳酸酸中毒。在治療上，口服藥物療效差，早期需要胰島素治療，需慎用雙胍類降糖藥物(易發生乳酸酸中毒)，小心使用他汀類藥物和耳毒性藥物(神經肌肉受損)。然而，此種類型糖尿病的診斷最終需要基因診斷，即線粒體突變檢測，線粒體突變檢測有助於早期進行診斷，制定個體化的治療方案，並判斷預後，也有助於了避免藥物治療發生潛在的不良反應。比如，他汀類藥物是糖尿病患者常用的降脂藥物，橫紋肌損傷是其不良反應之一，如果發現帶有線粒體突變的患者，就應該少劑量開始，密切觀察。目前尚缺乏線粒體突變檢測的產品，指導糖尿病診斷分型。在線粒體突變檢測前，很多線粒體糖尿病患者被誤診為1型糖尿病或2型糖尿病。目前研究發現A1555GSNP位點與耳聾相關，G3337ASNP位點與心肌病相關、T14674CSNP位點與肌病相關。技術實現要素：本發明所要解決的問題是輔助診斷線粒體糖尿病。為解決上述問題，本發明首先提供了一種輔助診斷線粒體糖尿病的產品甲。所述輔助診斷線粒體糖尿病的產品甲可包括用於檢測待測者線粒體基因組基於G3337ASNP位點的基因型的物質；所述G3337ASNP位點可為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列1所示區段中自5』末端第151位核苷酸。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於G3337ASNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述G3337ASNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述G3337ASNP位點的分型檢測引物。所述分型檢測引物具體可為通過單鹼基延伸反應檢測所述G3337ASNP位點的引物。上述產品甲中，所述用於檢測待測者線粒體基因組基於G3337ASNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述G3337ASNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述G3337ASNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述G3337ASNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列12所示的引物3337F和序列表的序列13所示的引物3337R組成；所述用於檢測所述G3337ASNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列34所示的引物3337UEP。所述產品甲還可包括記載有如下判斷標準的載體1：如果待測者線粒體基因組基於G3337ASNP位點的基因型為GA雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於G3337ASNP位點的基因型為GG純合型、待測患者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。本發明還提供一種輔助診斷線粒體糖尿病的產品乙。所述產品乙可包括用於檢測待測者線粒體基因組基於T14674CSNP位點的基因型的物質；所述T14674CSNP位點可為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列2所示區段中自5』末端第151位核苷酸。用於檢測待測者線粒體基因組基於T14674CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T14674CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T14674CSNP位點的分型檢測引物。所述分型檢測引物具體可為通過單鹼基延伸反應檢測所述T14674CSNP位點的引物。上述產品乙中，所述用於檢測待測者線粒體基因組基於T14674CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T14674CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T14674CSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述T14674CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列14所示的引物14674F和序列表的序列15所示的引物14674R組成；所述用於檢測所述T14674CSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列35所示的引物14674UEP。所述產品乙還可包括記載有如下判斷標準的載體1：如果待測者線粒體基因組基於T14674CSNP位點的基因型為TC雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T14674CSNP位點的基因型為TT純合型、待測患者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。本發明還提供了一種輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒，所述試劑盒包括上述任一所述產品甲和/或上述任一所述產品乙。所述試劑盒還可包括用於檢測待測者線粒體基因組基於A1555GSNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於A3243GSNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於T3264CSNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於T3271CSNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於T4291CSNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於A8296GSNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於C12258ASNP位點的基因型的物質、用於檢測待測者線粒體基因組基於T14709CSNP位點的基因型的物質和/或用於檢測待測者線粒體基因組基於T14577CSNP位點的基因型的物質；所述A1555GSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列3所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述A3243GSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列4所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述T3264CSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列5所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述T3271CSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列6