一種異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑、其製備方法和應用與流程

2023-09-24 01:51:50 2

本發明屬於獸用複合中藥製劑
技術領域：
，具體涉及一種異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑、其製備方法和應用。
背景技術：
：斷奶是養豬生長過程中最重要的環節之一，仔豬在斷奶期間會由於多方面的因素而引起應激，從而導致在斷奶後的第1～2周出現生長抑制，甚至腹瀉。斷奶應激主要表現為仔豬腹瀉，糞便呈灰白或灰色。斷奶仔豬腹瀉死亡率高，即使治癒也會影響仔豬的生長發育，甚至成為僵豬，給養殖戶帶來經濟損失。抗生素一直是緩解仔豬斷奶應激最好的飼料添加劑，不但能有效防治仔豬應激腹瀉，且能夠提高仔豬的日增重。因抗生素使動物及人體產生耐藥性及汙染環境等缺點而被禁用，人們一直尋求能夠替代抗生素的飼料添加劑。益生菌不僅能通過改善腸道微生態平衡促進機體健康，而且能夠減少養殖環境及糞便中氨氣等有害物質的含量，減少畜牧業對環境造成的汙染，保護生態環境，具有明顯的經濟效益和社會效益。技術實現要素：針對現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種天然安全、快速有效的複合中藥製劑以及製備該製劑的方法，同時，提供一種含有該複合中藥製劑且具有提高仔豬生長性能、免疫力和抗氧化力的飼料。為了到達上述目的，本發明採用以下技術方案予以實現：一種仔豬用中藥組合物，是由以下組分按重量份數製備而成：黃芪15～25份、黨參10～20份、白朮5～15份、茯苓5～15份、當歸5～15份、馬齒莧3～10份、甘草3～10份。在上述方案的基礎上，所述仔豬用中藥組合物，是由以下組分按重量份數製備而成：黃芪20份、黨參15份、白朮10份、茯苓10份、當歸10份、馬齒莧5份、甘草5份。一種異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑，是由中藥成分與菌液混合後經異步發酵製成，所述菌液為植物乳桿菌菌液與枯草芽孢桿菌菌液。在上述方案的基礎上，所述異步發酵為先接入枯草芽孢桿菌菌液進行有氧發酵，再接入植物乳桿菌進行厭氧發酵。在上述方案的基礎上，所述植物乳桿菌菌液中菌含量≥108cfu/ml，枯草芽孢桿菌菌液中菌含量≥109cfu/ml。在上述方案的基礎上，所述中藥成分是由以下組分按重量份數製備而成：黃芪15～25份、黨參10～20份、白朮5～15份、茯苓5～15份、當歸5～15份、馬齒莧3～10份、甘草3～10份。在上述方案的基礎上，所述中藥成分是由以下組分按重量份數製備而成：黃芪20份、黨參15份、白朮10份、茯苓10份、當歸10份、馬齒莧5份、甘草5份。在上述方案的基礎上，所述異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑的製備方法，步驟如下：(1)按量取中藥組分，粉碎，過20目篩網，備用；(2)將粉碎後的各組分混合均勻，加入佔中藥重量30％的小麥麩皮和佔物料總重量80％～100％的水，攪拌均勻；(3)車間使用過氧化氫消毒器進行幹霧滅菌，設置發酵室溫度30℃～32℃，溼度80％～85％；木製曲盤用0.2％高錳酸鉀浸泡1～2h後擦乾備用；(4)將(2)中製備好的物料放入高壓鍋滅菌，物料厚度≤30cm，滅菌1.5h～2h，同時將曲盤蓋布後進行高壓滅菌，壓力1.0～1.2kgf/cm2；(5)滅菌後物料通過傳輸帶降溫至35℃～37℃；(6)向冷卻後的物料中加入枯草芽孢桿菌菌液，菌種接種量為10％，攪拌均勻，調初始ph值為6.5；(7)裝盤發酵：盤內發酵物料厚度為2cm～3cm，蓋上蓋布，發酵時間72h；其中在發酵4h後物料溫度升高，設置發酵室溫度28℃～30℃；發酵50h後設置發酵室溫度33℃～35℃；發酵期間在曲盤蓋布上噴灑無菌水保持溼潤；(8)向發酵後物料中加入重量為1.5％的無菌葡萄糖後，再加入植物乳桿菌菌液，接種量為10％，於密閉發酵罐中厭氧發酵48h，即得複合中藥製劑。在上述方案的基礎上，所述的異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑的用途，是用於提高仔豬的生長性能、免疫力和抗氧化力。