蛋白c或活化的蛋白c-樣分子的製作方法
2023-10-20 19:30:52 2
專利名稱：蛋白c或活化的蛋白c-樣分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白C的多肽變體與非多肽組分的新偶聯物，製備所述偶聯物的工具(means)和方法，包含所述偶聯物的藥物組合物，以及所述偶聯物在治療中的用途，尤其是治療各種凝血疾病。本發明還涉及所述偶聯物的多肽部分。
背景技術：
凝血是由多種血液組分，或因子，之間複雜的相互作用組成的逐漸導致纖維蛋白凝塊形成的過程。通常參與凝血「級聯反應」的血液組分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，活化劑的作用可使其轉變為活性形式。對血液凝固的調節主要是由活化的蛋白C(APC)通過蛋白裂解作用滅活凝血因子Va和VIIIa而實現的(Esmon，J Biol Chem 1989；264；4743-4746)。
蛋白C是一種絲氨酸蛋白酶，它以血漿中的酶原的形式循環，半壽期約為7小時，血漿水平通常為3-5mg/l。它以461個胺基酸的單鏈前體多肽的形式在體內肝臟中產生。此多肽經歷多重翻譯後修飾，包括a)切割42個胺基酸的信號肽；b)切割賴氨酸和精氨酸殘基(156和157位)，產生雙鏈無活性的酶原(一種具有155個胺基酸的輕鏈，經由二硫鍵與一種具有262個胺基酸的重鏈相連)；c)對輕鏈的9個穀氨酸殘基進行維生素K-依賴性羧基化，從而在輕鏈的N-末端得到9個γ-羧基穀氨酸殘基；和d)在四個位點與碳水化合物相連(一個位點在輕鏈中，三個在重鏈中)。最後，通過去除重鏈N-末端的十二肽(活化肽，第158-169位)，使上述雙鏈酶原活化，產生活化型蛋白C(APC)。
蛋白C通過位於內皮細胞內腔表面的與凝血酶調節素(thrombomodulin)形成複合體的凝血酶的有限蛋白裂解而活化。如上所述，活化作用導致從重鏈的N-末端釋放12個胺基酸的小肽(稱為活化肽)。APC在血漿中的半壽期約為15分鐘。
在有其輔因子蛋白S的情況下，APC通過蛋白裂解作用使凝血因子Va和VIIIa失活，從而減少凝血酶的生成(Esmon，Thromb Haemost 1993；70；29-35)。蛋白S以與另一種血漿蛋白，C4b-結合蛋白相結合的形式逆向循環。僅游離的蛋白S可作為APC的輔因子。由於C4b-結合蛋白是一種急性期反應物質，該蛋白的血漿水平在很多疾病中有很大差異並因此影響蛋白C系統的抗凝活性。
編碼人類蛋白C的基因定位於染色體2q13-q14(Patracchini等，HumGenet 1989；81；191-192)，它跨11kb，包括一個編碼區(外顯子II-IX)和一個包繞(encompassing)外顯子I的5′非翻譯區。由外顯子II-IX編碼的蛋白結構域顯示出與其它維生素K-依賴性凝血蛋白如凝血因子IX和X的較高同源性。外顯子II編碼信號肽，外顯子III編碼原肽和包含9個Glu殘基的38個胺基酸的序列。原肽包含能與鈣離子結合的羧化酶結合位點，此酶將Glu殘基轉化為二元羧酸(Gla)，而這是磷脂的結合以及蛋白C的抗凝活性所必需的一個步驟(Cheung等，Arch Biochem Biophys 1989；274；574-581)。外顯子IV，V和VI分別編碼一段短連接序列和兩種EGF-樣結構域。外顯子VII編碼含12個胺基酸的活化肽的結構域以及二肽156-157，所述活化肽在蛋白C被凝血酶活化後可被釋放，所述二肽被切割下來後，產生成熟的雙鏈形式的蛋白。外顯子VIII和IX編碼絲氨酸蛋白酶結構域。
人類蛋白C的完整胺基酸序列已由Foster等，PNAS.USA 1986；82；4673-4677報導，它包括信號肽，原肽，輕鏈，重鏈，以及活化肽。
蛋白C與內皮細胞蛋白受體(EPCR)結合。APC與EPCR的結合使APC不能滅活凝血因子Va和VIIIa，而蛋白C與EPCR的結合則明顯增強凝血酶-凝血酶調節素複合體對蛋白C的活化速率。這些相互作用的生理重要性目前尚不清楚。但顯然，蛋白C與EPCR的結合以磷脂非依賴性方式嚴格依賴於Gla結構域的存在(Esmon等，Haematologica 1999；84；363-368)。
APC在血漿中受蛋白C抑制劑以及α-1-抗胰蛋白酶和α-2-巨球蛋白的抑制。
據Mather等，EMBO J1996；15；6822-6831的報導，人類APC的實驗性三維結構已確定到2.8的解析度水平。他們報導了不含Gla結構域的APC的X-線結構。此結構包含共價結合的抑制劑(D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，PPACK)。
蛋白C現已從通過單克隆抗體親和層析製備的凝血酶原濃縮物中分離。此外，蛋白C也可以通過哺乳動物細胞的表達而重組產生或者通過修飾蛋白C而獲得。
APC可用於治療遺傳性和獲得性蛋白C缺陷，有人建議將APC作為抗凝劑用於以下患者一些形式的狼瘡，發作(stroke)或心肌梗塞之後，靜脈血栓，彌散性血管內凝血(DIC)，敗血性休克，栓塞(emboli)如肺栓塞，移植如骨髓移植，燒傷，妊娠，重大外科手術/創傷以及成人呼吸窘迫症候群(ARDS)。
重組APC由Eli Lilly和Co製備，治療膿毒症的III期臨床試驗(Bernard等，N Engl J Med(2001)，344，pp.699-709)已於近期完成。嚴重膿毒症患者在96小時內以24μg/kg/h的劑量灌輸給藥。
但是，由於APC的半壽期短，必需用相對較高的劑量和頻繁的給藥來達到並維持所需的治療或預防效應。結果是，很難對劑量進行充分調整，而頻繁地靜脈給藥高水平APC的需要將帶來問題並且花費較高。
具有較長循環半壽期的分子將減少必需的給藥次數並有效提供更好的治療性APC水平，同時治療效應也增強。
APC的循環半壽期可以通過，例如，減少腎清除，減少蛋白裂解性降解或減少抑制而得以增加。這可以通過，例如將APC與非多肽組分偶聯來實現，所述非多肽組分如PEG或碳水化合物，它們能導致對所述蛋白的腎清除減少和/或有效阻斷蛋白裂解性酶或抑制劑與上述蛋白的生理接觸。此外，這也可以通過使蛋白C分子突變來實現，所述突變導致蛋白C分子保留活性但阻斷了抑制劑與該蛋白的結合。
PEG化野生型APC的描述參見JP 8-92294。
WO 91/09960公開了一種雜合蛋白，它在蛋白C的重鏈部分包含修飾。
WO 01/59084描述了蛋白C變體，它包含D167F+D172K取代並且在位置10，11，12，32，194，195，228，149，254，302或316還包含至少一個取代。WO 01/59084中公開的變體據稱具有增強的抗凝活性。
WO 98/44000廣泛描述了具有增強的醯胺裂解活性的蛋白C變體。
EP 0 323 149描述了蛋白C的酶原形式，它在重鏈中具有以下突變D167F/G/Y/W。這些變體據稱對凝血酶活化作用的敏感性增加。
WO 00/66754報導了對位置194，195，228，249，254，302或316的天然殘基進行取代導致人血中APC的半壽期比野生型APC增加。WO00/66754中公開的變體不包括在本發明的範圍內。
WO 99/63070描述了C-末端截短型蛋白C。
EP 0 946 715報導了嵌合的蛋白C多肽，其中蛋白C的Gla結構域被來自其它維生素K依賴性多肽(如凝血因子VII，凝血因子X和凝血酶原)的Gla結構域代替。
WO 99/20767和WO 00/66753公開了維生素K-依賴性多肽變體，它們在Gla結構域中包含修飾。
US 5,453,373公開了人類蛋白C的衍生物，它們的糖基化模式和活化區都已改變，如N313Q和N329Q。US 5,453,373中公開的變體不包括在本
US 5,460,953公開了編碼酶原形式的蛋白C的DNA序列，它們經修飾去掉了一或多個天然糖基化位點。更具體地，US 5,460,953公開了變體N97Q，N248Q，N313Q和N329Q。US 5,460,953中公開的變體不包括在本發明的範圍內。上述現有技術文獻中公開的變體都不包括在本發明的範圍內。
US 5,270,178涉及特異性蛋白C變體，其中I 171已被刪除，Asp已由Asn取代。
US 5,041,376涉及鑑定並掩蔽轉運型蛋白的功能性位點或表位的方法，其中引入了額外的N-連接型糖基化位點。
US 5,766,921涉及對人血漿或αl-抗胰蛋白酶滅活作用的抗性已增強的蛋白C變體，其重鏈中包含來自相應的牛型重鏈的取代。
WO 01/57193報導了包含雙突變的蛋白C變體，其中一個突變發生在位置10，11，32或33，另一突變發生在位置194，195，228，249，254，392或316。
WO 01/36462涉及蛋白C變體，它在位置12包含取代，並任選在位置10和/或11還有取代。
WO 00/26354涉及製備過敏原性減弱的糖基化蛋白變體的方法。
WO 00/26230涉及篩選免疫原性減弱的蛋白變體的方法。
人野生型蛋白C，包括其前體形式，的DNA序列和相應胺基酸序列公開在US 4,775,624和US 4,968,626中。
上述專利/專利申請中公開的任一種變體都不包括在本發明的範圍內。
發明簡述本發明涉及蛋白C的多肽變體與非多肽組分的新偶聯物，製備所述偶聯物的工具和方法，包含所述偶聯物的藥物組合物，以及所述偶聯物在治療中的用途，尤其是治療各種凝血疾病。本發明還涉及所述偶聯物的多肽部分。
相應地，本發明第一方面涉及含有至少一個與蛋白C多肽共價相連的非多肽組分的偶聯物，所述蛋白C多肽包含不同於親本蛋白C多肽的胺基酸序列，其區別在於引入和/或去除了至少一個含有與所述非多肽組分相連的基團的胺基酸殘基。
本發明另一方面涉及親本蛋白C多肽的變體，所述變體在選自下組的位置包含取代D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382，G383，L386，L387和H388，前提是，所述取代並非選自T254S，T254A，T254H，T254K，T254R，T254N，T254D，T254E，T254G，T254Q，Y302S，Y302A，Y302T，Y302H，Y302K，Y302R，Y302N，Y302D，Y302E，Y302G，Y302Q，F316S，F316A，F316T，F316H，F316K，F316R，F316N，F316D，F316E，F316G和F316Q。
本發明另一方面涉及本發明偶聯物的多肽部分。
本發明還有一方面涉及編碼本發明偶聯物中多肽部分的核苷酸序列，編碼本發明多肽變體的核苷酸序列，包含本發明核苷酸序列的表達載體，以及包含本發明核苷酸序列或本發明表達載體的宿主細胞。
本發明還有一方面涉及含有本發明偶聯物或變體的藥物組合物，以及製備和應用本發明的偶聯物和變體的方法。
發明詳述定義在本申請和本發明的全文中，使用下列定義術語「偶聯物」(或可互換為「偶聯的多肽」)表示由一個或多個多肽與一個或多個非多肽組分(如聚合物分子、親脂化合物、糖組分或有機衍生劑)共價連接而形成的雜合(指複合或嵌合)分子。優選地，偶聯物在相關濃度和條件下可溶，即在生理液體如血液中可溶。本發明偶聯多肽的實例包括糖基化多肽和/或PEG化多肽。
術語「共價連接」表示多肽與非多肽組分彼此直接共價連接，或者通過一個或多個間插組分，如橋、間隔臂或連接組分，間接地共價連接。
術語「非偶聯多肽」是偶聯物的多肽部分。
本文所用術語「非多肽組分」表示不同於由胺基酸單體通過肽鍵連接而成的肽聚合物的、能與本發明多肽的連接基團偶聯的分子。此類分子的優選實例包括聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機衍生劑。在本文中用於本發明的偶聯物時，應理解為非多肽組分通過多肽連接基團連接到偶聯物的多肽部分。如上說明，非多肽組分可能直接共價地連接到連接基團，或通過一個或多個間插組分，如橋、間隔臂或接頭組分，間接地共價連接到連接基團。
術語「聚合物分子」是由兩個或多個單體共價連接形成的分子，其中所述單體無一是胺基酸殘基，但所述聚合物不是人白蛋白或另一種豐富血漿蛋白。術語「聚合物」可與術語「聚合物分子」互換。
術語「糖組分」是指含有一或多個單糖殘基的含糖分子，它能通過體內或體外糖基化而與多肽連接(以產生糖基化多肽形式的多肽偶聯物)。術語「體內糖基化」是指通過，例如N-連接和O-連接糖基化作用，而在體內出現(即在表達所述多肽的糖基化細胞中翻譯後加工期間出現)的任何糖組分連接基團。實際上的寡糖結構很大程度上取決於相關的糖基化生物。術語「體外糖基化」是指體外產生的合成性糖基化作用，通常涉及將糖組分與多肽的連接基團相連，可選用交聯劑。體內和體外糖基化將在下文詳述。
「N-糖基化位點」具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何胺基酸，N是天冬醯胺，S/T/C是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優選絲氨酸或蘇氨酸，最優選蘇氨酸。「O-糖基化位點」是絲氨酸或蘇氨酸殘基的-OH基。
術語「連接基團」表示多肽中能與非多肽組分如聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機衍生劑偶聯的功能基團，特別是其胺基酸殘基或糖組分。有用的連接基團及其相配的非多肽組分見下表。
對於體內N-糖基化來說，術語「連接基團」以非常規方式用於表示構成N-糖基化位點的胺基酸殘基。儘管N-糖基化位點的天冬醯胺殘基是在糖基化期間與糖組分連接的殘基，但除非該N-糖基化位點存在其它胺基酸殘基，否則不能實現所述連接。
因此，當非多肽組分是糖組分，並且偶聯是通過N-糖基化實現時，術語「含有與非多肽組分連接的基團的胺基酸殘基」與目的多肽的胺基酸序列改變聯用，應理解為構成N-糖基化位點的一個或多個胺基酸殘基被改變，從而使功能性N-糖基化位點被引入胺基酸序列或從所述序列中除去。
胺基酸的命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按蛋白資料庫(PDB)(www.pdb.org)的定義來用，這些名稱是根據IUPAC命名法命名的(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids andPeptides(residue names，atom names etc.)，Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)，並在Eur.J.Biochem.152，1(1985)中對它們進行更正。
術語「胺基酸殘基」表示包含在下組中的胺基酸殘基丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、穀氨酸(Glu或E)、笨丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬醯胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、穀氨醯胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
用於鑑定胺基酸位置/取代的術語舉例說明如下給定胺基酸序列中的K174表示SEQ ID NO.2或4所示胺基酸序列中第174位被賴氨酸殘基佔據。K174S表示第174位的賴氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。備選取代可用「/」表示，如K174S/T表示第174位的賴氨酸被絲氨酸或蘇氨酸殘基所取代。多重取代用「+」表示，如D172N+K174S表示第172位天冬氨酸殘基被天冬醯胺殘基所取代，並且第174位的賴氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。額外胺基酸的插入如下表示在K174之後插入一個丙氨酸殘基，表示為K174KA。胺基酸殘基的缺失以星號表示。例如，第174位賴氨酸的缺失表示為K174*。除非另有說明，此處胺基酸殘基的序號對應於SEQ ID NO2或4所示的胺基酸序列。
術語「不同於」當與特定突變聯用時，是指除特定的胺基酸差異外允許存在另外的差異。例如，除了去除和/或引入包含非多肽組分連接基團的胺基酸殘基外，蛋白C多肽可能還包含與這些胺基酸殘基的引入和/或去除無關的其它取代、插入或缺失。因此，除了本文公開的旨在去除和/或引入非多肽組分連接基團的胺基酸改變外，應理解本發明多肽偶聯物的胺基酸序列，在需要時可包含不一定必須與連接位點的引入或去除相關的其它改變，即其它的取代、插入或缺失。例如，這些改變可能包括去除N-和/或C-末端的一個或多個胺基酸殘基，或在N-和/或C-末端添加一個或多個額外的胺基酸殘基，如在N-末端添加一個甲硫氨酸殘基，以及「保守胺基酸取代」，即，取代是在具有相似特性的胺基酸(如，小胺基酸，酸性胺基酸，極性胺基酸，鹼性胺基酸，疏水胺基酸和芳香族胺基酸)之間進行。
本發明中的保守取代的實例具體可選自下表所列出的組。
本文中術語「前體蛋白C」是指由DNA編碼的蛋白C形式，即，它包括信號肽(殘基-42至-1)，輕鏈(殘基1-155)，Lys-Arg二肽(殘基156-157)以及重鏈(158-419)，包括活化肽(殘基158-169)，見SEQ ID NO2。
術語「雙鏈酶原蛋白C」是指分泌的無活性蛋白C形式，它包括輕鏈(殘基1-155)和重鏈(158-419)，其中包括活化肽(158-169)，見SEQ ID NO4。
術語「單鏈酶原蛋白C」是指無活性的蛋白C形式，包括輕鏈(殘基1-155)，重鏈(158-419)，包括活性肽(158-169)，以及Lys-Arg二肽(殘基156-157)，見SEQ ID NO4。
術語「酶原蛋白C」用於指單鏈和雙鏈形式的酶原蛋白C。
術語「活化的蛋白C」，「活化的人類蛋白C」，「APC」或「人APC」用於指活化的酶原，它們包括SEQ ID NO4的輕鏈(殘基1-155)和重鏈(不含活化肽)。後一種胺基酸序列，即，活化的蛋白C的胺基酸序列有時在本文中稱為「SEQ ID NO4所示胺基酸序列中的APC部分」。
術語「蛋白C」包括所有如上所述的蛋白C形式，即「前體蛋白C」形式，「酶原蛋白C」形式(單鏈形式以及雙鏈形式)和「活化的蛋白C形式」。
術語「親本」是指將要根據本發明進行改進的分子。通過本發明進行修飾的親本多肽可以是任何蛋白C多肽，並因此可以源自任何來源，例如非人哺乳動物來源，但優選親本多肽是人的蛋白C(即，人的前體蛋白C，人的酶原蛋白C或人衍生的蛋白C)或其片段或變體。
片段是全長人的蛋白C序列的一部分，例如其C-末端或N-末端截短型。親本蛋白C多肽片段的具體例子包括C末端截短1-15個胺基酸殘基和/或N-末端截短1-3個胺基酸殘基的人的蛋白。
如上所述，親本蛋白C多肽還可包含人的蛋白C的變體。人蛋白C變體的具體例子包括，例如在N-末端添加甲硫氨酸殘基的變體，以及含有一或多個上述保守胺基酸取代的變體。變體的其它例子包括，在蛋白C的Gla結構域中有一或多個胺基酸被取代或者其中的整個蛋白C Gla結構域已經被另一種Gla結構域(如蛋白S的Gla結構域)取代的蛋白C變體。
術語(親本多肽)的變體是指一種多肽，它與它的親本多肽有一或多個胺基酸殘基不同，通常有1-15個胺基酸殘基(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個胺基酸殘基)，例如，1-10胺基酸殘基或1-5個胺基酸殘基不同。
術語「突變」和「取代」在此可互換使用。
術語「核苷酸序列」表示兩個或多個核苷酸分子的連續片段。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來源或其任意組合。
術語「聚合酶鏈反應」或「PCR」通常指體外擴增所需核苷酸序列的方法，如美國專利4683195所述。PCR方法一般涉及使用能與模板核酸優先雜交的寡核苷酸引物進行引物延伸合成反應，並使此反應重複多輪。
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」在本文中可互換使用，所有這些術語都應當理解為包括細胞生長或培養所產生的後代。