所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述T4291CSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列7所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述A8296GSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列8所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述C12258ASNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列9所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述T14709CSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列10所示區段中自5』末端第151位核苷酸；所述T14577CSNP位點為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列11所示區段中自5』末端第151位核苷酸。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於A1555GSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述A1555GSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述A1555GSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述A1555GSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列16所示的引物1555F和序列表的序列17所示的引物1555R組成；所述用於檢測所述A1555GSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列36所示的引物 1555UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於A3243GSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述A3243GSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述A3243GSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述A3243GSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列18所示的引物3243F和序列表的序列19所示的引物3243R組成；所述用於檢測所述A3243GSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列37所示的引物3243UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於T3264CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T3264CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T3264CSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述T3264CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列20所示的引物3264F和序列表的序列21所示的引物3264R組成；所述用於檢測所述T3264CSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列38所示的引物3264UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於T3271CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T3271CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T3271CSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述T3271CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列22所示的引物3271F和序列表的序列23所示的引物3271R組成；所述用於檢測所述T3271CSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列39所示的引物3271UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於T4291CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T4291CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T4291CSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述T4291CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列24所示的引物4291F和序列表的序列25所示的引物4291R組成；所述用於檢測所述T4291CSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列40所示的引物4291UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於A8296GSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述A8296GSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述A8296GSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述A8296GSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列26所示的引物8296F和序列表的序列27所示的引物8296R組成；所述用於檢測所述A8296GSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列41所示的引物8296UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於C12258ASNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述C12258ASNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述C12258ASNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述C12258ASNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列28所示的引物12258F和序列表的序列29所示的引物12258R組成；所述用於檢測所述C12258ASNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列42所示的引物12258UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於T14709CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T14709CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T14709CSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述T14709CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對可由序列表的序列30所示的引物14709F和序列表的序列31所示的引物14709R組成；所述用於檢測所述T14709CSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列43所示的引物14709UEP。所述用於檢測待測者線粒體基因組基於T14577CSNP位點的基因型的物質可包括用於擴增含有所述T14577CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物對和/或用於檢測所述T14577CSNP位點的分型檢測引物；所述用於擴增含有所述T14577CSNP位點的靶序列的PCR擴增引物 對可由序列表的序列32所示的引物14577F和序列表的序列33所示的引物14577R組成；所述用於檢測所述T14577CSNP位點的分型檢測引物可為序列表的序列44所示的引物14577UEP。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體3：如果待測者線粒體基因組基於A1555GSNP位點的基因型為GG純合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於A1555GSNP位點的基因型為AA純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體4：如果待測者線粒體基因組基於A3243GSNP位點的基因型為AG雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於A3243GSNP位點的基因型為AA純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體5：如果待測者線粒體基因組基於T3264CSNP位點的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T3264CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體6：如果待測者線粒體基因組基於T3271CSNP位點的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T3271CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體7：如果待測者線粒體基因組基於T4291CSNP位點的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T4291CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體8：如果待測者線粒體基因組基於A8296GSNP位點的基因型為GG純合型或AG雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於A8296GSNP位點的基因型為AA純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體9：如果待測者線粒體基因組基於C12258ASNP位點的基因型為AA純合型或CA雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於C12258ASNP位點的基因型為CC純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體10：如果待測者線粒體基因組基於T14709CSNP位點的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T14709CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標準的載體11：如果待測者線粒體基因組基於T14577CSNP位點的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T14577CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。上述任一所述產品甲、上述任一所述產品乙或上述任一所述試劑盒在製備用於輔助診斷 線粒體糖尿病的試劑盒中的應用也屬於本發明的保護範圍。實驗結果表明，利用本發明所提供的輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒可以輔助診斷線粒體糖尿病，具有較高的準確率，對於線粒體糖尿病的診斷和治療具有重大價值。附圖說明圖1為與線粒體糖尿病相關的SNP位點的測序結果。其中左上為A3243GSNP位點，右上為A1555GSNP位點，左下為G3337ASNP位點，右下為T14674CSNP位點。圖2為人工合成的含SNP位點的基因片段的測序結果。其中，A為T3264CSNP位點，B為T3271CSNP位點，C為T4291CSNP位點，D為A8296GSNP位點，E為C12258ASNP位點，F為T14709CSNP位點，G為T14577CSNP位點。圖3為11個SNP位點的質譜檢測峰圖。其中，A為T3264CSNP位點，B為G3337ASNP位點，C為T14577CSNP位點，D為T14709CSNP位點，E為A1555GSNP位點，F為A3243GSNP位點，G為T14674CSNP位點，H為A8296GSNP位點，I為C12258ASNP位點，J為T3271CSNP位點，K為T4291CSNP位點。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的各個試驗均是在各受試者知情同意的前提下進行的。北京大學人民醫院糖尿病樣本庫中的90例40歲前已被診斷為2型糖尿病的患者(男61例，女29例，年齡35.4±6.4歲)均籤署知情同意書，並經北京大學人民醫院倫理委員會批准後，進行試驗。ABI3730XL測序儀為AppliedBiosystems公司產品，貨號為3730xl。實施例1、與線粒體糖尿病相關的SNP位點一、新SNP位點與線粒體糖尿病的關聯分析抽取患者的空腹靜脈血3mL，用血液基因組提取試劑盒(北京博邁德基因技術有限公司產品)提取靜脈血的基因組DNA，然後用二代測序技術對其中的50例患者進行全線粒體基因組測序，用ABI3730XL測序儀對其餘40例患者進行全線粒體基因組測序分析，對發現導致線粒體糖尿病的SNP位點，用ABI3730XL測序儀進行驗證(見圖1)。