一種提高仔豬的生長性能、免疫力和抗氧化力的飼料，在仔豬飼料中添加上述方法製備的仔豬用複合中藥製劑，添加量為每噸飼料中添加2kg。本發明複合中藥製劑中，各中藥的藥性藥效如下：黃芪：為豆科多年生草本植物主要為膜莢黃芪，亦有內蒙黃芪的乾燥根，野生或栽培，含生物鹼、葉酸、結晶性中性物質、膽鹼、胺基酸等主要成分，具有補氣昇陽、固表止汗、利水消腫、託毒排膿等功效。黨參：主要成分為生物鹼、皂甙、蛋白質、澱粉、維生素b1、維生素b2等，具有補中益氣、補血、降壓、祛痰鎮咳等功效。白朮：為菊科多年生草本植物白朮的乾燥根莖。多為栽培，亦有野生。主要成分為揮髮油，其中主要為蒼朮醇，另含白朮酮、維生素a類等物質。具有補脾益氣、燥溼利水等功效。茯苓：為寄菌多孔菌科茯苓的乾燥菌核。野生者多寄生於赤松或生真馬尾松的根部，大量商品均為人工栽培。主要含茯苓糖、茯苓酸、蛋白質、脂肪、卵磷脂、組胺酸、膽鹼、麥角甾醇和鉀鹽等成分，主要功效為利水滲溼，益脾寧心。當歸：別名秦歸、西歸，為傘形科多年生草本植物當歸的乾燥根。栽培品。主要含揮髮油和一種能興奮子宮的成分，又含蔗糖、維生素b12等物質；具有補血、行血、潤腸、調經等功效。馬齒莧：別名長壽菜、馬屈菜，為馬齒莧科一年生草本植物馬齒莧的乾燥地上全草，野生。莖葉含煙酸、皂甙、鞣質、尿素等，並含硝酸鉀、氯化鉀、硫酸鉀及其它鉀鹽。其提取物經檢定，含左旋去甲腺素等。具有清熱解毒，抗菌利尿等作用。甘草：別名甜甘草，為豆科多年生草本植物甘草和光果甘草等的乾燥根和根狀莖(蘆頭)，多為野生。含甘草甜素、甘草黃素、葡萄糖、甘露醇、蘋果酸、天門冬醯胺等主要成分，具有補脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳等功效。所述植物乳桿菌菌種為植物乳桿菌植物亞種(lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)，編號as1.557，來源於中國科學院微生物研究所。所述枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)為產澱粉酶、蛋白酶和果膠酶的菌種，編號為as1.942，來源於中國科學院微生物研究所。本發明的技術原理：本方中黃芪補中益氣、健脾固表、調和應急為君；臣以甘溫黨參、苦溫白朮、甘淡茯苓加強益氣助運之力，健脾滲溼，苓術相配，則健脾祛溼之功益著。又佐以當歸，可以補脾土而瀉肝木，調氣機以止痛瀉；馬齒莧清熱解毒、涼血止瀉，使以甘草益氣和中，調和諸藥。本發明的有益效果：本發明複合中藥製劑具有以下特點：(1)該中藥組方益氣健脾，和中止瀉，可有效提高仔豬生長性能、免疫力和抗氧化力。(2)本發明選用的枯草芽孢桿菌在代謝過程中可分泌蛋白酶、果膠酶、澱粉酶等胞外酶進入培養基，分解蛋白質、果膠、澱粉等物質成分，破壞細胞壁，加強細胞內容物溶出。(3)本發明選用的植物乳桿菌通過酸化作用，進一步強化細胞壁的破壞與溶出。(4)在本發明選用的枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的作用下，促使本發明藥物活性成分最大限度的釋放，增強了原有藥物的功能；且發酵後細菌的代謝產生了新的活性物質，進一步補充了本發明藥物的功能。本發明方法選取的中藥組分結構合理、比例適當，選用的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌具有活性高、抗逆性強、可調節腸道菌群等優勢，在本發明所選取的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌的作用下，顯著地提高了原有藥物的藥效，提高了腸道內有益菌比例，使用本發明的發酵藥物可以提高仔豬的生長性能、免疫力和抗氧化力。具體實施方式以下結合較佳實施例，對依據本發明提供的具體實施方式詳述如下：實施例1菌液的製備：將植物乳桿菌菌種接種於活化培養基進行培養，培養溫度為37℃，時間24h；將活化好的菌種接種於發酵罐中，控制溫度37℃～43℃，時間24h～36h，製備發酵液。所述活化培養基為：mrs培養基，成分為(g/l)：蛋白腖10.0、肉膏10.0、酵母浸粉5.