「轉化」和「轉染」可互換使用，指將DNA引入細胞的過程。
「可操作連接」指兩個或多個核苷酸序列通過酶促連接等方式共價連接在彼此相關的構象中，使序列行使正常功能。例如，編碼前序列或分泌前導序列的核苷酸序列如果表達為參與多肽分泌的前蛋白，則被可操作連接到該多肽的核苷酸序列上；啟動子或增強子如果要影響編碼序列的轉錄，則與該序列可操作連接；核糖體結合位點如果要處在促進翻譯的位置，則與編碼序列可操作連接。通常，「可操作連接」意指被連接的核苷酸序列是鄰接的，在分泌前導序列的情況下，是鄰接的而且在閱讀狀態下。連接發生在方便的限制性位點。如果不存在此類位點，那麼使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭，並使用標準的重組DNA方法。
術語「引入」主要指取代現有的胺基酸殘基，也指插入另外的胺基酸殘基。
術語「除去」主要指用另外的胺基酸殘基取代將要被除去的胺基酸殘基，也指刪除(不經取代)將要被除去的胺基酸殘基。
術語「功能性體內半壽期」使用其通常的含義，即多肽或偶聯物在體內/靶器官中仍具有50％生物活性的時間，或者多肽或偶聯物的活性為最初活性的50％的時間。作為功能性體內半壽期測定法的備選方法，可測定「血清半壽期」，即，50％的多肽或偶聯物分子在被清除之前在血漿或血流中循環的時間。血清半壽期的測定常常比功能性體內半壽期的測定簡單，並且血清半壽期的大小通常可以很好地說明功能性體內半壽期大小。血清半壽期的其它可替換術語包括「血漿半壽期」、「循環半壽期」、「血清清除」、「血漿清除」和「清除半壽期」。多肽或偶聯物通過網狀內皮系統(RES)、腎、脾或肝中一個或多個的作用，通過組織因子、SEC受體或其它受體介導的清除作用，或通過特異或非特異的蛋白水解作用而清除。清除一般取決於大小(相對於腎小球過濾的截留值而言)、電荷、連接的碳水化合物鏈，以及是否存在該蛋白的細胞受體。將要保留的功能通常選自抗凝活性、醯胺裂解活性或受體結合活性。功能性體內半壽期和血清半壽期可通過本領域已知的任何合適方法來測定。
涉及功能性體內半壽期或血漿半壽期的術語「增加」用於表示偶聯物或多肽的相應半壽期經可比條件下的測定，相對於參照分子(如APC)有統計學顯著的增加。通常，當對多肽的清除、蛋白裂解性降解和/或抑制減少時，功能性體內半壽期或血清半壽期增加。因此優選的偶聯物是下述偶聯物，當它們為活性形式時，與人的APC相比，功能性體內半壽期或血清半壽期增加。特別優選的偶聯物是下述偶聯物，它們的血清半壽期(或功能性體內半壽期)與人APC的血清半壽期(或功能性體內半壽期)的比利為至少1.25，更優選至少1.50，如至少1.75，例如至少2，還更優選至少3，如至少4，例如至少5，最優選至少6，如至少7，例如至少8，至少9或至少10。
本發明多肽或偶聯物的相關清除機制包括一或多種網狀內皮細胞系統(RES)，腎，脾或肝，受體介導的降解，或者特異性或非特異性蛋白裂解。術語「腎清除」使用其通常的含義，即發生在腎的清除，例如，通過腎小球過濾、腎小管排洩或在腎小管細胞中的降解來完成。腎清除取決於偶聯物的物理特性，包括分子量、大小(相對於腎小球過濾的截留值而言)、對稱性、形狀/剛性和電荷。腎清除的截留值一般認為是分子量約67kDa。腎清除一般可通過任何合適的試驗來測定，如已建立的體內試驗。例如，可將標記(如，放射標記或螢光標記)的多肽偶聯物給予患者，並測定所收集的患者尿液中的標記物活性來測定腎清除。腎清除的減少可經過與參照分子，如APC進行比較而確定。
術語「活性」，「APC活性」或「活化的蛋白C的活性」是指本發明偶聯物的活性形式保留了APC的基本特性。
本文實施例9描述了一種合適的體外APC活性試驗(稱為「APC醯胺裂解試驗」)。因此，更具體地，本發明的偶聯物在活性形式時，用本文實施例9所述的「APC醯胺裂解試驗」測得活性為人APC的至少10％，則可歸類為具有「APC活性」。優選地，所述偶聯物的活性為人APC活性的至少20％，如至少30％，更優選所述偶聯物的活性為人APC活性的至少40％，如至少50％，還更優選所述偶聯物的活性為人APC活性的至少60％，如至少70％，最優選所述偶聯物的活性為人APC活性的至少80％，如至少90％。在一個特別優選的實施方案中，當用本文實施例9所述的「APC醯胺裂解試驗」檢測時，所述偶聯物具有與人APC基本相同或更高的活性。應理解，本發明的偶聯物和野生型人APC應該在同等條件下進行試驗，即當如本文實施例9所述進行試驗時，這兩種蛋白的濃度應相同。
或者，「APC活性」可以在本文實施例10所述的「ACP凝血試驗」中進行體外分析。更具體地，本發明的偶聯物在活性形式時，如果用本文實施例10所述的「APC凝血試驗」測得抗凝活性為人APC的至少5％，則可歸類為具有「APC活性」。優選地，所述偶聯物的抗凝活性為人APC的至少10％，如至少20％，例如至少30％，更優選所述偶聯物的抗凝活性為人APC的至少40％，如至少50％，還更優選所述偶聯物的抗凝活性為人APC的至少60％，如至少70％，最優選所述偶聯物的抗凝活性為人APC的至少80％，如至少90％。在一個特別優選的實施方案中，當用本文實施例10所述的「APC凝血試驗」檢測時，所述偶聯物具有與人APC基本相同或更高的抗凝活性。典型的PC活性區間的實例如，人APC的抗凝活性的5-75％，如10-50％，如10-40％。應理解，本發明的偶聯物和野生型人APC應該在同等條件下進行試驗，即當如本文實施例10所述進行試驗時，這兩種蛋白的濃度應相同。
術語「對α-1-抗胰蛋白酶滅活作用的抗性增加」和「對人血漿的滅活作用的抗性增加」分別主要是指本發明偶聯物受α-1-抗胰蛋白酶或人血漿的抑制的程度低於人APC。為了確保本領域技術人員在其早期開發中能選出有效的和優選的偶聯物，本發明人開發了合適的初步試驗，本領域技術人員可以輕易地實施所述試驗，從而初步評估其偶聯物的性能。因此，「α-1-抗胰蛋白酶滅活試驗」(本文實施例11)，「人血漿滅活試驗I」(本文實施例12)和「人血漿滅活試驗II」(本文實施例13)可用於初步評估所選偶聯物的潛力。通過使用上述任一種或所有試驗，可以評估所選偶聯物抵抗α-1-抗胰蛋白酶和/或人血漿的滅活作用的適應性，基本原理是，如果一種偶聯物受到α-1-抗胰蛋白酶和/或人血漿的強烈抑制，通常不必再進行其它試驗。
因此，本文特別優選的偶聯物是，當為其活性形式，並且當用16.6μM的抑制劑濃度經本文實施例11所述的「α-1-抗胰蛋白酶滅活試驗」檢測時，具有至少20％的殘餘活性。優選所述偶聯物具有至少30％的殘餘活性，如至少40％，更優選至少50％，如至少60％，還更優選至少70％，如至少75％，最優選至少80％，如至少85％。
或者，或除了上述試驗以外，還可用「人血漿滅活試驗I」來檢驗所選偶聯物的適應性。因此，本文特別優選的偶聯物是，當為其活性形式，並且用本文實施例12所述的「人血漿滅活試驗I」檢測時，具有至少20％的殘餘活性。優選所述偶聯物具有至少30％的殘餘活性，如至少40％，更優選至少50％，如至少60％，還更優選至少70％，如至少75％。
或者，或除了上述試驗以外，還可用「人血漿滅活試驗II」來檢驗所選偶聯物的適應性。因此，本文特別優選的偶聯物是，用本文實施例13所述的「人血漿滅活試驗II」檢測時，其活性形式的體外半壽期與人APC的體外半壽期的比例至少為1.25，優選至少1.5，如至少2，更優選至少3，如至少4，還更優選至少5，如至少6，最優選至少7，如至少8，尤其是至少9，如至少10。
術語「減弱的免疫原性」是指本發明的偶聯物比在相當條件下測定的對照分子，例如野生型人APC或野生型人蛋白C，產生可測定的更低的免疫應答。所述免疫應答可以是細胞免疫應答或抗體介導的應答(對免疫原性的進一步定義參見，例如RoittEssential Immunology(第8版，Blackwell))。通常，抗體反應性降低可指示免疫原性減弱。免疫原性減弱可利用本領域已知的任何適當方法，例如體外或體內方法進行測定。
術語「至少25％的側鏈暴露在表面」和「至少50％的側鏈暴露在表面」參考實施例1中詳細描述的計算方法等來限定。
本發明的偶聯物本發明偶聯物是開發蛋白C改進分子的總體新策略的結果。更具體的，通過去除和/或引入含有所述非多肽組分的連接基團的胺基酸殘基，有可能特異地改變多肽，使該分子更易於與選定的非多肽組分偶聯，使偶聯模式最佳化(如，確保非多肽組分以最適量最佳分布在蛋白C分子表面並確保分子中只存在將偶聯的連接基團)，從而獲得新的偶聯分子，其與現有的蛋白C分子相比，具有或不具有APC活性，此外具有一種或多種改進的特性。例如，當含有所選非多肽組分的連接基團的胺基酸殘基總數增加到或降低到一個最佳水平時，該偶聯物的腎清除率通常因偶聯導致的分子形狀、大小和/或電荷的改變而顯著降低。此外，我們發現，有可能設計非多肽組分與所述偶聯物的多肽部分中連接基團的連接，致使人血漿或特定抑制劑(如α-1-抗胰蛋白酶)的滅活作用顯著減弱(見下文)。
包含非多肽組分連接基團的胺基酸殘基，無論是被去除或引入，其選擇基於所選非多肽組分的性質，並且，多數情況下，基於多肽和非多肽組分之間偶聯所用的方法。例如，當非多肽組分是聚合物分子，如聚乙二醇或聚環氧烷衍生的分子時，包含連接基團的胺基酸殘基可選自賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，穀氨酸，組氨酸，或酪氨酸，優選半胱氨酸和賴氨酸，特別優選賴氨酸。當非多肽組分是糖組分時，連接基團可以是，例如體內糖基化位點，優選N-糖基化位點。
一旦非多肽組分的連接基團被引入本發明的蛋白C多肽中或從所述多肽中被去除時，進行修飾的多肽部位通常如下選擇所述位置優選位於蛋白C多肽的表面，更優選是由有25％以上(更優選50％以上)側鏈暴露於表面的那些胺基酸殘基佔據的位置。所述位置根據對人野生型APC分子的三維結構的分析來確定，所用方法如本文方法部分所述。此外，在含有與野生型人蛋白C同源的胺基酸序列的非人APC多肽(包括其變體)中，同源位置可通過對相應序列或三維結構進行適當對比排列而輕易確定。
為了確定連接基團的最佳分布，基於所述多肽的三維結構計算該多肽表面的胺基酸殘基間的距離。更具體的，對包含這種連接基團的胺基酸殘基的CB間的距離，或一種胺基酸的功能基團(賴氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，穀氨酸的CD，半胱氨酸的SG)與包含連接基團的另一種胺基酸殘基的CB間的距離進行了確定。對於甘氨酸，使用CA而非CB。在本發明偶聯物的多肽部分中，任何所述距離優選大於8，特別優選大於10，以避免或降低異源偶聯。
如本文後續章節所述，根據本發明將改變的胺基酸殘基的總數(與親本蛋白C分子相比)通常不超過15個。被引入的胺基酸殘基的確切數目和類型取決於，例如，所需的偶聯特性和程度(例如，非多肽組分的同一性，需要或可能有多少非多肽組分與所述多肽偶聯，需要實施還是避免所述多肽偶聯，等等)。優選，本發明偶聯物的多肽部分或本發明的多肽包含下述胺基酸序列，其與SEQ ID NO4所示胺基酸序列有1-15個胺基酸殘基不同，如1-8個或2-8個胺基酸殘基不同，例如1-5個或2-5個胺基酸殘基不同。因此，本發明偶聯物的多肽部分或本發明的多肽包含與SEQ ID NO4所示胺基酸序列有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個胺基酸不同的胺基酸序列。
優選，本發明偶聯物與野生型人APC相比，具有一項或多項以下改進的特性功能性體內半壽期增加，血清半壽期增加，對抑制劑的抗性增加，腎清除減少，免疫原性減弱和/或生物可利用性增加。本發明的偶聯物相對於現有APC產物有多種優點，包括注射時間更長(longer duration betweeninjections)，給藥的蛋白更少，以及副作用更小。此外，抗凝活性減弱可能有利於在維持APC偶聯物的抗炎效應的同時降低出血的風險。這在偶聯物具有延長的血漿半壽期的情況中尤其重要。與允許更有效和安全的治療的抗凝活性相比，上述新特性應該能增強抗炎效應。
通常，本發明偶聯物的分子量至少約67kDa，優選至少約70kDa，但較小的分子量可以使腎清除減少。已發現聚合物分子(如PEG)或所引入的糖基化位點對調整偶聯物的分子量特別有效。
本發明的偶聯物包含足夠數量或類型的非多肽組分，以改進蛋白C多肽的上述一或多種所需特性。通常，本發明的偶聯物包含1-10個第一非多肽組分，尤其是1-8或1-5個第一非-多肽組分。
本發明的偶聯物還可包含至少一個與第一非-多肽組分不同的第二非多肽組分。例如，本發明偶聯物可包含1-10個第二非-多肽組分，尤其1-8或1-5個第二非-多肽組分。例如，當第一非-多肽組分為糖組分(尤其是體內連接的糖組分)時，第二非-多肽組分可以是PEG型聚合物。所述體內連接的糖組分可以與所述多肽的天然體內糖基化位點相連，或與引入的位點相連。
在一個非常優選的實施方案中，本發明的非-多肽組分被引入蛋白C的活性位點區，基本原理是，在蛋白C分子的這一特定區域中引入一個或多個非多肽組分將削弱抑制劑(如α-1-抗胰蛋白酶)與APC的結合，但同時仍保留實質上的APC活性。這導致所述偶聯物具有比野生型人APC顯著延長的半壽期，因為肝受體對抑制劑/APC複合體的消除作用得以避免或至少是減少了。對位於蛋白C的活性位點區的胺基酸殘基進行選擇可如本文實施例2詳述。
本文所用術語「活性位點區」參照本文實施例2的限定，在實施例2中，顯示了組成活性位點區的實際胺基酸殘基。
本發明特別優選的實施方案中，非多肽組分的連接基團被引入活性位點區中由下述胺基酸殘基佔據的位置，所述胺基酸殘基有至少25％的側鏈暴露在表面(見本文實施例3)，即，非多肽組分的連接基團被引入選自下組的位置D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245，N248，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313，R314，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382，G383，L386，L387和H388(排除H211和C384)。優選所引入的連接基團是糖組分的連接基團，特別是體內N-糖基化位點(參見題為「以糖組分作為非-多肽組分的本發明偶聯物」的章節)。
以糖組分作為非多肽組分的本發明偶聯物如上文所述，本發明一個優選實施方案涉及引入了至少一個與蛋白C多肽共價連接的糖基化位點(尤其是體內N-糖基化位點)的偶聯物，所述蛋白C多肽包含不同於親本蛋白C多肽的胺基酸序列，尤其是不同於SEQ IDNO4的胺基酸序列或其變體，不同之處在於至少一個引入的糖基化位點。
優選所述糖基化位點被引入由下述胺基酸殘基佔據的位置，所述殘基有至少25％(如至少50％)的側鏈暴露在表面。這類胺基酸殘基按照本文實施例1所述來確定。應理解，當術語「至少25％(或至少50％)的側鏈暴露在表面」與體內N-糖基化位點的引入聯用時，它表示實際上與糖組分連接的位置中胺基酸側鏈的表面可接近特性。在很多情況下，必須在相對於實際上與糖組分相連的天冬醯胺殘基而言為+2的位置上引入絲氨酸或蘇氨酸殘基(當然，除非此位置已被絲氨酸或蘇氨酸殘基佔據)，這些引入了絲氨酸或蘇氨酸殘基的位置可以被掩蓋，即它有不到25％的側鏈暴露在表面。
為了削弱抑制劑，如α-1-抗胰蛋白酶與APC的結合，優選將所述糖基化位點引入活性位點區(如本文實施例2所限定)內由有至少25％的側鏈暴露在表面的那些胺基酸殘基佔據的位置(如本文實施例3所限定)，即優選將體內N-糖基化位點引入D172N+K174S，D172N+K174T，D189N+K191S，D189N+K191T，S190N+K192S，S190N+K192T，K191N+K193S，K191N+K193T，K192N+L194S，K192N+L194T，K193N+A195S，K193N+A195T，D214N，D214N+S216T，E215N+K217S，E215N+K217T，S216N+K218S，S216N+K218T，K217N+L219S，K217N+L219T，K218N+L220S，K218N+L220T，L220N+R222S，L220N+R222T，V243N+V245S，V243N+V245T，V245N+P247S，V245N+P247T，S250N，S250N+S252T，K251N，K251N+T253S，S252N，S252N+T254S，T253N+D255S，T253N+D255T，T254N+N256S，T254N+N256T，D255N+D257S，D255N+D257T，L296N，L296N+T298S，Y302N，Y302N+S304T，H303N，H303N+S305T，S304N+R306S，S304N+R306T，S305N+E307S，S305N+E307T，R306N+K308S，R306N+K308T，E307N+E309S，E307N+E309T，K308N+A310S，K308N+A310T，E309N+K311S，E309N+K311T，A310N+R312S，A310N+R312T，R312N+R314S，R312N+R314T，T315N+V317S，T315N+V317T，F316N+L318S，F316N+L318T，V334N，V334N+S336T，S336N+M338S，S336N+M338T，V339S，V339T，M338N，M338N+S340T，I348N+G350S，I348N+G350T，L349N+D351S，L349N+D351T，D351N+Q353S，D351N+Q353T，R352N+D354S，R352N+D354T，E357N+D359S，E357N+D359T，G383N+G385S，G383N+G385T，L386N+H388S，L386N+H388T，L387N+N389S，L387N+N389T，H388N+Y390S或H388N+Y390T。
更優選將體內N-糖基化位點引入S190N+K192S，S190N+K192T，K191N+K193S，K191N+K193T，D189N+K191S，D189N+K191T，D214N，D214N+S216T，K217N+L219S，K217N+L219T，K251N，K251N+T253S，S252N，S252N+T254S，T253N+D255S，T253N+D255T，Y302N，Y302N+S304T，S305N+E307S，S305N+E307T，E307N+E309S，E307N+E309T，S336N+M338S，S336N+M338T，V339S，V339T，M338N，M338N+S340T，G383N+G385S，G383N+G385T，L386N+H388S或L386N+H388T。
還更優選將體內N-糖基化位點引入D189N+K191T，K191N+K193T，D214N，K251N，S252N，T253N+D255T，Y302N，S305N+E307T，S336N+M338T，V339T，M338N，或G3833N+G385T；最優選將體內N-糖基化位點引入D189N+K191T，K191N+K193T，D214N，T253N+D255T，S305N+E307T，S336N+M338T，M338N，G383N+G385T或L386N+H388T。在一個特別優選的實施方案中，所引入的體內N-糖基化位點選自D189N+K191T，D214N或L386+H388T。
如上所述，對α-1-抗胰蛋白酶和/或人血漿的滅活作用的抗性增加，可通過本文所述的「α-1-抗胰蛋白酶滅活試驗」、「人血漿滅活試驗I」或「人血漿滅活試驗II」來測定。
本發明的偶聯物可包含單個體內糖基化位點(除了已經存在於97，248，313和329位的糖基化位點以外)。但為了有效掩蔽親本多肽表面的蛋白酶切割位點和/或有效削弱抑制劑的結合，通常希望所述偶聯物的多肽部分包含一個以上的體內糖基化位點，尤其2-5個(額外的)體內糖基化位點，如2，3，4或5個(額外的)體內糖基化位點，優選通過上文所列的一或多種取代來引入所述糖基化位點。