將90例患者的全線粒體基因組測序結果與資料庫中正常健康人的全線粒體基因組測序結果進行比對，發現4個與線粒體糖尿病相關的SNP位點(見表1)，分別為G3337ASNP位點、T14674CSNP位點、A1555GSNP位點和A3243GSNP位點：G3337ASNP位點為序列表的序列1自5』末端第151位核苷酸，T14674CSNP位點為序列表的序列2自5』末端第151位核苷酸，A1555GSNP位點為序列表的序列3自5』末端第151位核苷酸，A3243GSNP位點為序列表的序列4自5』末端第151位核苷酸。可見，在人類線粒體基因組中，基於G3337ASNP位點基因型為GA雜合型或GG純合型(未發現AA純合型的情況)，基於T14674CSNP位點基因型為TC雜合型或TT純合型(未發現CC純合型的情況)，基於A3243GSNP位點基因型為AG雜合型或AA純合型(未發現GG純合型的情況)，基於A1555GSNP位點基因型為AA純合型或GG純合型(未發現GA雜合型的情況)。表1.90例患者中與線粒體糖尿病相關的SNP位點的基因型二、現有SNP位點的篩選通過文獻檢索篩選出國際上比較公認的7個導致線粒體糖尿病相關的位點，包括T3264CSNP位點、T3271CSNP位點、T4291CSNP位點、A8296GSNP位點、C12258ASNP位點、T14709CSNP位點和T14577CSNP位點。現有人線粒體基因組的研究結果如下：基於T3264CSNP位點的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T3264CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基於T3271CSNP位點的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T3271CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基於T4291CSNP位點的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T4291CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基於A8296GSNP位點的基因型為GG純合型或AG雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於A8296GSNP位點的基因型為AA純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基於C12258ASNP位點的基因型為AA純合型或CA雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於C12258ASNP位點的基因型為CC純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基於T14709CSNP位點的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T14709CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基於T14577CSNP位點的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測者線粒體基因組基於T14577CSNP位點的基因型為TT純合型、待測者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。實施例2、檢測實施例1中與線粒體糖尿病相關的SNP位點一、模板的製備(1)將步驟一中編號為1的患者的基因組DNA作為模板1，模板1中含有如序列表中序列1所示的人線粒體基因片段。模板1中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(2)將步驟一中編號為2的患者的DNA作為模板2，模板2中含有如序列表中序列2所示的人線粒體基因片段。模板2中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(3)將步驟一中編號為3的患者的DNA作為模板3，模板3中含有如序列表中序列1所示的人線粒體基因片段。模板3中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(4)將步驟一中編號為4的患者的DNA作為模板4，模板4中含有如序列表中序列4所示的人線粒體基因片段。模板4中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(5)製備模板5，具體製備步驟如下(由諾賽基因組研究中心有限公司協助完成)：①對序列表中序列5所示的人線粒體基因片段的全序列進行分析，檢查內部是否含有複雜二級結構和重複序列，分析序列GC含量，根據序列分析的結果，進行單鏈寡核苷酸的設計及合成。②利用梯度PCR技術將步驟①合成的單鏈寡核苷酸拼接成如序列表中序列5所示的基因片段，並用ABI3730XL測序儀進行驗證。結果見圖2中A。③將步驟②製備的基因片段與pMD18-T載體(Takara公司產品)連接，得到重組質粒。④將步驟③製備的重組質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到攜帶重組質粒的大腸桿菌。⑤提取步驟④獲得的大腸桿菌的質粒，得到重組質粒DNA。步驟⑤提取的重組質粒DNA即為模板5，模板5中含有如序列表中序列5所示的人線粒體基因片段。模板5攜帶T3264CSNP位點，該SNP位點為序列表的序列5自5』末端第151位核苷酸所示。模板5中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。(6)按照上述製備模板5的步驟，將序列表中序列5分別替換為序列表中序列6、序列表中序列7、序列表中序列8、序列表中序列9、序列表中序列10和序列表中序列11， 其它步驟均不變，分別得到模板6、模板7、模板8、模板9、模板10和模板11。其中人工合成相應的基因片段用ABI3730XL測序儀進行驗證，結果依次見圖2中B-圖2中G。模板6中含有如序列表中序列6所示的人線粒體基因片段。模板6攜帶T3271CSNP位點，該SNP位點為序列表的序列6自5』末端第151位核苷酸所示。模板6中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。模板7中含有如序列表中序列7所示的人線粒體基因片段。模板7攜帶T4291CSNP位點，該SNP位點為序列表的序列7自5』末端第151位核苷酸所示。模板7中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。模板8中含有如序列表中序列8所示的人線粒體基因片段。模板8攜帶A8296GSNP位點，該SNP位點為序列表的序列8自5』末端第151位核苷酸所示。模板8中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。模板9中含有如序列表中序列9所示的人線粒體基因片段。模板9攜帶C12258ASNP位點，該SNP位點為序列表的序列9自5』末端第151位核苷酸所示。模板9中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。模板10中含有如序列表中序列10所示的人線粒體基因片段。模板10攜帶T14709CSNP位點，該SNP位點為序列表的序列10自5』末端第151位核苷酸所示。