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、檸檬酸氫二銨2.0、乙酸鈉5.0、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.28、半胱氨酸0.5、吐溫801.0，調ph6.2-6.4。發酵所用培養基為：mrs培養基，成分同上。發酵完成後，菌液中植物乳桿菌的含量≥1億/ml。所述植物乳桿菌菌種為植物乳桿菌植物亞種(lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)，編號as1.557，來源於中國科學院微生物研究所。將枯草芽孢桿菌菌種接種於活化培養基進行活化培養，培養溫度為30℃，時間24h；將活化好的菌種接種於發酵罐中，控制溫度30℃～35℃，轉速80～150rpm，攪拌培養，通無菌風，通氣比為0.8～1.2，時間24h～36h。所述活化培養基和所述發酵所用培養基為：pby培養基，成分為(g/l)：蛋白腖10.0、牛肉膏5.0、酵母膏5.0、葡萄糖5.0、氯化鈉5.0，調ph7.0-7.2。發酵所用培養基為：pby培養基，成分同上。發酵完成後，菌液中枯草芽孢桿菌的含量≥10億/ml。所述枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)為產澱粉酶、蛋白酶和果膠酶的菌種，編號為as1.942，來源於中國科學院微生物研究所。實施例2一種異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑，其各中藥組分的重量份數為：黃芪20份、黨參15份、白朮10份、茯苓10份、當歸10份、馬齒莧5份、甘草5份。具體製備方法如下：(1)按量取中藥組分，粉碎，過20目篩網，備用；(2)將粉碎後的各組分混合均勻，加入佔中藥重量30％的小麥麩皮和佔物料總重量80％～100％的水，攪拌均勻；(3)車間使用過氧化氫消毒器進行幹霧滅菌，設置發酵室溫度30℃～32℃，溼度80％～85％；木製曲盤用0.2％高錳酸鉀浸泡1～2h後擦乾備用；(4)將(2)中製備好的物料放入高壓鍋滅菌，物料厚度≤30cm，滅菌1.5h～2h，同時將曲盤蓋布後進行高壓滅菌，壓力1.0～1.2kgf/cm2；(5)滅菌後物料通過傳輸帶降溫至35℃～37℃；(6)向冷卻後的物料中加入枯草芽孢桿菌菌液，菌種接種量為10％，攪拌均勻，調初始ph值為6.5；(7)裝盤發酵：盤內發酵物料厚度為2cm～3cm，蓋上蓋布，發酵時間72h；其中在發酵4h後物料溫度升高，設置發酵室溫度28℃～30℃；發酵50h後設置發酵室溫度33℃～35℃；發酵期間在曲盤蓋布上噴灑無菌水保持溼潤；(8)發酵結束後測得ph值為7.5左右，枯草芽孢桿菌菌數≥10億/g；(9)向發酵後物料中加入重量為1.5％的無菌葡萄糖後，再加入植物乳桿菌菌液，接種量為10％，於密閉發酵罐中厭氧發酵48h；(10)發酵結束後測得ph值為4.5左右，枯草芽孢桿菌菌數≥1億/g，植物乳桿菌菌數≥10-1億/g，即得複合中藥製劑。實施例3一種異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑，其各中藥組分的重量份數為：黃芪15份、黨參10份、白朮5份、茯苓5份、當歸5份、馬齒莧3份、甘草3份。其他製備方法與實施例2相同。實施例4一種異步發酵法製備的仔豬用複合中藥製劑，其各中藥組分的重量份數為：黃芪25份、黨參20份、白朮15份、茯苓15份、當歸15份、馬齒莧10份、甘草10份。其他製備方法與實施例2相同。一、發酵前後中藥成分變化對比試驗1.1試驗組方1.1.1傳統工藝製備的非發酵中藥製劑組(將本發明實施例2所選取的藥物進行超微粉碎，粉碎至700目，混合均勻)。1.1.2有氧發酵製劑組(將本發明實施例2所選取的藥物經枯草芽孢桿菌有氧發酵，而不進行植物乳桿菌的厭氧發酵)。1.1.3實施例2組1.1.4實施例3組1.1.5實施例4組1.2試驗方法1、取中藥超微粉、有氧發酵製劑、實施例2、實施例3和實施例4共5組試驗樣品各300g，設3個平行，每個平行100g樣品，各加入蒸餾水600ml，浸泡1h後再小火煎煮1.5h。邊加熱邊加水，保持水量不變。1h後用2層紗布濾過，濾渣加水繼續煎煮1h，再用2層紗布濾過，合併濾液。沉澱後取上清液進行5000rpm離心處理，取上清液待測；2、再取5組試驗樣品各300g，設3個平行，每個平行100g樣品，加入含3％(g/ml)氫氧化鈉和60％(ml/ml)乙醇的鹼性醇液600ml浸泡0.5h，加熱回流提取2次(1.5h、1h)，合併2次提取液，5000rpm離心後取上清液待測；3、超微粉組、有氧發酵組中藥組分同實施例2組；4、將各試驗組水提上清液取1ml於250ml容量瓶中加蒸餾水定容至刻度混勻，檢測；5、將各試驗組醇提上清液取1ml於250ml容量瓶中加95％乙醇定容至刻度混勻，檢測。1.3試驗結果分別以超微粉組相應提取液為空白對照，於500nm處測吸光度，取平均值。結果見表1：表1發酵前後中藥成分變化對比試驗由表1可知，通過枯草芽孢桿菌有氧發酵和植物乳桿菌厭氧發酵後，中藥溶出成分大大增加，且異步發酵後比單一有氧發酵溶出物增加。二、藥效試驗2.1試驗組方2.1.1傳統工藝製備的非發酵中藥製劑組(將本發明實施例2所選取的藥物進行超微粉碎，粉碎至700目，混合均勻。)2.1.2實施例2組2.1.3實施例3組2.1.4實施例4組2.1.5空白對照組2.2動物實驗設計選取28日齡、體重相近、健康無病的杜長大三元雜交仔豬120頭，隨機分為5個試驗組，飼料中分別添加超微粉、實施例2、實施例3或實施例4的複合中藥製劑，添加量為2kg/噸；另設一空白對照組；每個試驗組24頭，分別採食1種試驗飼糧，試驗期28天。免疫和管理按豬場常規進行。2.3試驗飼糧基礎日糧採用玉米、豆粕型，參照nrc(1998)豬飼養標準配製而成，具體日糧組成和營養水平見表2。表2基礎日糧組成及營養水平註：預混料向每kg日糧提供cu180mg，fe220mg，mn55mg，zn210mg，i0.3mg，se0.3mg，co0.3mg，va15000iu，vd33700iu，ve50iu，vk4.5mg，vb14mg，vb212mg，vb67.5mg，vb1235μg，生物素150μg，泛酸35mg，葉酸2.5mg，煙醯胺50mg，氯化膽鹼550mg。2.4測定指標及方法2.4.1斷奶仔豬日增重情況測定試驗仔豬分別於0、14和28天空腹12h後進行稱重、記錄，以計算不同時期及全期仔豬的增重情況。對0～28d仔豬腹瀉情況評定：觀察並記錄試驗期每頭仔豬每天的腹瀉情況，其計算公式為：腹瀉率＝試驗期腹瀉仔豬頭次/(試驗豬頭次×試驗天數)×100％2.4.2斷奶仔豬盲腸微生物菌群的測定試驗結束後，每組隨機選取仔豬5頭，打開腹腔，結紮盲腸兩端，切下盲腸。在無菌操作臺中，準確稱取盲腸內容物1g放於盛有99ml滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩，取稀釋液進行10倍的倍比稀釋，吸取0.1ml稀釋液接種於選擇性培養基上。其中，大腸桿菌用伊紅美藍瓊脂培養基37℃培養48h後進行菌落計數；乳酸菌用mrs培養基37℃培養48h後進行菌落計數；雙歧桿菌用bl培養基37℃厭氧培養48h後進行菌落計數。2.4.3斷奶仔豬血清抗氧化指數的測定試驗第21天，各試驗組隨機選取健康狀況良好、體重相近的仔豬5頭，空腹前腔靜脈採血30ml，靜置，3000rpm離心10min，離心後血清分裝於離心管中，-30℃保存待測。抗氧化指標的測定：採用黃嘌呤氧化酶法來測定總超氧化物歧化酶(t-sod)活性、採用比色法來測定穀胱甘肽過氧化物酶(gsh)、採用硫代巴比妥酸法(tba)來測定丙二醛(mda)，試驗所用試劑盒均在南京建成生物工程研究所購買。具體步驟按試劑盒說明書操作。2.4.4斷奶仔豬血清免疫指標的測定試驗第28d，各試驗組隨機選取健康狀況良好、體重相近的仔豬5頭，空腹前腔靜脈採血30ml，靜置，3000rpm離心10min，離心後血清分裝於離心管中，-30℃保存待測。血清免疫指標iga、igg、il-4採用間接酶聯免疫吸附試驗(elisa)方法測定。2.5數據分析所有採集數據採用excel軟體進行前期處理，然後用spss19.0進行統計分析，lsd進行多重比較，結果採用平均值±標準差表示。三、結果與分析3.1複合中藥製劑對斷奶仔豬日增重和腹瀉率的影響，見表3。表3複合中藥製劑對斷奶仔豬日增重和腹瀉率的影響註：同列肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(p0.05)；實施例2、3和4組分別比對照組顯著提高7.68％、7.63％和7.67％(p0.05)。15～28d日增重，超微粉組較對照組提高6.44％(p>0.05)；實施例2、3和4組較對照組分別顯著提高45.97％、45.17％和45.64％(p<0.05)，較超微粉組分別顯著提高37.14％、36.38％和36.82％(p0.05)；實施例2、3和4組較對照組分別顯著提高29.37％、27.77％和28.89％(p<0.05)，較超微粉組分別顯著提高21.88％、20.36％和21.42％(p0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。由表4可知，大腸桿菌數量實施例2、3和4組均顯著低於對照組(p0.05)。乳酸菌和雙歧桿菌數量實施例2、3和4組均顯著高於對照組(p<0.05)，其中乳酸菌數量顯著高於超微粉組(p0.05)。3.3複合中藥製劑對斷奶仔豬抗氧化性能的影響，見表5。表5複合中藥製劑對斷奶仔豬抗氧化性能的影響註：同列肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(p0.05)；實施例2、3和4組較對照組分別顯著提高了40.52％、39.89％和40.28％(p<0.05)，較超微粉組分別顯著提高了22.56％、22.01％和22.34％(p0.05)。斷奶仔豬血清中mda含量超微粉組較對照組降低51.64％，無顯著性差異(p>0.05)；實施例2、3和4組較對照組分別顯著降低62.96％、62.76％和62.80％(p0.05)。3.4複合中藥製劑對斷奶仔豬免疫器官指數的影響，見表6。表6複合中藥製劑對斷奶仔豬血清免疫指標的影響註：同列肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(p0.05)。igg含量超微粉組較對照組提高2.41％，差異不顯著(p>0.05)；實施例2、3和4組較對照組分別顯著提高42.10％、30.86％和36.48％(p<0.05)，較超微粉組分別顯著提高38.76％、27.78％和33.27％(p0.05)；實施例2、3和4組較對照組分別顯著提高38.28％、31.58％和35.74％(p<0.05)，較超微粉組分別顯著提高32.98％、26.54％和30.54％(p0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(p0.05)。4.2.4肝臟功能變化觀察試驗結束後，撲殺鼠，採取血液分離血清，測定ast(穀草轉氨酶)、alt(谷丙轉氨酶)見表9。表9ast和alt測定分組總數altast超微粉2039.11±2.12a105.41±4.04a實施例2組2039.26±1.97a105.71±4.33a實施例3組2039.20±2.24a105.66±4.00a實施例4組2039.25±2.21a105.68±3.91a對照組2039.09±2.37a105.38±4.71a註：同列肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。由表9可知，各組數據與空白對照組相比差異不顯著，都處於正常範圍內。4.3長期毒性試驗資料根據實施例2製備的本發明發酵製劑，20g/kg、100g/kg給1月齡icr鼠連續灌胃給藥1個月，動物的皮毛、膚色、攝食、活動、尿、便等均無異常；動物的血常規、肝、腎功能等血液生化指標和動物的主要臟器指數均在正常範圍，且正常動力無差異；病理組織學檢查表明，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、氣管、睪丸、卵巢等重要臟器無病理改變。停藥兩周後檢查以上各項指標均無明顯毒性反應，表明無蓄積毒性。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。當前第1頁12