此外，具有至少一個上述體內N-糖基化位點修飾的多肽的胺基酸序列可能與親本多肽不同在於，已引入至少一個如上文「本發明偶聯物，其中非多肽組分與半胱氨酸殘基相連」章節所定義的半胱氨酸殘基，或已引入至少一個如上文「本發明偶聯物，其中非多肽組分與非半胱氨酸殘基相連」章節所定義的非半胱氨酸殘基。
而且，本發明偶聯物的多肽部分還可包含額外的已知具有好處的突變。例如，除了上述糖基化位點以外，所述偶聯物的多肽部分還可在選自下組的位置上包含取代L194，A195，L228，Y249或它們的組合，尤其L194S，L194S+T245S或L194A+T254S(見WO 00/66754)。優選的額外取代的其它實例包括，在已知易被蛋白裂解作用降解的位置或其附近，取代或引入一或多個糖基化位點。其中一個已知易被蛋白裂解作用降解的位置是野生型人APC的H10(見WO 98/48822)。
應理解，為了製備本發明該方面的偶聯物，所述多肽必須在糖基化宿主細胞中表達或者接受體外糖基化，所述細胞應能將糖組分連接在糖基化位點上。糖基化宿主細胞的實例可參見下文題為「與糖組分的偶聯」的章節。
本發明偶聯物，其中非多肽組分與半胱氨酸殘基相連本發明另一個優選實施方案涉及包含至少一個與蛋白C多肽共價連接的非多肽組分(尤其是聚合物分子)的偶聯物，所述蛋白C多肽包含不同於親本蛋白C多肽的胺基酸序列，尤其是不同於SEQ ID NO4的胺基酸序列或其變體，不同之處在於引入和/或去除(優選引入)至少一個半胱氨酸殘基。因此，在本發明一個優選實施方案中，所述非多肽組分具有半胱氨酸作為連接基團。優選將所述半胱氨酸連接基團引入由下述胺基酸殘基佔據的位置，所述胺基酸殘基有至少25％(如至少50％)的側鏈暴露在表面。這類胺基酸殘基如本文實施例1所限定。所述位置中，最優選那些在親本多肽中由T或S殘基(優選S殘基)佔據的位置。相應地，帶有半胱氨酸-修飾的偶聯物是將半胱氨酸殘基引入至少一個選自下組的位置中的那些S3，S11，S12，T37，S42，S61，T68，S75，S77，S82，S99，S119，S153，S190，S216，S252，T253，T268，S270，S281，S304，S305，T315，S332，S336，S340，S367，或S416，所述位置更優選S3，S11，S12，S42，S61，S75，S77，S82，S99，S119，S153，S190，S216，S252，S270，S281，S304，S305，S332，S336，S340，S367或S416。
以如上所述的相似方式(參見上文題為「以糖組分為非多肽組分的本發明偶聯物」的章節)，優選將半胱氨酸殘基引入活性位點區(如本文實施例2所限定)內由有至少25％的側鏈暴露在表面的那些胺基酸殘基佔據的位置(如本文實施例3所限定)，即，優選將所述半胱氨酸殘基引入選自下組的位置D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336，V339，M338，I348，L349，D351，R352，E357，G383，E385，L386，L387或H388。更優選將所述半胱氨酸殘基引入D189，S190，K191，D214，K217，K251，S252，T253，Y302，S305，E307，S336，V339，M338，G383或L386。
該實施方案中所述偶聯物的多肽部分通常包含1-10個引入的半胱氨酸殘基，尤其1-5或1-3個引入的半胱氨酸殘基，例如1，2或3個引入的半胱氨酸殘基。
本發明這一方面的偶聯物的非-多肽組分可以是，當使用給定的偶聯方法時，具有半胱氨酸殘基作為連接基團的任何分子(如聚合物組分，親脂基團或有機衍生劑)，優選所述非-多肽組分是聚合物分子，如「與聚合物分子的偶聯」章節中所述的任何分子。優選所述聚合物分子選自線性或分支的聚乙二醇或聚環氧烷。最優選，所述聚合物分子是PEG，如VS-PEG。所述多肽與聚合物之間的偶聯可通過任何合適的方法實現，如以「與聚合物分子的偶聯」為標題的章節中描述的，例如使用上述章節中所涉及的一步法或多步法。當多肽僅包含一個可偶聯的半胱氨酸殘基時，優選與具有至少約10kDa到至少約15kDa分子量(如約12kDa，約15kDa，或約20kDa)的第一非多肽組分直接偶聯，或者通過低分子量聚合物間接偶聯(見WO99/55377)。當偶聯物包含兩個或多個第一非多肽組分時，這些非多肽組分各自的分子量通常為約5kDa，約10kDa，或約12kDa。
此實施方案中的偶聯物可包含至少一個第二非多肽組分，如1-10，1-8，1-5或1-3個所述組分。當第一非-多肽組分為聚環氧烷或PEG衍生的聚合物時，第二非-多肽組分優選糖組分，尤其體內連接的組分。糖組分可以出現在親本多肽的一或多個天然糖基化位點，或出現在引入的糖基化位點。適當的引入的糖基化位點，尤其N-糖基化位點，描述在題為「以糖組分為非多肽組分的本發明偶聯物」的章節中。
而且，本發明偶聯物的多肽部分還可包含額外的已知具有好處的突變。例如，除了上述引入的半胱氨酸殘基以外，所述偶聯物的多肽部分還可在選自下組的位置包含取代L194，A195，L228，Y249或它們的組合，尤其L194S，L194S+T245S或L194A+T254S(見WO 00/66754)。優選的額外取代的其它實例包括，在已知易被蛋白裂解作用降解的位置或其附近，取代或引入一或多個半胱氨酸殘基。其中一個已知易被蛋白裂解作用降解的位置是野生型人APC的H10(見WO 98/48822)。
本發明偶聯物，其中非多肽組分與非半胱氨酸組分連接根據本文公開的內容，本技術人員可以理解，使用上文舉例的針對糖基化位點和半胱氨酸殘基的方法，可以將包含其它連接基團的胺基酸殘基通過取代而引入親本多肽。例如，可以將包含酸性基團的一或多個胺基酸殘基(穀氨酸或天冬氨酸)、酪氨酸、絲氨酸或賴氨酸引入上述位置(參見題為「以糖組分為非多肽組分的本發明偶聯物」和「本發明偶聯物，其中非多肽組分與半胱氨酸殘基連接」的章節)。
本發明的多肽變體本發明另一方面一般性涉及親本蛋白C多肽的新變體。所述新變體是製備本發明偶聯物的重要中間化合物。此外，並且從以下公開的內容和本文所提供的實施例可以看出，所述變體本身具有令人感興趣的特性。
因此，本發明最廣泛的方面涉及親本蛋白C多肽的新變體，所述變體組成本發明偶聯物的多肽部分，更尤其是APC部分。如實施例所示，一些變體中引入了一或多個糖基化位點，它們未被利用，但它們具有令人感興趣的特性，尤其是對α-1-抗胰蛋白酶抑制作用的抗性增加以及對人血漿滅活作用的抗性增加。這些變體在活性位點區(如本文實施例2所限定)內包含至少一個取代，尤其是，它們在活性位點區內由有至少25％的側鏈暴露在表面的那些胺基酸殘基佔據的位置(如本文實施例3所限定)包含胺基酸取代。因此，本發明該方面優選的變體在選自下組的位置包含取代D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382，G383，L386，L387或H388，條件是，所述取代並非選自T254S，T254A，T254H，T254K，T254R，T254N，T254D，T254E，T254G，T254Q，Y302S，Y302A，Y302T，Y302H，Y302K，Y302R，Y302N，Y302D，Y302E，Y302G，Y302Q，F316S，F316A，F316T，F316H，F316K，F316R，F316N，F316D，F316E，F316G或F316Q。
上文列出的，位於活性位點區內、由有至少25％的側鏈暴露在表面的那些胺基酸殘基佔據的位置表明，大量的這類位置由帶電荷的胺基酸殘基佔據。對蛋白C，尤其上述區域的三維結構分析發現，至少一部分帶電殘基彼此相互作用。例如，據信K251與D214形成鹽橋。而且，還可見成簇的帶負電的胺基酸殘基(D214，E215和E357)。在不受任何具體理論束縛的條件下，上述區域內帶電荷的胺基酸殘基，或者至少是一部分這樣的胺基酸殘基，對於捕獲和/或結合底物/抑制劑十分重要。因此，本發明特別優選的胺基酸取代包括，活性位點區內由有至少25％的側鏈暴露在表面的那些胺基酸殘基佔據的位置上的帶電胺基酸殘基，被不帶電的胺基酸殘基，尤其是不帶電但具有極性側鏈的胺基酸殘基(Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn或Gln)取代；以及活性位點區內由有至少25％的側鏈暴露在表面的那些胺基酸殘基佔據的位置上的帶電胺基酸殘基，被帶相反電荷的胺基酸殘基取代。
使帶電荷的目標胺基酸殘基變為帶相反電荷，這類胺基酸取代的具體實例包括D172K，D172R，D189K，D189R，K191D，K191E，K192D，K192E，K193D，K193E，D214K，D214R，E215K，E215R，K217D，K217E，K218D，K218E，K251D，K251E，D255K，D255R，R306D，R306E，E307K，E307R，K308D，K308E，E309K，E309R，R312D，R312E，D351K，D351R，R352D，R352E，E357K，E357R，E382K和E382R，如D214K，D214R，E215K，E215R，K251D，K251E，E357K和E357R，e.g.D214K，D214R，K251D和K251E。
使帶電荷的目標胺基酸殘基被具有極性側鏈的胺基酸取代，這類胺基酸取代的具體實例包括D172G/S/T/C/Y/N/Q，D189G/S/T/C/Y/N/Q，K191G/S/T/C/Y/N/Q，K192G/S/T/C/Y/N/Q，K193G/S/T/C/Y/N/Q，D214G/S/T/C/Y/N/Q，E215G/S/T/C/Y/N/Q，K217G/S/T/C/Y/N/Q，K218G/S/T/C/Y/N/Q，K251G/S/T/C/Y/N/Q，D255G/S/T/C/Y/N/Q，R306G/S/T/C/Y/N/Q，E307G/S/T/C/Y/N/Q，K308G/S/T/C/Y/N/Q，E309G/S/T/C/Y/N/Q，R312G/S/T/C/Y/N/Q，D351G/S/T/C/Y/N/Q，R352G/S/T/C/Y/N/Q，E357G/S/T/C/Y/N/Q和E382G/S/T/C/Y/N/Q，如D214G/S/T/C/Y/N/Q，E215G/S/T/C/Y/N/Q，K251G/S/T/C/Y/N/Q和E357G/S/T/C/Y/N/Q，例如D214Q，E215Q，K251Q和E357Q，尤其K251Q。另一種有興趣的取代可能是K251N+T253A。
有興趣的取代的其它具體實例包括題為「以糖組分為非多肽組分的本發明偶聯物」和「本發明偶聯物，其中非多肽組分與半胱氨酸殘基連接」的章節中所公開的那些，尤其是選自下組的取代K251N，S252N，Y302N或S190+K192T，優選選自K251N或S252N，最優選K251N。
可以理解，只要合適，與本發明偶聯物有關的細節和具體描述(如，蛋白C的活化，取代的數量，偶聯物的配製，使用偶聯物的說明針對α-1-抗胰蛋白酶和人血漿的滅活作用的抗性增加)對於本發明的變體而言也是相同或相似的。因此，只要合適，與本發明偶聯物有關的聲明和詳述，在進行必要的修正後，可以應用於本文公開的蛋白C變體。
本發明偶聯物的非多肽組分如上所述，本發明偶聯物的非多肽組分優選選自聚合物分子、親脂性化合物、糖組分(通過體內糖基化的方式)和有機衍生劑。所有這些物質都可為偶聯物的多肽部分提供所需特性，特別是增加功能性體內半壽期和/或增加血漿半壽期。偶聯物的多肽部分可以僅與一種類型的非多肽組分偶聯，但也可以與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯，例如，與聚合物分子和糖組分偶聯，與親脂性基團和糖組分偶聯，與有機衍生劑和糖組分偶聯，與親脂性基團和聚合物分子偶聯等。與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯可同時或按順序進行。
製備本發明偶聯物的方法在下列章節「與親脂性化合物的偶聯」，「與聚合物分子的偶聯」，「與糖組分的偶聯」和「與有機衍生劑的偶聯」中描述與各種類型非多肽組分的偶聯。一般地，本發明的多肽偶聯物如下製備在有利於所述多肽表達的條件下培養合適的宿主細胞，獲取所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一個N-或O-糖基化位點，且所述宿主細胞是能進行體內糖基化的真核細胞，和/或b)所述多肽於體外偶聯非多肽組分。
應理解，對偶聯的設計應使所得分子在所連接的非多肽組分的數量，這類分子的大小和形式(如線性或分支)，以及在所述多肽上的連接位點各方面最佳。使用的非多肽組分的分子量可，如基於希望達到的效果進行選擇。例如，如果偶聯的主要目的是獲得具有高分子量的偶聯物(如減少腎清除)，通常要偶聯儘量少的高分子量非多肽組分，以獲得期望的分子量。如果希望掩蔽程度較高，可使用足量的低分子量非多肽組分(如分子量從約300Da到約5kDa，如分子量從300Da到2kDa)。
與聚合物分子的偶聯與多肽偶聯的聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或雜聚物，分子量通常範圍約300-100,000Da，如約500-20,000Da，更優選約500-15,000Da，甚至更優選約2-12kDa，如約3-10kDa。當此處所用術語「約」涉及某一分子量時，「約」就表示大約的平均分子量，且反映這樣一個事實，即在一定的聚合物製劑中通常有一定的分子量分布。
均聚物的實例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。雜聚物是含不同偶聯基團(如羥基和氨基)的聚合物。
合適的聚合物分子的實例包括選自以下的聚合物分子聚環氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共馬來酸酐，聚苯乙烯共馬來酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，或任何其它適於減小免疫原性和/或增加功能性體內半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物。聚合物分子的另一實例是人白蛋白或另一豐富的血漿蛋白。一般來說，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、無毒的、無抗原性的、無免疫原性的，具有各種水溶性特性並易於從活的生物中分泌。
PEG是優選的聚合物分子，因為其與，例如多糖如葡聚糖相比僅僅具有極少量的能交聯的反應基團。特別感興趣的是單功能PEG，如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因為它的偶聯化學相對簡單(僅僅一個反應基團可用於與多糖上的連接基團偶聯)。因此，交聯的危險被減弱，所得多肽偶聯物更均一併且聚合物分子與多肽的反應更易於控制。
為了使聚合物分子與多肽共價連接，聚合物分子的羥基末端基團必須為活化形式，即具有反應性功能基團(實例包括伯胺基團、醯肼(HZ)、巰基(thiol)、琥珀酸酯(SUC)、琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺(SSA)、琥珀醯亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀醯亞胺基丁酸酯(SBA)、琥珀醯亞胺基羧甲基化物(SCM)、苯並三唑碳酸酯(BTC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。適當活化的聚合物分子有商品，例如可得自Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
或者，聚合物分子可通過本領域已知的常規方法，例如，如WO 90/13540中所述活化。本發明中所使用活化型線性或分支聚合物分子的具體實例描述於Shearwater Polymers，Inc.1997和2000目錄(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polvethylene Glycoland Derivatives，引入本文供參考)。
活化的PEG聚合物的具體實例包括以下線性PEGNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，包括其mPEG形式；和分支的PEG如PEG2-NHS，包括其mPEG形式，以及US5,932,462和US 5,643,575(都引入本文作為參考)公開的那些。此外，引入本文供參考的下列出版物中公開了有用的聚合物分子和/或PEG化化學過程US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439 508，WO97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，US 5,736,625，WO98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。
多肽和活化的聚合物分子的偶聯可通過使用任何常規方法，例如，按下列參考文獻所述(所述參考文獻中也描述了活化聚合物分子的適宜方法)進行R.F.Taylor，(1991)，「Protein immobilisation.Fundamental andapplications」，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，「Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking」，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，「Immobilized Affinity Ligand Techniques」，Academic Press，N.Y.)。技術人員知道，將要使用的活化方法和/或偶聯化學取決於所述多肽的連接基團(以上已給出實例)以及聚合物的功能基(例如，是胺、羥基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀醯亞胺，馬來醯亞胺，vinysulfone或滷代醋酸鹽)。PEG化可涉及與多肽上的所有可利用的連接基團(即，暴露於多肽表面的連接基團)偶聯，或可與一個或多個特定的連接基團如，N-末端胺基直接偶聯(如US5,985,265所述)。而且，偶聯可以在一步中完成或以多步方式來完成(如，WO 99/55377所述)。
應理解，PEG化作用需設計為，使所得分子在連接的PEG分子的數目、這些分子的大小和形式(如，線性還是分支)，以及多肽分子的連接誒位點各方面最佳。例如，可根據需達到的效果來選擇所使用的聚合物的分子量。
僅與蛋白質上一個連接基團(如N-末端胺基)偶聯時，有利的是線性或分支的聚合物分子具有高分子量，優選約10-25kDa，如約15-25kDa，例如約20kDa。
一般來說，聚合物偶聯的條件是使儘可能多的可利用的聚合物連接基團與聚合物分子反應。這可以通過使所述聚合物相對於所述多肽適當摩爾過量來實現。通常，活化的聚合物分子與多肽的摩爾比最高可達約1000-1，如最高約200-1，或最高約100-1。有些情況下，為獲得最佳反應，所述摩爾比也可能略低，如最高約50-1，10-1，5-1，2-1或1-1。
本發明還涉及經由接頭使聚合物分子與多肽偶聯。合適的接頭是技術人員已知的。優選的實例是氰尿醯氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶聯後，按本領域已知的方法，如通過將伯胺加入到反應混合物中，來封閉殘留的活化型聚合物分子，並通過合適的方法除去所產生的失活的聚合物分子。
應理解，基於各種條件(如多肽的胺基酸序列，使用的活化型PEG化合物的性質以及特定的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比)，可能獲得不同程度的PEG化，較高程度的PEG化通常來自PEG與多肽的較高摩爾比。然而，來源於任何給定PEG化過程的PEG化多肽，通常包含PEG化程度略有不同的多肽偶聯物的隨機分布。
與糖組分的偶聯為實現蛋白C分子(包含一個或多個糖基化位點)的體內糖基化，必須將編碼該多肽的核苷酸序列插入糖基化的真核表達宿主中。表達宿主細胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)、昆蟲、或動物細胞，或選自轉基因植物細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞(如COS細胞、CHO細胞、BHK細胞或HEK細胞，如HEK293細胞)，或者昆蟲細胞(如SF9細胞)，或者酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)，或任何下文進一步描述的宿主細胞。
糖組分(如葡聚糖)與所述多肽的胺基酸殘基在體外的共價偶聯也可使用WO87/05330和Aplin等，CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981所述的方法。糖組分或PEG與蛋白質結合型和肽結合型Gln-殘基的體外偶聯也可以通過穀氨醯胺轉移酶(TGases)來進行。穀氨醯胺轉移酶以一種所謂的交聯反應的方式催化供體氨基轉移到蛋白-和肽-結合的Gln殘基上。供體氨基可以是蛋白-或肽-結合的，如賴氨酸殘基中的ε氨基，或也可以是小或大的有機分子的一部分。在穀氨醯胺轉移酶催化的交聯中作為氨基供體的小的有機分子如腐胺(1，4-二氨基丁烷)。在穀氨醯胺轉移酶催化的交聯中作為氨基供體的大的有機分子如含氨基-PEG(Sato等，1996，Biochemistry 35，13072-13080)。
通常，穀氨醯胺轉移酶是高度特異的酶，並非所有暴露於蛋白表面的Gln殘基都可用於穀氨醯胺轉移酶催化的含氨基物質的交聯。相反，只有少數Gln殘基是穀氨醯胺轉移酶的天然底物，但對於控制Gln殘基作為適合的穀氨醯胺轉移酶底物的確切參數仍不可知。因此，為了使蛋白對穀氨醯胺轉移酶催化的交聯反應敏感，經常的前提是在方便的位置增加一段胺基酸序列，所述胺基酸序列已知可很好地用做穀氨醯胺轉移酶的底物。已知幾種胺基酸序列可為穀氨醯胺轉移酶的底物，或包含穀氨醯胺轉移酶的底物，如物質P，elafin，纖維蛋白原，纖連蛋白，α2-纖溶酶抑制劑，α-酪蛋白和β-酪蛋白。
與有機衍生劑的偶聯所述多肽的共價修飾可通過多肽的一個或多個連接基團與有機衍生劑反應來進行。合適的衍生劑和方法在本領域中是已知的。例如，半胱氨醯基殘基最常與α-滷代乙酸酯(和相應的胺)，如氯乙酸或氯乙醯胺反應，產生羧甲基或羧基醯胺基甲基衍生物。半胱氨醯基殘基也可與以下物質反應而衍生溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯並-2-噁-1，3-二唑。組氨醯基殘基通過與二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0反應進行衍生，因為該試劑相對特異於組氨醯基側鏈。對溴苯甲醯甲基溴化物也有效；該反應優選在pH6.0的0.1M卡可酸鈉中反應。賴氨醯基和氨基末端殘基可與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應。用這些試劑進行衍生具有使賴氨醯基殘基的電荷逆轉的作用。適於使含α-氨基的殘基衍生的其它試劑包括亞氨基酯如甲基吡啶亞醯胺(methylpicolinimidate)、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氫硼化物、三硝基苯磺酸、鄰甲基異脲、2，4-戊二酮和轉氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應。精氨醯基殘基通過與一種或多種常規試劑的反應來修飾，所述試劑包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生要求反應在鹼性條件下進行，因為胍功能基的pKa較高。
此外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應。羧基側基(天冬氨醯基或穀氨醯基)通過與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應來進行選擇性修飾，其中R和R′是不同的烷基，如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨醯基和穀氨醯基通過與銨離子反應轉化為天冬醯醯胺基(asparaginyl)和穀氨醯醯胺基(glutaminyl)。
與親脂性化合物的偶聯多肽和親脂性化合物可以直接或通過使用接頭彼此偶聯。親脂性化合物可以是天然化合物如飽和或不飽和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺素、維生素、類胡蘿蔔素或甾體激素，或者合成的化合物如碳酸、醇、胺和具有一個或多個烷基-、芳基-、鏈烯基-的磺酸或其它多元不飽和化合物。可按本領域已知的方法，如按Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505中所述的方法來進行多肽和親脂性化合物之間的偶聯(任選通過接頭來連接)。
與標記多肽的偶聯多肽可表達為與標記物的融合蛋白，即通常由1-30，如1-20個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或肽段。除了能快速和容易地進行純化，標記物是完成標記多肽和非多肽組分之間偶聯的便利工具。特別是，標記物可用於在微滴定板或其它載體如順磁珠上完成偶聯，這樣標記的多肽可通過標記物來固定。在，例如，微滴定板上與標記的多肽偶聯的優點是，標記的多肽可從培養肉湯直接固定到微滴定板上(原則上不經任何純化)並進行偶聯。因此，可減少操作步驟(從表達到偶聯)的總數。而且，標記物可起間隔臂分子的作用以確保使固定的多肽更易於偶聯。使用標記多肽進行的偶聯可以是與本文中公開的任何非多肽組分的偶聯，如與聚合物分子如PEG的偶聯。
使用何種具體標記物不是關鍵，只要該標記物能與多肽一起表達並且能固定在適宜的表面或載體物質上即可。許多適宜的標記物可通過商業渠道獲得，例如，可購於Unizyme Laboratories，丹麥。例如，所述標記物可以是下列任一序列His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-HisMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-GlnMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln或下列任一序列EQKLI SEEDL(描述於Mol.Cell.Biol.53610-16，1985的C-端標記物)DYKDDDDK(C-或N-端標記物)YPYDVPDYA抗上述標記物的抗體通常可通過商業渠道獲得，例如購於ADI，AvesLab and Research Diagnostics。
隨後可用市售酶從多肽上將標記物切離。
製備本發明多肽變體或本發明偶聯物的多肽部分的方法本發明多肽變體或本發明偶聯物的多肽部分(任選為糖基化形式)可通過本領域已知的任何合適的方法來製備。這些方法包括構建編碼該多肽的核苷酸序列並在合適的轉化或轉染宿主中表達該序列。優選宿主細胞是γ-羧基化的宿主細胞，如哺乳動物細胞。然而，可通過化學合成方法或化學合成方法的組合或者化學合成方法和重組DNA技術的組合來產生本發明的多肽，但效率很低。
編碼本發明多肽變體或本發明偶聯物的多肽部分的核苷酸序列可通過分離或合成編碼親本蛋白C，如具有SEQ ID NO2和4所示胺基酸序列的蛋白C的核苷酸序列來構建，然後改變所述核苷酸序列以引入(即插入或取代)或消除(即去除或取代)相關胺基酸殘基。
核苷酸序列可通過已知方法經定點誘變方便地進行修飾。或者，核苷酸序列可通過化學合成來製備，例如通過使用寡核苷酸合成儀，其中基於所需多肽的胺基酸序列來設計寡核苷酸，並且優選選擇生產重組多肽的宿主細胞偏好的那些密碼子。例如，可以合成多個編碼所需多肽的各部分的小分子寡核苷酸，然後通過PCR、連接反應或連接酶鏈反應(LCR)(Barany，PNAS 88189-193，1991)來裝配。各個寡核苷酸通常含有5′或3′突出端用於互補裝配。
另有核苷酸序列修飾方法可用於產生多肽變體，以便將多肽變體用於高流量篩選，例如US5093257中公開的涉及同源交換的方法，以及有關基因改組的方法，即兩個或多個同源核苷酸序列間的重組，導致產生與起始核苷酸序列相比有許多核苷酸改變的新的核苷酸序列。基因改組(也被稱為DNA改組)涉及核苷酸序列的隨機片段化和重新裝配的一次或多次循環，隨之通過篩選選擇編碼具有所期望特性的多肽的核苷酸序列。為了使基於同源性的核酸改組能發生，所述核苷酸序列的相關部分優選至少有50％的同一性，如至少60％的同一性，更優選至少70％的同一性，如至少80％的同一性。重組可在體外或體內進行。
以下文獻中公開了適當的體外基因改組方法的實例Stemmer等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，NaturemVol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature Vol.370，pp.324-325；Zhao等，Nat.Biotechnol.1998.Mar；16(3)258-61；Zhao H.和Arnold，FB，Nucleic AcidsResearch，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research1998，Jan 15；26(2)pp.681-83；以及WO95/17413。
WO97/07205中公開了一種合適的體內改組方法。其它通過體外或體內重組進行核酸誘變的技術在，如WO97/20078和US5837458中公開。特別的改組技術包括「基因族改組(Family shuffling)」，「合成改組」「計算機(insliico)改組」。
基因族改組是使來自不同物種的一族同源基因進行一次或多次的改組和後續篩選或選擇的循環。基因族改組技術公開在，如Crameri等，(1998)，Nature，vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.259-264；Chang等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.793-797；以及Ness等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，893-896中。
合成改組涉及根據目的同源基因之間的序列比對來提供重疊的合成寡核苷酸文庫。使合成的寡核苷酸重組，對所得重組核酸序列進行篩選，如需要可用於進一步的改組循環。合成改組可參見WO00/42561。
計算機(in silico)改組指利用計算機系統實施或模擬(modelled)，因此部分或完全無須對核酸進行物理操作的一種DNA改組方法。計算機改組可參見WO00/42560。一旦裝配(通過合成、定點誘變或另一方法)後，編碼多肽的核苷酸序列立即被插入重組載體中，並與蛋白C在目標轉化宿主細胞中表達所必需的調控序列可操作地連接。
當然，應理解不是所有載體和表達調控序列都能同樣良好地表達本文所述多肽的核苷酸序列。不是所有宿主都能以相同的表達系統發揮同樣優良的功能。然而，本領域技術人員不用進行實驗就可以對這些載體、表達調控序列和宿主作出選擇。例如，在選擇載體時必須考慮宿主，因為載體必須能在其中複製或能整合到染色體中。也應考慮載體拷貝數、控制拷貝數的能力、以及載體編碼的任何其它蛋白質(如抗生素標記)的表達。在選擇表達調控序列時，也應考慮多種因素。這些因素包括，如，序列的相對長度、其可控制性、以及與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，特別要考慮潛在的二級結構。選擇宿主時應考慮它們與所選載體的相容性、核苷酸序列編碼的產物的毒性、宿主的分泌特性、宿主正確摺疊多肽的能力、宿主的發酵和培養需求、以及核苷酸序列編碼產物純化的難易。重組載體可以是自主複製的載體，即作為染色體外實體存在、其複製獨立於染色體複製的一種載體，例如質粒。另外，載體可以是引入宿主細胞時，可整合到宿主細胞基因組中並且與其整合的染色體一起複製的載體。
載體優選是表達載體，其中編碼本發明多肽的核苷酸序列可與核苷酸序列轉錄所需的額外片段可操作地連接。載體通常由質粒或病毒DNA衍生。用於在本文所述宿主細胞中表達的多種合適的表達載體是可商購的或有文獻描述的。可用於真核宿主的表達載體包括，如，含有來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達調控序列的載體。具體的載體如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，LaJola，CA，USA)。可用於酵母細胞的表達載體包括2μ質粒及其衍生物，POT1載體(US 4,931,373)，pJSO37載體(描述於Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用於昆蟲細胞的表達載體包括pVL941，pBG311(Cate等，＂Isolation of Bovine and Human Genes forMullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In AnimalCells＂，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都來自Invitrogen)。可用於細菌宿主的表達載體包括已知的細菌質粒，如來自大腸桿菌的質粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(都來自Novagen Inc.，WI，USA)，較寬宿主範圍的質粒，如RP4，噬菌體DNA，例如λ噬菌體的多種衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌體，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
本發明中使用的其它載體包括允許編碼多肽的核苷酸序列擴增多個拷貝的那些載體。這種可擴增的載體是本領域已知的。例如，它們包括能通過DHFR擴增的載體(例如參見Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufmanand Sharp，＂Construction Of A Modular Dihydrofolate Reductase cDNA GeneAnalysis Of Signals Utilized For Efficient Expression＂，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和可通過穀氨醯胺合成酶(″GS″)擴增的載體(例如參見US5,122,464和EP338,841)。
重組載體可進一步包含能使所述載體在目標宿主細胞中複製的DNA序列。此類序列的一個例子(宿主細胞是哺乳動物細胞時)是SV40的複製起始點。當宿主細胞是酵母細胞時，能使載體複製的合適序列是酵母質粒2μ複製基因REP 1-3和複製起始點。
載體也可含有可選擇的標記，如以其產物補充宿主細胞缺陷的那些基因，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)TPI的基因(P.R.Russell，Gene 40，1985，pp.125-130)，或者賦予對藥物如氨苄青黴素、卡那黴素、四環素、氯黴素、新黴素、潮黴素或氨甲蝶呤的抗性的基因。對於釀酒酵母來說，可選擇的標記包括ura3和leu2。對於絲狀真菌來說，可選擇的標記包括amdS、pyrG、arcB、niaD和sC。
術語「調控序列」在本文中包括對本發明多肽表達必需的或有利的所有成分。每個調控序列對編碼多肽的核苷酸序列來說可以是天然的或外來的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、增強子或上遊活化序列、信號肽序列和轉錄終止子。調控序列至少包括啟動子。
本發明可以使用各種各樣的表達調控序列。這些可使用的表達調控序列包括與前述表達載體的結構基因相連的表達調控序列以及已知調控原核或真核細胞或其病毒的基因表達的任何序列及其各種組合。
哺乳動物細胞中指導轉錄的合適調控序列的實例包括SV40和腺病毒的早期和晚期啟動子，如腺病毒2的主要晚期啟動子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子、人巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV)、人延伸因子1α(EF-1α)啟動子、果蠅最小熱休克蛋白70啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、人遍在蛋白C(UbC)啟動子、人生長激素終止子、SV40或腺病毒Elb區聚腺苷酸化信號和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)。
為了改進在哺乳動物細胞中的表達，可以將合成的內含子插入編碼所述多肽的核苷酸序列的5′非翻譯區。合成內含子的實例是來自質粒pCI-Neo的合成內含子(購自Promega Corporation，WI，USA)。
昆蟲細胞中指導轉錄的合適調控序列的實例包括多角體蛋白啟動子、P10啟動子、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多角體病毒鹼性蛋白啟動子、杆狀病毒立即早期基因1啟動子和杆狀病毒39K延遲早期基因啟動子、和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主細胞中使用的合適調控序列的實例包括酵母α交配系統的啟動子、酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)啟動子、來自酵母糖酵解基因或醇脫氫酶基因的啟動子、ADH2-4c啟動子和誘導型GAL啟動子。在絲狀真菌宿主細胞中使用的合適調控序列的實例包括ADH3啟動子和終止子、由編碼米麴黴TAKA澱粉酶丙糖磷酸異構酶或鹼性蛋白酶、黑麴黴α澱粉酶、黑麴黴或構巢麴黴(A.Nidulans)葡萄糖澱粉酶、構巢麴黴乙醯胺酶、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的啟動子、TPI1終止子和ADH3終止子。在細菌宿主細胞中使用的合適調控序列的實例包括lac系統、trp系統、TAC或TRC系統的啟動子和λ噬菌體的主要啟動子區域。
信號肽的存在與否取決於，例如，用於生產將要被表達的多肽(胞內或胞外多肽)的表達宿主細胞和是否需要分泌。為了在絲狀真菌中使用，信號肽可以由編碼麴黴屬菌株的澱粉酶或葡萄糖澱粉酶的基因、編碼米赫根毛黴脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便地衍生。信號肽優選由編碼米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定澱粉酶或黑麴黴葡萄糖澱粉酶的基因衍生。為了在昆蟲細胞中使用，信號肽可以由昆蟲基因方便地衍生(參見WO90/05783)，如鱗翅目Manduca sexta脂動激素前體(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蛻皮甾類UDP葡萄糖基轉移酶(glucosyltransferase，egt)(Murphy等，Protein Expression andPurification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods in Enzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳動物細胞中使用的優選信號肽是hFVII的或鼠Igκ輕鏈的信號肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 15289-104)。為了在酵母細胞中使用，合適的信號肽是釀酒酵母α-因子信號肽(參見US4870008)、改性的羧肽酶信號肽(參見L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信號肽(參見WO87/02670)、酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)以及合成的前導序列TA57(WO98/32867)。大腸桿菌的合適信號肽是信號肽ompA(EP581821)。
本發明編碼蛋白C多肽變體的核苷酸序列，無論通過定點誘變、合成、PCR或其它何種方法製備，可選包括編碼信號肽的核苷酸序列。如多肽需要從表達細胞中分泌則需要信號肽。這種信號肽，如果存在，應該是能被表達所述多肽的細胞識別的。信號肽可與所述多肽同源(如，通常與人蛋白C相連)或異源(如其起源異於人蛋白C)，或者可以與宿主細胞同源或異源，即所述信號肽是該宿主細胞通常表達的信號肽或者其不是該宿主細胞通常表達的信號肽。相應的，所述信號肽可以是原核的，如來源於細菌如大腸桿菌，或者是真核的，如來源於哺乳動物或昆蟲或酵母細胞。
可以使用任何合適的宿主產生本發明的多肽或本發明偶聯物的多肽部分，包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系、以及轉基因動物或植物。細菌宿主細胞的實例包括革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌屬，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、假單孢菌屬或鏈黴菌屬，或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌菌株。將載體引入細菌宿主細胞可通過，例如，原生質體轉化(參見如Chang and Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168111-115)、使用感受態細胞(參見如Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔(參見如Shigekawaand Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、或偶聯(參見如Koehler andThorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)來進行。合適的絲狀真菌宿主細胞的實例包括麴黴屬菌株，如米麴黴、黑麴黴或構巢麴黴，鐮刀菌屬或木黴菌屬。真菌細胞可以通過涉及以下的過程轉化原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁通過本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了轉化麴黴屬宿主細胞的合適方法。在Malardier等人1989，Gene 78147-156和WO96/00787中描述了轉化鐮刀菌屬的合適方法。合適的酵母宿主細胞的實例包括糖酵母屬的菌株(如釀酒酵母)、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica)、漢遜酵母屬(如多形漢遜酵母)、或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，InAbelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920；以及由Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母轉化系統試劑盒的產品手冊)中所述的方法來轉化。合適的昆蟲宿主細胞的實例包括鱗翅目細胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細胞(HighFive)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法轉化昆蟲細胞並在其中產生異源多肽。合適的哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細胞系(COS)(如，COS1(ATCCCRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細胞(如，NS/O)、倉鼠幼鼠腎臟(BHK)細胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人細胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養中的植物細胞。其它合適的細胞系在本領域中是已知的並可購自公共保藏中心，如美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳動物細胞(如CHO細胞)可按US5047335所述方法進行改性來表達唾液酸轉移酶，如，1，6-唾液酸轉移酶，以便改進蛋白C多肽的糖基化。
為了增加分泌，使本發明多肽與內切蛋白酶，尤其是PACE(配對的鹼性胺基酸轉化酶)(如US5986079中所述)，如Kex2內切蛋白酶(如WO00/28065中所述)一起產生是有利的。
將外源DNA引入哺乳動物宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導的轉染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、病毒載體和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000進行的轉染方法。這些方法在本領域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York，USA中所述。哺乳動物細胞的培養按建立的方法進行，例如參見Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc，Totowa，NewJersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997。
在本發明的生產方法中，用本領域已知的方法在適於生產多肽的營養培養基中培養細胞。例如，細胞可以在實驗室中通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續、成批、補料分批或固態發酵)或在合適培養基和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行工業發酵。培養在含有碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中使用本領域已知的方法來進行。合適的培養基可商購或可以按公開的組成來製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中所述的)。如果多肽分泌在營養培養基中，該多肽可從培養基中直接回收。如果多肽不被分泌，可從細胞裂解物中回收。
可通過本領域已知的方法來回收所得多肽。例如，可通過常規方法包括但不限於離心、過濾、超濾、提取或沉澱從營養培養基中回收多肽。
可通過本領域已知的各種方法包括但不限於層析(如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(如，製備性等電聚焦)、溶解度差異(如，硫酸銨沉澱)、或提取(參見，如Protein Purification，J.-C.Janson andLars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來純化多肽。
藥物組合物和用途本發明另一方面涉及一種藥物組合物，它包含本發明的偶聯物或本發明的變體，以及一種可藥用的載體或賦形劑。在上下文中，「可藥用」意指在給藥的患者中不引起任何不想要或有害的作用的載體或賦形劑。這類可藥用載體和賦形劑在本領域中是已知的(參見，如Remington′s PharmaceuticalSciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company ；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins，S.Frokjaerand L.Hovgaard，Eds.，Taylor Francis ；和Handbook of PharmaceuticalExcipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press )。
本發明另一方面涉及本發明的偶聯物，本發明的變體，或本發明的藥物組合物用於製備藥物的用途。更具體地，本發明的偶聯物，變體或藥物組合物可用於製備治療下列的藥物發作(stroke)；心肌梗塞；靜脈血栓後；彌散性血管內凝血(DIC)；膿毒症(sepsis)；敗血性休克；栓塞(emboli)，如肺栓塞；移植，如骨髓移植；燒傷；妊娠；重大外科手術/創傷或成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，尤其是用於製備治療敗血性休克的藥物。
本發明還涉及治療或預防選自下組的疾病的方法發作；心肌梗塞，靜脈血栓後；彌散性血管內凝血(DIC)；膿毒症；敗血性休克；栓塞，如肺栓塞；移植，如骨髓移植；燒傷；妊娠；重大外科手術/創傷或成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，所述方法包括對需要相應治療的患者給予有效量的本發明偶聯物、本發明變體、或本發明藥物組合物，尤其是治療或預防(更尤其是治療)敗血性休克。
本發明中「患者」包括人和其它哺乳動物。因此所述方法可用於人的治療或獸用。
本發明的多肽變體和偶聯物可以以有效劑量給予患者。本文中「有效劑量」是指對所治疾病狀態足以產生預期效果的劑量。給藥的準確劑量取決於所治疾病，可由本領域技術人員通過已知的方法加以確定。如上所述，治療嚴重膿毒症時，以24μg/kg/h人APC的量給藥96小時，它對應於體重約100kg的患者給藥總量約230mg的蛋白。本發明偶聯物和變體由於血漿半壽期增加，使其在血漿中發揮作用的時間延長，因此被認為具有較強的效力。這種增強的效力可以，例如，通過計算「人血漿滅活試驗II」中曲線以下的面積(AUC)來評估，或者通過測定血清半壽期來評估。增強的效力是指，針對具體疾病獲得所需效應所必需的有效劑量比人APC的有效劑量小(需要給藥的蛋白的量更少)。此外，血漿半壽期增加還使得能在給定的時間段有規律地使用APC變體或偶聯物進行治療。因此，這些新特性導致能以較少量和/或和較少的給藥次數(如大藥丸注射(bolus injection))來使用本發明的化合物。例如，本發明的化合物可以以大藥丸(bolus)或灌輸劑或它們的組合的形式給藥，給藥劑量的範圍從每第二小時給藥1μg/kg體重的大藥丸，持續數日(如96小時)至每第四日給藥1mg/kg體重的大藥丸一次。優選以儘可能小的劑量給藥儘可能少的次數，例如，每4-96小時，例如，每8-96小時，如每16-96，每24-96小時，每40-96小時，每48-96小時，每56-96小時，每72-96小時，按照1-500μg/kg體重，優選1-250μg/kg體重，如1-100μg/kg體重，更優選1-50μg/kg體重的量給藥大藥丸。
本發明優選的化合物是，用本文實施例13所述「人血漿滅活試驗II」檢測時，其活性形式的AUC與人APC的AUC的比率至少為1.25的那些。優選所述比率至少為1.5，如至少為2，例如至少為3，更優選所述比率至少為4，如至少為5，例如至少為6，還更優選所述比率至少為7，如至少為8，例如至少為9，最優選所述比率至少為10。
本發明的多肽變體或偶聯物可「以其原本的形式」和/或以其鹽的形式使用。合適的鹽包括但不限於，與鹼金屬或鹼土金屬，例如鈉，鉀，鈣和鎂的鹽以及例如鋅形成的鹽。這些鹽或複合物可以以結晶和/或無定形的結構存在。
本發明的藥物組合物可以單獨給藥或與其它治療劑一起給藥。這些製劑可以摻合在同一種藥物組合物中，或者可以與本發明的多肽或偶聯物分開給藥，可以是同時給藥，或者按照另一種治療時間表給藥。此外，本發明的多肽、偶聯物或藥物組合物可以作為其它治療的輔助形式。
本發明的藥物組合物可以配製成各種形式，例如液體，膠，凍幹品，或壓縮固體。優選的形式取決於所治療的具體適應徵且對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
本發明的配製劑可以以多種方式給藥，包括但不限於，口服、皮下，靜脈內、小腦內、鼻內、經皮、腹膜內、肌肉內、肺內、經陰道、經直腸、眼內或以任何其它適宜的方式。儘管使用本領域熟知的技術(例如泵或植入)進行大丸藥注射是可接受的，但所述配製劑可以以輸注的方式連續用藥。在某些情況下，配製劑可以以溶液或噴霧劑的形式直接應用。
非胃腸道組合物(Parental composition)藥物組合物的實例是設計成非胃腸道給藥的溶液。儘管在很多情況下，藥物溶液配製劑可以以適用於立即使用的液體形式提供，但所述非胃腸道配製劑也可以以冷凍或凍幹形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。後一劑型通常用於增強組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩定性，正如本領域技術人員已知的那樣，凍幹製劑通常比其液體相應物更穩定。所述凍幹製劑在使用前通過加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如無菌注射用水或無菌生理鹽水溶液重新配製。
在非胃腸道給藥的情況下，它們被製成凍幹的配製劑或水溶液的形式，方法是根據需要，將具有所需純度的多肽與一種或多種本領域常用的可藥用載體、賦形劑或穩定劑(統稱為「賦形劑」)適當混合，賦形劑如緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
緩衝劑有助於將pH維持在接近生理條件的範圍內。它們通常以大約2mM-50mM的濃度範圍存在。本發明使用的合適緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽如檸檬酸鹽緩衝劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩衝劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽(gluconate)緩衝劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩衝劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑、組氨酸緩衝劑和三甲胺鹽如Tris。
可以加入防腐劑來阻滯微生物生長，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯亞甲基鎓滷化物(如苯亞甲基鎓氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。
可以加入等滲劑來確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優選三羥或更高級糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以相對其它組分的量計算。
穩定劑涉及一大類賦形劑，其功能範圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助於防止變性或與容器壁粘附的添加劑。通常的穩定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；胺基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環醇如環己六醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，穀胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個殘基)；蛋白質如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基於活性蛋白質重量計算，穩定劑通常的存在範圍為0.1-10000重量份。
可以存在非離子表面活性劑或去汙劑(也稱作「溼潤劑」)以有助於溶解治療劑以及保護治療性多肽以避免攪拌誘導的聚集，其也允許配製劑暴露於剪切表面壓力而不導致多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫20、吐溫80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如澱粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。
活性組分也可以被包裹在通過，例如coascervation技術或通過界面聚合所製備的微囊，如羥甲基纖維素、明膠或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，包裹在膠體狀藥物運送體系(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中，或包裹在大乳劑中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公開了這些技術。
體內給藥所使用的非胃腸道製劑必須是無菌的。該過程可通過，例如，除菌濾膜的過濾而輕易完成。
持續釋放製劑持續釋放製劑的合適例子包括含有多肽或偶聯物的固體疏水聚合物的半滲透基質、具有合適形式如膜或微囊的基質。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-穀氨酸和L-穀氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技術或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能長時間釋放分子如長達或超過100天，某些水凝膠在較短時間內釋放蛋白質。當包囊中的多肽長時間保留在體內時，它們因在37℃潮溼的環境中暴露而變性或聚集，導致生物活性喪失並且可能改變免疫原性。合理的穩定策略可根據所涉及的機理設計。例如，如果發現聚集機理是通過硫代二硫化物相互交換形成分子內S-S鍵，那麼可通過修飾巰基、將酸性溶液凍幹、控制溼度、使用適宜的添加劑和開發特異性聚合物基質組合物來達到穩定。
圖1顯示了純化的野生型人APC以及本發明的各種偶聯物和變體。這些蛋白在凝膠上遷移，有三條明顯的帶對應於表觀分子量分別為41,000和37,000的重鏈α-和β-鏈，以及表觀分子量為22,000的輕鏈。可以從圖1所示的凝膠上分析糖基化程度偶聯物D214N和M338N的重鏈的遷移位置更靠近陰極(與變體K251N和S252N相反，其顯然未利用引入的糖基化位點)，這表明這兩種變體都被糖基化，並且位點都得到充分利用。對重鏈亞型(α和β)的遷移的檢查表明，每一位點的糖側鏈的分子量約為3,000-4,000。
圖2顯示本發明各種偶聯物和變體與不同濃度的α-1-抗胰蛋白酶(16.6μM(黑條)和42.3μM(白條))一起在37℃保溫20小時後，殘餘的醯胺裂解活性。詳述參見本文實施例11。
圖3和4顯示人血漿中，本發明各種偶聯物和變體的殘餘醯胺裂解活性的時間函數。詳細情況，包括計算出的人血漿中的體內半壽期，參見本文實施例13。
本發明由以下非限制性實施例進一步舉例說明。
方法可接近的表面區域(ASA)用電腦程式Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(1983 Yale University)計算所述結構中各個原子的可接近的表面區域(ASA)。該方法一般使用1.4的探針大小且將可接近的表面區域(ASA)定義為由探針的中心形成的區域。計算前，從坐標系(coordinate set)中去掉所有水分子和氫原子，也除去與該蛋白質不直接相關其它原子。
側鏈的分部(fractional)ASA側鏈原子的分部ASA通過用側鏈中原子的ASA總和除以延伸的ALA-x-ALA三肽中代表該殘基類型的側鏈原子的ASA值來計算。參見Hubbard，Campbell Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該實例中，將CA原子視為甘氨酸殘基而非其它殘基的側鏈的一部分。下列值作為側鏈的標準100％ASA來用
Ala69.23 Leu 140.76 Arg200.35 2Lys 162.50 2Asn106.25 2Met 156.08 2Asp102.06 2Phe 163.90 2Cys96.69 2Pro 119.65 2Gln140.58 2Ser 78.16 2Glu134.61 2Thr 101.67 2Gly32.28 2Trp 210.89 2His147.00 2Tyr 176.61 2Ile137.91 2Val 114.14 2該結構中未探測到的殘基被定義為100％暴露，因為可以認為這些殘基位於彈性區域。
確定原子之間的距離原子之間的距離用分子製圖軟體，例如InsightIIO v.98.0，MSI Inc.確定。
實施例實施例1-確定暴露在表面的胺基酸野生型人APC的X-線結構的坐標(Mather，T.，Oganessyan，V.，Hof，P.，Huber，R.，Foundling，S.，Esmon，C.，Bode，W.，1996)可從蛋白資料庫(PDB)(Bernstein et.al.J.Mol.Biol.(1977)112 pp。535)獲得，也可以從The ResearchCollaboratory for Structural Bioinformatics PDB在http//www.pdb.org/的登錄密碼為1AUT的地址獲得其電子版本。在計算可接近的表面積之前，從該結構中除去所有水分子以及共價結合的抑制劑。在本實施例中，第71位的β羥基-ASP(AP)作為常規ASP殘基進行處理。殘基K156-R169(Lys-Arg二肽和活性肽)不包括在計算中。
序列編號本實施例中使用的序列編號等同於具有SEQ ID NO4所示酶原蛋白C的序列編號。
表面暴露對APC分子進行分部ASA計算，得出以下具有可接近性為0的側鏈的殘基G67，C89，C98，G103，C105，H107，C109，Y124，G142，G173，V186，L187，A198，V199，I201，V206，L207，T208，A210，C212，V221，E235，I258，A259，L260，L261，L263，A267，V274，I276，L283，V297，C331，M335，A346，G361，M364，T371，F373，L374，G376，L377，V392，I403。
以下殘基有25％以上的側鏈暴露在表面Q49，L51，V52，P54，L55，E56，H57，P58，C59，A60，S61，G65，H66，T68，I70，D71，G72，I73，G74，S75，F76，S77，D79，R81，S82，G83，W84，E85，R87，F88，Q90，R91，E92，F95，L96，N97，S99，L100，D101，L110，E111，E112，V113，G114，W115，R117，S119，P122，G123，K125，G127，D128，D129，L130，L131，Q132，H134，P135，A136，V137，K138，R143，W145，K146，D172，K174，M175，R177，R178，D180，D189，S190，K191，K192，K193，H202，P203，H211，D214，E215，S216，K217，K218，L220，R229，R230，W231，K233，W234，L236，D237，D239，K241，E242，V243，F244，V245，P247，N248，S250，K251，S252，T253，T254，D255，A264，Q265，P266，T268，S270，Q271，D280，S281，G282，E285，R286，E287，Q290，A291，G292，Q293，E294，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313，R314，T315，F316，F320，K322，P327，H328，N329，E330，S332，E333，V334，S336，N337，M338，S340，E341，I348，L349，G350，D351，R352，E357，S367，H369，G370，E382，G383，C384，L386，L387，H388，R398，D401，H404，G405，H406，R408，D409。可看出，活性位點組氨酸(H211)暴露在表面。但H211不是本發明要予以修飾的候選者。而以上所列的半胱氨酸殘基通常也不是本發明所要修飾的殘基。
以下殘基有50％以上的側鏈暴露在表面Q49，L51，V52，P54，L55，E56，A60，S61，G65，I70，D71，G72，I73，G74，S75，S77，D79，R81，S82，R87，R91，E92，F95，L96，N97，S99，Bill，V113，G114，W115，R117，P122，K125，D128，D129，L130，Q132，H134，V137，K138，K146，D172，K174，R177，S190，K191，K192，K193，D214，E215，K217，K218，R229，R230，W231，K233，D239，K241，E242，P247，N248，K251，S252，Q265，P266，T268，Q271，S281，E285，Q290，G292，Y302，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，N313，T315，K322，N329，E330，E333，S336，N337，M338，E341，I348，G350，R352，E357，G370，G383，H388，R398，D401，H404，G405，R408，D409。
殘基A1，N2，S3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，H10，S11，S12，L13，E14，R15，E16，C17，I18，E19，E20，I21，C22，D23，F24，E25，E26，A27，K28，E29，I30，F31，Q32，N33，V34，D35，D36，T37，L38，A39，F40，W41，S42，K43，H44，V45，D46，G47，D48，R147，M148，E149，K150，K151，R152，S153，H154，L155，K410，E411，A412，P413，Q414，K415，S416，W417，A418，P419都不包括在所述結構中，並且，在本申請中，被視為100％暴露於表面的類型。
實施例2-活性位點區的確定使用以下方法確定活性位點區使用程序Modeller『98，將APC的重連(1AUT)重疊(superimposing)在三元(ternary)複合物的X-線結構上，所述複合物由結合於活性位點中的凝血因子VIIa、組織因子以及一種BPTI變體組成(PDB登錄號1FAK.參見Zhang，E.，St Charles，R.，Tulinsky，A.Structure ofExtracellular Tissue Factor Complexed with Factor Viia Inhibited with a BptiMutant J.Mol.Biol.285 pp.2089(1999))，從而能將「活性位點區」定義為APC重連中，具有與所重疊的BPTI分子相距不超過12的原子的任何殘基。此外，觀察發現，位於該區以外的一個環(殘基306-314)也被認為是活性位點區的組成部分。
用這種方法發現以下殘基包括在「活性位點區」中L170，I171，D172，G173，Q184，V185，V186，L187，L188，D189，S190，K191，K192，K193，L194，A195，C196，G197，A198，T208，A209，A210，H211，C212，M213，D214，E215，S216，K217，K218，L219，L220，L228，I240，V243，V245，N248，Y249，S250，K251，S252，T253，T254，D255，N256，D257，I258，A259，L261，T295，L296，V297，T298，G299，W300，G301，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313，R314，T315，F316，I321，I323，P324，V326，C331，V334，M335，S336，N337，M338，V339，M343，L344，C345，A346，G347，I348，L349，D351，R352，Q353，D354，A355，C356，E357，G358，D359，S360，G361，G362，P363，M364，G376，L377，V378，S379，W380，G381，E382，G383，C384，G385，L386，L387，H388，N389，Y390，G391，V392，Y393和T394。活性位點殘基(H211，D257和S360)儘管也列在其中，但它們不是本發明將要修飾的候選者。而上述所列的半胱氨酸殘基通常也不是本發明將要修飾的候選者。
實施例3-確定活性位點區內的表面暴露型胺基酸將具有25％以上側鏈暴露於表面的胺基酸的列表(見實施例1)與包括在活性位點區內的胺基酸的列表(見實施例2)組合，發現以下胺基酸殘基既位於活性位點區內、又有至少25％的側鏈暴露在表面
D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，H211，L220，V243，V245，N248，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313，R314，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382，G383，C384，L386，L387和H388。活性位點組氨酸(H211)儘管也在此列中，但它不是本發明將要修飾的候選者。C384通常也不是本發明將要修飾的候選者。
實施例4-構建蛋白C表達載體編碼人蛋白C前體的基因通過用PCR組裝合成型寡核苷酸而構建，所用方法類似於Stemmer等，(1995)Gene 164，pp.49-53所述。天然(native)蛋白C的信號序列被保留以便於基因產物的分泌。合成基因經過設計，在5』端有NheI位點，在3』端有XbaI位點，用這些位點將其亞克隆至pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)中CMV啟動子之後。所得質粒命名為pCR4，其中的蛋白C前體序列見SEQ ID NO1。
此外，為了檢驗較高水平的基因表達，將合成基因克隆至pcDNA3.1/Hygro的KpnI-XbaI位點中，使該基因的5』非翻譯區中包含一個內含子(來自pCI-Neo(Promega))。將所得質粒命名為pRC2。
實施例5-定點誘變用Quick-Change(Stratagene)構建蛋白C的所有突變體。引物購自TAGTechnology(Copenhagen)，它們含有合適的突變。按照廠家手冊進行PCR反應，將質粒轉化至TG1感受態細胞中。在單個克隆上製備質粒製劑，用DNA測序儀3100 genetic Ahalyser(ABI)檢驗序列。
引物D172NPOF003CAAGTAGATCCGCGGCTCATTAACGGGAAGATGACCAGGCGGGGPOF004CCCCGCCTGGTCATCTTCCCGTTAATGAGCCGCGGATCTACTTGD214NEKO001CTGACAGCGGCCCACTGCATGAACGAGTCCAAGAAGCTCCTTGTC
EKO002GACAAGGAGCTTCTTGGACTCGTTCATGCAGTGGGCCGCTGTCAGD214AEK0048CTGACAGCGGCCCACTGCATGGCCGAGTCCAAGAAGCTCCTTGTCEK0049GACAAGGAGCTTCTTGGACTCGGCCATGCAGTGGGCCGCTGTCAGK251NEK0003CTTCGTCCACCCCAACTACAGCAACAGCACCACCGACAATGACATCEK0004GATGTCATTGTCGGTGGTGCTGTTGCTGTAGTTGGGGTGGACGAAGS252NEKO005CGTCCACCCCAACTACAGCAAGAACACCACCGACAATGACATCGCEK0006GCGATGTCATTGTCGGTGGTGTTCTTGCTGTAGTTGGGGTGGACGY302NEK0007CCCTCGTGACGGGCTGGGGCAACCACAGCAGCCGAGAGAAGGAGGCCEK0008GGCCTCCTTCTCTCGGCTGCTGTGGTTGCCCCAGCCCGTCACGAGGGM338NEK0011CAGCGAGGTCATGAGCAACAACGTGTCTGAGAACATGCEK0012GCATGTTCTCAGACACGTTGTTGCTCATGACCTCGCTGM338AEK0046GCAGCGAGGTCATGAGCAACGCCGTGTCTGAGAACATGCEK0047
GCATGTTCTCAGACACGGCGTTGCTCATGACCTCGCTGCD189N+K191NEK0019CCCCTGGCAGGTGGTCCTGCTGAACTCAAACAAGAAGCTGGCCTGCGGGGEK0020CCCCGCAGGCCAGCTTCTTGTTTGAGTTCAGCAGGACCACCTGCCAGGGGD189N+K191TEK0033CCCCTGGCAGGTGGTCCTGCTGAACTCAACCAAGAAGCTGGCCTGCGGGGEK0034CCCCGCAGGCCAGCTTCTTGGTTGAGTTCAGCAGGACCACCTGCCS190N+K192TEK0044GGCAGGTGGTCCTGCTGGACAACAAGACCAAGCTGGCCTGCGGGGCAGTGCEK0045GCACTGCCCCGCAGGCCAGCTTGGTCTTGTTGTCCAGCAGGACCACCTGCCK191N+K193TEKO050GTCCTGCTGGACTCAAACAAGACCCTGGCCTGCGGGGCAGTGEK0051CACTGCCCCGCAGGCCAGGGTCTTGTTTGAGTCCAGCAGGACK217N+L219TEK0029GCATGGATGAGTCCAACAAGACCCTTGTCAGGCTTGGAGAGTATGACCEK0030GGTCATACTCTCCAAGCCTGACAAGGGTCTTGTTGGACTCATCCATGC
T253N+D255TEK0031CCAACTACAGCAAGAGCAACACCACCAATGACATCGCACTGCTGCACCTGGCEK0032GCCAGGTGCAGCAGTGCGATGTCATTGGTGGTGTTGCTCTTGCTGTAGTTGGS305N+E307TEK0023GGCTGGGGCTACCACAGCAACCGAACCAAGGAGGCCAAGAGAAACCGCEK0024GCGGTTTCTCTTGGCCTCCTTGGTTCGGTTGCTGTGGTAGCCCCAGCCE307N+E309TEK0025GGCTACCACAGCAGCCGAAACAAGACCGCCAAGAGAAACCGCACCTTCGEK0026CGAAGGTGCGGTTTCTCTTGGCGGTCTTGTTTCGGCTGCTGTGGTAGCCS336N+M338TEK0027GCAGCGAGGTCATGAACAACACCGTGTCTGAGAACATGCTGTGTGCGGGEK0028CCCGCACACAGCATGTTCTCAGACACGGTGTTGTTCATGACCTCGCTGCL386N+H388TEK0017GGTGAGCTGGGGTGAGGGCTGTGGGAACCTTACCAACTACGGCGTTTACACCEK0018
GGTGTAAACGCCGTAGTTGGTAAGGTTCCCACAGCCCTCACCCCAGCTCACC實施例6-製備野生型蛋白C和蛋白C變體的瞬時表達用Fugene轉染試劑(Roche)在COS7細胞中進行，所述細胞培養在添加了10％胎牛血清，2mM L-穀氨醯胺，100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素和5μg/ml維生素K的DMEM(Gibco21969035)中。轉染當天，將培養基更換為新鮮培養基，4-5小時後進行轉染。轉染的次日，將培養基更換為基於DMEM(Gibco 31053-028)的無血清製備培養基，其中添加有2mM L-穀氨醯胺，1mM丙酮酸鈉，1/500 Ex-cyte(serologicals)，1/100 ITSA(Gibco 51300-044)，100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素和5μg/ml維生素K。保溫2天後，收穫培養基，分析所表達的變體的產生和活性(見以下實施例9)。
實施例7-純化根據說明書，將約15mg Ca特異性單克隆抗體偶聯至5ml CNBr-活化的Sepharose FF(Pharmacia)上。將約1ml已偶聯的基質裝填至HR 10柱中，用緩衝液A(20mM Tris，0.3M NaCl，5mM CaCl2，pH7.5)以1ml/min的流速洗柱。使大約90ml已過濾除菌的培養基含有0.3M NaCl和5mM CaCl2，然後以相同流速加載於柱中。洗脫前，用20倍柱體積的緩衝液A洗柱。洗脫用緩衝液B(20mM Tris和10mM EDTA，pH7.5)進行，按照1ml的級分進行分級分離。通過OD280，western印跡和SDS-PAGE確定含有蛋白C的級分，將它們收集在一起並於-80℃貯藏。上述純化方法只是眾多可能用於純化蛋白C的方法之一(參見，例如Kiesel，J.Clin.Invest.(1979)64 pp.761-769)。
所純化的蛋白用活化方案進行活化(見以下實施例8)。所有蛋白的純度通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)進行檢查。此外，糖基化程度從這些凝膠分析物中評估，方法是監控分子量的變化。相對於野生型人APC具有增加的表觀分子量，就說明APC變體已經糖基化。
野生型APC和APC變體的實例可見圖1。蛋白在凝膠上遷移，有三條明顯的帶對應於表觀分子量分別為41,000和37,000的重鏈α-和β-鏈，以及表觀分子量為22,000的輕鏈。糖基化程度也可以在此PAGE分析中進行研究。圖1包括兩種APC變體，它們在引入的糖基化位點發生糖基化。APC變體D214N和M338N的重鏈的遷移位置更靠近陰極，這表明這兩種變體都被糖基化，並且位點都得到充分利用。對重鏈亞型(α和β)的遷移的檢查表明，每一位點的糖側鏈的分子量約為3,000-4,000。
實施例8-活化蛋白C變體和偶聯物用毒液蛋白C激活劑ACC-C活化(Nakagaki等，Thrombosis Research 58593-602，1990)。將酶原形式在37℃的50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，5mM EDTA中用終濃度為1ng/ml的ACC-C保溫約60min。活化過程用APC醯胺裂解活性試驗(見以下實施例9)和聚丙烯醯胺凝膠電泳進行檢查。
實施例9-測定醯胺裂解活性APC醯胺裂解試驗人APC和本發明化合物的醯胺裂解活性用肽底物SPECTROZYMEPCa進行測定，所述肽底物具有通式H-D-Lys(γ-Cbo)-Pro-Arg-pNA.2AcOH(American Diagnostica Inc，產品編號336)，終濃度為0.5mM。試驗在23℃的50mM Tris-HCl(pH8.3)，100mM NaCl，5mM CaCl2中進行。PCa底物被人APC和本發明化合物水解的速率在讀板儀(plate reader)中於405nm記錄3min，記錄形式為吸光單位/min的改變。
結果分析所表達和活化的所有偶聯物和變體的活性。如上所述對4μl(未純化的)細胞培養物進行分析。所獲得的活性至少依賴於表達水平，因而不反映比活性，但它可指示蛋白是否表達以及它們是否具有活性。
獲得了以下活性
表1化合物 milliOD405/min野生型COS 7 APC 41D214N 28D214A(對照)10K251N*19S252N*16Y302N*14M338N 53M338A(對照)33D189N+K191T8D189N+K191N(對照) 12S190N+K192T*29K191N+K193T4K217+L219T 16T253N+D255T2S305N+E307T6E307N+E309T30S336N+M338T4L386N+H388T13*未能通過SDS-PAGE檢測出與引入的糖基化位點連接的糖組分將選定的候選者純化，用濃度為30nM的蛋白經上述試驗測定它們的特異性醯胺裂解活性。發現以下活性
表1b化合物 milliOD405/min ％野生型APC野生型COS 7 APC 48.9 -D214N34.8 71K251N*45.2 92S252N*43.1 88M338N44.8 92S336N+M338T 41.5 85L386N+H388T 23.0 47*未能通過SDS-PAGE檢測出與引入的糖基化位點連接的糖組分可以看出，所測試的偶聯物和變體的特異性醯胺裂解活性與野生型人APC分子的處在相同水平。
實施例10-測定抗凝活性APC凝血試驗抗凝活性通過監控凝血時間的延長來評估，所述監控是在活化的部分促凝血酶原激酶時間(APTT)試驗中用Nycoplastin(Nycomed，產品編號1002448)以及常規止血參考血漿(Normal Hemostasis Reference Plasma，American Diagnostica Inc.，目錄號258N)進行。凝血通過將含有APC或本發明化合物的APTT試劑與常規止血參考血漿在37℃一起保溫而啟動，並通過手動混合來測量凝血時間。將人APC的凝血時間與本發明化合物的凝血時間進行比較，以便計算抗凝活性，並表示為人APC抗凝活性的百分比。
結果使用上述試驗發現以下抗凝活性表2化合物 抗凝活性(％人APC)D214N 22.4K251N*24.5S252N*24.5M338N 34.7L386N+H388T 14.3*未能通過SDS-PAGE檢測出與引入的糖基化位點連接的糖組分這些結果表明，本發明偶聯物和變體的抗凝活性在很大程度上得以保留。這清楚地表明，有可能設計出具有顯著增加的針對血漿抑制作用的抗性(見以下實施例)並保留抗凝活性的APC變體和偶聯物。
實施例11-α-l-抗胰蛋白酶的滅活作用α-l-抗胰蛋白酶滅活試驗人APC或本發明化合物與16.6或42.3μM人α-1-抗胰蛋白酶(Sigma)在10mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，5mM CaCl2(含0.1％BSA)中37℃保溫。保溫20小時後，從保溫的混合物中取15μl樣品添加至微滴板中110μl的50mM Tris-HCl(pH8.3)，100mM NaCl，5mM CaCl2中，如「APC醯胺裂解試驗」中所述，分析APC醯胺裂解活性。計算殘餘活性，參照缺乏α-1-抗胰蛋白酶但仍在相同條件下保溫的樣品所獲得的活性進行標準化。
結果用上述試驗獲得以下結果
表3％殘餘的醯胺裂解活性化合物16.6μM抑制劑 42.3μM抑制劑野生型血漿APC 10 2野生型COS 7 APC 7 ＜1D214N 80 81D214A(對照) 21 1K251N*62 53S252N*62 34Y302N*50 30M338N 38 12M338A(對照) 9 2D189N+K191T 90 77D189N+K191N(對照) 12 ＜1S190N+K192T*28 5K191N+K193T 59 24K217+L219T20 4T253N+D255T 56 38S305N+E307T 42 9E307N+E309T 10 ＜1S336N+M338T 72 40L386N+H388T 68 44*未能通過SDS-PAGE檢測出與引入的糖基化位點連接的糖組分以上數據也示於圖2。結果表明，實際上所有偶聯物對α-1-抗胰蛋白酶的抑制作用的抗性增強。尤其，D214N和D189N+K191T即使在最高的α-1-抗胰蛋白酶濃度也保留了70％以上的醯胺裂解活性。這些化合物糖基化的效應在將這兩種偶聯物與缺乏糖基化的D214A和D189N+K191N進行比較時得以顯示。這些變體比它們的糖基化等價物受到更顯著的抑制，說明糖基化作用對於增強針對α-1-抗胰蛋白酶抑制作用的抗性十分重要。而且應注意到，變體K251N，S252N，Y302N和S190+K192T(它們顯然並未利用它們的引入的糖基化位點，如SDS PAGE所判定)與野生型人APC相比，顯著增強了它們針對α-1-抗胰蛋白酶抑制作用的抗性。
實施例12-人血漿的滅活作用人血漿滅活試驗I人APC或本發明的化合物在含50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，5mM CaCl2的的90％正常人血漿(Sigma Diagnostics，AccuclotTM參考血漿)中37℃保溫。200min後，取等份試樣，如「APC醯胺裂解試驗」所述分析APC醯胺裂解活性。將200min後的殘餘APC活性表示為開始實驗時APC活性的百分比。
結果使用上述試驗獲得以下結果表4在90％的正常人血漿中200min後化合物的％殘餘的醯胺裂解活性野生型血漿APC 5野生型COS 7 APC 7D214N 80K251N*57S252N*45M338N 22S336N+M338T 45L386N+H388T 72*未能通過SDS-PAGE檢測出與引入的糖基化位點連接的糖組分以上結果清楚表明，本發明的偶聯物和變體對人血漿的滅活作用具有較高抗性。
實施例13-人血漿中的體外半壽期人血漿滅活試驗II人APC或本發明的化合物在含50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，5mM CaCl2的90％正常人血漿(Sigma Diagnostics，AccuclotTM參考血漿)中37℃保溫。在不同時間點取等份試樣，如「APC醯胺裂解試驗」所述分析APC醯胺裂解活性。將不同時間點的殘餘APC活性表示為開始實驗時APC活性的百分比。計算體外半壽期(以分鐘計)，表示為仍然保留50％APC活性的時間。
結果獲得以下體外半壽期表5化合物 體外半壽期 相對於野生型人APC(min)的倍數增加野生型血漿APC40 -野生型COS 7 APC 42 -D214N＞400 ＞10K251N*2556.4S252N*1553.9M338N85 2.1S336N+M338T 1854.6L386N+H388T ＞400 ＞10*未能通過SDS-PAGE檢測出與引入的糖基化位點連接的糖組分以上實驗數據也可見於圖3和4。這些結果表明，APC變體和偶聯物在人血漿中具有顯著增加的體外半壽期。尤其D214N和L386N+H388T偶聯物顯示出顯著增加的體外半壽期(增加10倍以上)。
序列表110馬克西根公司(Maxygen Aps)；馬克西根控股公司(Maxygen Holding)120蛋白C或活化的蛋白C-樣分子1300219wo310-protein C140
141
16040170Patent In Ver.2.121012111383212DNA213人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)..(1383)220
221mat_peptide222(127)..(1383)4001atg tgg cag ctc aca agc ctc ctg ctg ttc gtg gcc acc tgg gga att 48Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile-40 -35 -30tcc ggc aca cca gct cct ctt gac tca gtg ttc tcc agc agc gag cgt 96Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg-25 -20 -15gcc cac cag gtg ctg cgg atc cgc aaa cgt gcc aac tcc ttc ctg gag 144Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu-10 -5 -11 5gag ctc cgt cac agc agc ctg gag cgg gag tgc ata gag gag atc tgt 192Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys10 15 20gac ttc gag gag gcc aag gaa att ttc caa aat gtg gat gac aca ctg 240Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu25 30 35gcc ttc tgg tcc aag cac gtc gac ggt gac cag tgc ttg gtc ttg ccc 288Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro40 45 50ttg gag cac ccg tgc gcc agc ctg tgc tgc ggg cac ggc acg tgc atc 336Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile55 60 65 70gac ggc atc ggc agc ttc agc tgc gac tgc cgc agc ggc tgg gag ggc 384Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly75 80 85cgc ttc tgc cag cgc gag gtg agc ttc ctc aat tgc tcg ctg gac aac 432Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn
90 95 100ggc ggc tgc acg cat tac tgc cta gag gag gtg ggc tgg cgg cgc tgt480Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys105 110 115agc tgt gcg cct ggc tac aag ctg ggg gac gac ctc ctg cag tgt cac528Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His120 125 130ccc gca gtg aag ttc cct tgt ggg agg ccc tgg aag cgg atg gag aag576Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys135 140 145 150aag cgc agt cac ctg aaa cga gac aca gaa gac caa gaa gac caa gta624Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val155 160 165gat ccg cgg ctc att gat ggg aag atg acc agg cgg gga gac agc ccc672Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro170 175 180tgg cag gtg gtc ctg ctg gac tca aag aag aag ctg gcc tgc ggg gca720Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala185 190 195gtg ctc atc cac ccc tcc tgg gtg ctg aca gcg gcc cac tgc atg gat768Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp200 205 210gag tcc aag aag ctc ctt gtc agg ctt gga gag tat gac ctg cgg cgc816Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg215 220 225 230tgg gag aag tgg gag ctg gac ctg gac atc aag gag gtc ttc gtc cac864Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His235 240 245ccc aac tac agc aag agc acc acc gac aat gac atc gca ctg ctg cac912Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His250 255 260ctg gcc cag ccc gcc acc ctc tcg cag acc ata gtg ccc atc tgc ctc960Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val pro Ile Cys Leu265 270 275ccg gac agc ggc ctt gca gag cgc gag ctc aat cag gcc ggc cag gag1008Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu280 285 290acc ctc gtg acg ggc tgg ggc tac cac agc agc cga gag aag gag gcc1056Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala295300 305 310aag aga aac cgc acc ttc gtc ctc aac ttc atc aag att ccc gtg gtc1104Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val315 320 325ccg cac aat gag tgc agc gag gtc atg agc aac atg gtg tct gag aac1152Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn330 335 340atg ctg tgt gcg ggc atc ctc ggg gac cgg cag gat gcc tgc gag ggc1200
Met Leu Cys Ala G1y Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly345 350 355gac agt ggg ggg ccc atg gtc gcc tcc ttc cac ggc acc tgg ttc ctg1248Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu360 365 370gtg ggc ctg gtg agc tgg ggt gag ggc tgt ggg ctc ctt cac aac tac1296Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr375 380 385 390ggc gtt tac acc aaa gtc agc cgc tac ctc gac tgg atc cat ggg cac1344Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His395 400 405atc aga gac aag gaa gcc ccc cag aag agc tgg gca cct1383Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro410 4152102211461212PRT213人(Homo sapiens)4002Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile-40 -35 -30Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg-25 -20 -15Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu-10 -5 -1 1 5Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys10 15 20Asp Phe Glu Glu A1a Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu25 30 35Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro40 45 50Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile55 60 65 70Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly75 80 85Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn90 95 100Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys105 110 115Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His120 125 130Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys135 140 145 150Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val
155 160 165Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro170 175 180Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala185 190 195Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp200 205 210Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg215220 225 230Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His235 240 245Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His250 255 260Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu265 270 275Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu280 285 290Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala295 300 305 310Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val315 320 325Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn330 335 340Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly345 350 355Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu360 365 370Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr375 380 385 390Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His395 400 405Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro410 41521032111257212DNA213人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)..(1257)4003gcc aac tcc ttc ctg gag gag ctc cgt cac agc agc ctg gag cgg gag 48
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65 70 75 80Arg Ser Gly Trp Glu Gly Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu85 90 95Asn Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu100 105 110Val Gly Trp Arg Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp115 120 125Asp Leu Leu Gln Cys His Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro130 135 140Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu145 150 155 160Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr165 170 175Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys180 185 190Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr195 200 205Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly210 215 220Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile225230 235 240Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn245 250 255Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr260 265 270Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu275 280 285Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser290 295 300Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe305 310 315 320Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser325 330 335Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg340 345 350Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe355 360 365His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys370 375 380Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu385 390 395 400Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser
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223人工序列的描述引物40040ggtgtaaacg ccgtagttgg taaggttccc acagccctca ccccagctca cc 5權利要求
1.一種偶聯物，其包含至少一個與蛋白C多肽共價連接的非多肽組分，所述蛋白C多肽含有以下胺基酸序列，該序列不同於親本蛋白C多肽的胺基酸序列之處在於，引入和/或去除了至少一個含有可與所述非多肽組分連接的基團的胺基酸殘基。
2.權利要求1的偶聯物，其中所述親本蛋白C多肽具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列或者是它的變體。
3.權利要求2的偶聯物，其中所述親本蛋白C多肽具有SEQ ID NO4所示的胺基酸序列。
4.權利要求1-3任一項的偶聯物，是它的活化形式。
5.權利要求1-4任一項的偶聯物，其中已引入至少一個與非多肽組分連接的基團。
6.權利要求5的偶聯物，其中已引入至少一個糖基化位點。
7.權利要求6的偶聯物，其中所述糖基化位點是體內糖基化位點。
8.權利要求7的偶聯物，其中所述糖基化位點已被引入到由下述胺基酸殘基所佔據的位置，所述胺基酸殘基有至少25％的側鏈暴露在表面(如本文實施例1的限定)。
9.權利要求8的偶聯物，其中所引入的糖基化位點選自D172N+K174S，D172N+K174T，D189N+K191S，D189N+K191T，S190N+K192S，S190N+K192T，K191N+K193S，K191N+K193T，K192N+L194S，K192N+L194T，K193N+A195S，K193N+A195T，D214N，D214N+S216T，E215N+K217S，E215N+K217T，S216N+K218S，S216N+K218T，K217N+L219S，K217N+L219T，K218N+L220S，K218N+L220T，L220N+R222S，L220N+R222T，V243N+V245S，V243N+V245T，V245N+P247S，V245N+P247T，S250N，S250N+S252T，K251N，K251N+T253S，S252N，S252N+T254S，T253N+D255S，T253N+D255T，T254N+N256S，T254N+N256T，D255N+D257S，D255N+D257T，L296N，L296N+T298S，Y302N，Y302N+S304T，H303N，H303N+S305T，S304N+R306S，S304N+R306T，S305N+E307S，S305N+E307T，R306N+K308S，R306N+K308T，E307N+E309S，E307N+E309T，K308N+A310S，K308N+A310T，E309N+K311S，E309N+K311T，A310N+R312S，A310N+R312T，R312N+R314S，R312N+R314T，T315N+V317S，T315N+V317T，F316N+L318S，F316N+L318T，V334N，V334N+S336T，S336N+M338S，S336N+M338T，V339S，V339T，M338N，M338N+S340T，I348N+G350S，I348N+G350T，L349N+D351S，L349N+D351T，D351N+Q353S，D351N+Q353T，R352N+D354S，R352N+D354T，E357N+D359S，E357N+D359T，G383N+G385S，G383N+G385T，L386N+H388S，L386N+H388T，L387N+N389S，L387N+N389T，H388N+Y390S或H388N+Y390T。
10.權利要求9的偶聯物，其中所引入的糖基化位點選自D189N+K191S，D189N+K191T，S190N+K192S，S190N+K192T，K191N+K193S，K191N+K193T，D214N，D214N+S216T，K217N+L219S，K217N+L219T，K251N，K251N+T253S，S252N，S252N+T254S，T253N+D255S，T253N+D255T，Y302N，Y302N+S304T，T253N+D255S，T253N+D255T，S336N+M338S，S336N+M338T，V339S，V339T，M338N，M338N+S340T，G383N+G385S，G383N+G385T，L386N+H388S或L386N+H388T。
11.權利要求10的偶聯物，其中所引入的糖基化位點選自D189N+K191S，D189N+K191T，K191N+K193T，D214N，D214N+S216T，K251N，K251N+T253S，S252N，S252N+T254S，T253N+D255S，T253N+D255T，Y302N，Y302N+S304T，S305N+E307T，S305N+E307S，S336N+M338S，S336N+M338T，V339S，V339T，M338N，M338N+S340T，G383N+G385S，G383N+G385T，L386N+H388S或L386N+H388T。
12.權利要求11的偶聯物，其中所引入的糖基化位點選自D189N+K191T，K191N+K193T，D214N，K251N，S252N，T253N+D255T，Y302N，S305N+E307T，S336N+M338T，V339T，M338N，G383N+G385T或L386N+H388T。
13.權利要求12的偶聯物，其中所引入的糖基化位點選自D189N+K191T，K191N+K193T，D214N，T253N+D255T，S305N+E307T，S336N+M338T，M338N，G383N+G385T或L386N+H388T。
14.權利要求13的偶聯物，其中所引入的糖基化位點選自D189N+K191T，D214N或L386N+H388T。
15.權利要求1-4任一項的偶聯物，其中所述引入和/或去除的連接基團選自賴氨酸殘基，穀氨酸殘基，天冬氨酸殘基，酪氨酸殘基，絲氨酸殘基或半胱氨酸殘基。
16.權利要求15的偶聯物，其中所述連接基團已被引入到由下述胺基酸殘基所佔據的位置或者已從所述位置去除該連接基團，所述胺基酸殘基有至少25％的側鏈暴露在表面(如本文實施例1的限定)。
17.權利要求16的偶聯物，其中所述連接基團被引入或被去除的位置選自D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，G383，L386，L387或H388。
18.權利要求17的偶聯物，其中所述連接基團被引入或被去除的位置選自D189，S190，K191，D214，K217，K251，S252，T253，Y302，S305，E307，S336，N337，M338，G383或L386。
19.權利要求18的偶聯物，其中所述連接基團被引入或被去除的位置選自D189，D214，K251，S252，T253，Y302，S305，S336，N337，M338，G383或L386。
20.權利要求15-19任一項的偶聯物，其中所引入的連接基團是半胱氨酸殘基。
21.權利要求15-20任一項的偶聯物，其中所述非多肽組分是聚合物分子。
22.權利要求21的偶聯物，其中所述非多肽組分是線性或分支的聚乙二醇或聚環氧烷。
23.權利要求5-14任一項的偶聯物，其還包含權利要求15-22任一項限定的非多肽組分。
24.權利要求1-23任一項的偶聯物，其中，當它為活性形式，並且當用本文實施例9所述的「APC醯胺裂解試驗」檢測時，其活性為野生型人APC活性的至少10％。
25.權利要求1-24任一項的偶聯物，其中，當它為活性形式，並且當用本文實施例10所述的「APC凝血試驗」檢測時，其抗凝活性為野生型人APC抗凝活性的至少10％。
26.權利要求1-25任一項的偶聯物，其中，當它為活性形式時，比人APC更能抵抗α-1-抗胰蛋白酶的滅活效應。
27.權利要求26的偶聯物，其中，當它為活性形式，並且當用16.6μM的抑制劑濃度經本文實施例11所述的「α-1-抗胰蛋白酶滅活試驗」檢測時，殘餘活性至少為20％。
28.權利要求1-27任一項的偶聯物，其中，當它為活性形式時，對人血漿的滅活作用的抗性增加。
29.權利要求28的偶聯物，其中，當它為活性形式，並且當用本文實施例12所述的「人血漿滅活試驗I」檢測時，具有至少20％的殘餘活性。
30.權利要求28或29的偶聯物，當用本文實施例13所述的「人血漿滅活試驗II」檢測時，所述偶聯物的活性形式的體外半壽期與人APC的體外半壽期的比例至少為1.25。
31.權利要求1-30任一項所述的偶聯物，當其為活性形式時，與人APC相比，功能性體內半壽期增加或者血清半壽期增加。
32.權利要求31的偶聯物，其中所述偶聯物的功能性體內半壽期或血清半壽期與人APC的功能性體內半壽期或血清半壽期的比例至少為1.25。
33.親本蛋白C多肽的變體，所述變體在選自下組的位置包含一個取代D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382，G383，L386，L387和H388，條件是，所述取代不選自T254S，T254A，T254H T254K，T254R，T254N，T254D，T254E，T254G，T254Q，Y302S，Y302A，Y302T，Y302H，Y302K，Y302R，Y302N，Y302D，Y302E，Y302G，Y302Q，F316S，F316A，F316T，F316H，F316K，F316R，F316N，F316D，F316E，F316G或F316Q。
34.權利要求33的變體，其中所述親本蛋白C多肽具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列。
35.權利要求33或34的變體，為其活性形式。
36.權利要求33-35任一項的變體，所述變體是權利要求9-20任一項所限定的偶聯物的多肽部分。
37.權利要求36的變體，其中所述變體包含選自K251N，S252N或Y302N的取代。
38.權利要求33-37任一項的變體，其具有權利要求24-32任一項限定的特性。
39.一種核苷酸序列，其編碼權利要求33-38任一項限定的變體。
40.一種表達載體，其包含權利要求39限定的核苷酸序列。
41.一種宿主細胞，其包含權利要求39限定的核苷酸序列或權利要求40限定的表達載體。
42.權利要求41的宿主細胞，其選自COS，CHO，BHK或HEK293細胞。
43.一種藥物組合物，其包含權利要求1-32任一項限定的偶聯物或權利要求33-38任一項限定的變體以及一種可藥用載體或賦形劑。
44.用作藥物的，權利要求1-32任一項限定的偶聯物，權利要求33-38任一項限定的變體，或權利要求43限定的藥物組合物。
45.權利要求1-32任一項限定的偶聯物，權利要求33-38任一項限定的變體，或權利要求43限定的藥物組合物的用途，用於製備治療下述情況的藥物發作，心肌梗塞，靜脈血栓後；彌散性血管內凝血(DIC)；膿毒症；敗血性休克；栓塞，如肺栓塞；移植，如骨髓移植；燒傷；妊娠；重大外科手術/創傷或成人呼吸窘迫症候群(ARDS)。
46.權利要求45的用途，用於製備治療敗血性休克的藥物。
47.治療或預防選自下組的情況的方法發作，心肌梗塞，靜脈血栓後；彌散性血管內凝血(DIC)；膿毒症；敗血性休克；栓塞，如肺栓塞；移植，如骨髓移植；燒傷；妊娠；重大外科手術/創傷或成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，所述方法包括對需要相應治療的患者給予權利要求1-32任一項限定的偶聯物，權利要求33-38任一項限定的變體，或權利要求43限定的藥物組合物。
48.權利要求47的方法，用於治療或預防敗血性休克。
49.製備權利要求1-32任一項所限定的偶聯物的方法，該方法包括，在誘導所述偶聯物的多肽部分表達的條件下培養合適的宿主細胞，並回收該多肽，其中a)所述多肽包含至少一個N-或O-糖基化位點，且所述宿主細胞是能進行體內糖基化的真核宿主細胞，和/或b)所述多肽在體外與非多肽組分偶聯。
50.一種增加親本蛋白C多肽的功能性體內半壽期或血清半壽期的方法，該方法包括，將組成非多肽組分的連接基團的胺基酸殘基引入親本蛋白C多肽中，和/或將組成所述連接基團的胺基酸殘基除去，並使所得的經修飾的多肽與所述非多肽組分偶聯，所述引入的位置包含將其至少25％的側鏈暴露在表面的胺基酸殘基(如本文實施例1所限定)但不含所述連接基團，所述非多肽組分具有被引入和/或去除的作為連接基團的胺基酸殘基。
全文摘要
本發明涉及蛋白C的多肽變體與非多肽組分，如PEG或糖部分的新偶聯物。具體地，本發明提供對諸如人血漿和α1－抗胰蛋白酶的滅活作用抗性增強的新的蛋白C偶聯物。所述偶聯物的體內半壽期延長。優選的實施例包括蛋白C偶聯物，其中已經引入至少一個額外的體內N－糖基化位點。本發明的偶聯物可用於治療多種疾病，包括敗血性休克。
文檔編號C12N15/57GK1535313SQ01817571
公開日2004年10月6日 申請日期2001年10月15日 優先權日2000年10月18日
發明者金·V·安德森, 安德斯·H·佩德森, 珀·O·弗雷斯克加爾德, H 佩德森, じダ姿箍思傭 , 金 V 安德森 申請人:馬克西根公司, 馬克西根控股公司