模板10中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。模板11中含有如序列表中序列11所示的人線粒體基因片段。模板11攜帶T14577CSNP，該SNP位點為序列表的序列11自5』末端第151位核苷酸所示。模板11中重組質粒DNA的濃度為10ng/μL。(7)抽取正常健康人的空腹靜脈血3mL，用血液基因組提取試劑盒(北京博邁德基因技術有限公司產品)提取靜脈血的基因組DNA。將正常健康人的基因組DNA作為模板12。二、引物的製備基於大量的序列分析、篩選、驗證和效果比較，設計併合成用於鑑定各個SNP位點的PCR引物和分型檢測引物。各SNP位點的PCR引物見表2，各SNP位點的分型檢測引物見表3。由上海生物工程技術服務有限公司合成各SNP位點的PCR引物和分型檢測引物。將表2中編號為1-8的PCR引物等摩爾質量的進行混合，得到混合引物1；將表2中編號為9-16的PCR引物等摩爾質量的進行混合，得到混合引物2；將表2中編號為17-22的PCR引物等摩爾質量的進行混合，得到混合引物3。將表3中編號為23-26的分型檢測引物混合，得到混合引物4，混合引物4中編號為23-26的分型檢測的濃度分別為8.06μM、8.15μM、9.06μM和9.40μM；將表3中編號為27-30的分型檢測引物混合，得到混合引物5，混合引物5中編號為27-30的分型檢測的濃度分別為8.25μM、9.38μM、10.09μM和11.10μM；將表3中編號為31-33的分型檢測引物混合，得到混合引物6，混合引物6中編號為31-33的分型檢測的濃度分別為8.73μM、11.09μM和12.06μM。表2.各SNP位點的PCR引物表3.各SNP位點的分型檢測引物編號SNP位點引物名稱引物序列(5』-3』)序列表中的位置23T14577C14577UEPGACCACACCGCTAACAA序列表中的序列4424T14709C14709UEPAACCACGACCAATGATA序列表中的序列4325G3337A3337UEPTTGCGATTAGAATGGGTA序列表中的序列3426T3264C3264UEPCCCGGTAATCGCATAAAAC序列表中的序列3827A3243G3243UEPTTATGCGATTACCGGGC序列表中的序列3728A1555G1555UEPCTTACCATGTTACGACTTG序列表中的序列3629A8296G8296UEPATGCTAAGTTAGCTTTACAG序列表中的序列4130T14674C14674UEPACAGAAACAAAGCATACATCAT序列表中的序列3531T3271C3271UEPTTGAACCTCTGACTGTAA序列表中的序列3932T4291C4291UEPATGTCTGATAAAAGAGTTACTT序列表中的序列4033C12258A12258UEPTGTTATCCTTTAAAAGTTGAGAAA序列表中的序列42三、質譜法進行基因分型檢測下述實驗均設置3個復孔。1、PCR擴增按照表4中的試劑組分配製PCR擴增反應液，在384孔板中進行多重PCR擴增。反應程序為：94℃2min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，45個循環；72℃3min。組分中模板為模板1、模板2、模板3、模板4、模板5、模板6、模板7、模板8、模板9、模板10、模板11或模板12，0.5μMPrimerMix為混合引物1、混合引物2或混合引物3，10×PCRBufferwith15mMMgCl2、MgCl2和dNTPMix均為Agenabioscience公司產品，產品目錄號分別為10711521、10359033和10767222。HotStarTaq為寶生物工程(大連)有限公司產品。將上述PCR擴增反應液中的PrimerMix替換為等量超純水，其它組分均不變，在384孔板中進行多重PCR擴增。作為空白對照。表4.PCR擴增反應液的組分組分在PCR擴增反應液中的終濃度反應組分體積(μL)超純水n/a1.810×PCRBufferwith15mMMgCl21××PCRBuffer(1.5mMMgCl2)0.5MgCl2(25mM)2mM0.4dNTPMix(25mM)500μM0.1PrimerMix(0.5μM)0.1μM(單條引物)1HotStarTaq(5U/μl)1Unit0.2模板n/a1Totalvolume(μL)n/a5註：n/a表示不存在。2、SAP反應完成步驟1後，向384孔板中的每個孔加入2μLSAP混合液(按照表5中的組分配置)進行SAP反應，去除體系中游離的dNTP。反應程序為：37℃、40min，85℃、5min，4℃維持。10×SAPBuffer和SAPEnzyme均為Agenabioscience公司產品，產品目錄號分別為為0000020182和0000008336。表5.SAP混合液的組分組分在SAP混合液中的終濃度反應組分體積(μl)超純水n/a1.5310×SAPBuffer0.24×0.17SAPEnzyme(1.7U/μl)0.4U0.3Totalvolume(μL)n/a2註：n/a表示不存在。3、單鹼基延伸反應完成步驟2後，向384孔板中的每個孔加入2μL單鹼基延伸反應液(按照表6中的組分配置)進行延伸反應，得到延伸產物。反應程序為：94℃30s；94℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s，40個循環；72℃3min。10×iPLEXBufferPlus、iPLEXTerminationmix和iPLEXEnzyme為Agenabioscience公司產品，產品目錄號分別為0000008212、0000008329和0000008333。iPLEXExtendPrimerMix為步驟二製備的混合引物4、混合引物5或混合引物6。表6.單鹼基延伸反應液的組分組分反應組分體積(μl)超純水0.61910×iPLEXBufferPlus0.2iPLEXTerminationmix0.2iPLEXExtendPrimerMix0.94iPLEXEnzyme0.041TotalVolume(μL)24、質譜檢測(1)晶片點樣：將步驟3獲得的延伸產物去鹽(每孔加入6mg樹脂，上下翻轉30min，讓延伸產物與樹脂充分混合，離心3000prm,5min待用)，啟動MassARRAYNanodispenserRS1000點樣儀，然後將去鹽後的產物384樣品點樣至384孔SpectroCHIP(Sequenom)晶片上(2)質譜檢測：將步驟(1)點樣後的SpectroCHIP晶片使用基質輔助雷射解吸附電離飛行時間質譜分析，檢測結果使用TYPER4.0軟體(sequenom)分型並輸出結果。實驗結果見圖3。結果表明，本發明所提供的PCR引物和分型檢測引物均可特異的檢測相應的SNP位點。實施例3、利用實施例1的SNP位點輔助診斷線粒體糖尿病本實施例中的4個待測患者為已經根據臨床特徵(如發病年齡早，母系遺傳，不伴有肥胖，常伴有耳聾和神經肌肉損害，胰島素分泌明顯不足，容易出現糖尿病併發症)判斷為患有線粒體糖尿病的患者。分別抽取4個待測患者的空腹靜脈血3mL，用血液基因組提取試劑盒(北京博邁德基因技術有限公司產品)提取靜脈血的基因組DNA，然後按照實施例2中步驟二和步驟三的方法進行檢測實驗。結果見表7，可見本發明所提供的SNP位點和檢測方法可以輔助診斷線粒體糖尿病，具有較高的準確率。表7.待測患者線粒體基因組中含有的SNP位點的基因型當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp