一類具有改善阿爾茲海默病作用的β1-腎上腺素受體激動劑的製作方法
2023-10-11 17:09:54
專利名稱：一類具有改善阿爾茲海默病作用的β1-腎上腺素受體激動劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類具有β I-腎上腺素受體激動劑活性的化合物，該類化合物作為βI腎上腺素受體激動劑具有很好的治療阿爾茨海默病的活性。
背景技術：
阿爾茨海默症(Alzheimer' s disease,AD)亦稱老年性痴呆症或早老性痴呆症，是老年期常見的一類慢性、進行性神經細胞退行性病變。隨著人口的老齡化，AD已成為僅次於心血管病、腫瘤和中風而居第四位的死因。有關AD的病因以及發病機理至今尚不明確，目前尚無特效治療藥物。AD的病理標誌是β-澱粉樣蛋白(β-amyloid,A0 )在胞外沉積形成老年斑以及NFT-tau磷酸化，同時，神經炎症已經成為引發AD的第三個關鍵病理標誌，在AD進程中，神經炎症反應參與AD早期的發病機制。腦內的神經炎症進程主要由小膠質細胞所介導，激活後的小膠質細胞可釋放大量的前體炎症因子，造成腦內鄰近細胞炎症及死亡，加劇β_澱粉樣蛋白的沉積，從而引發神經元功能障礙，導致神經變性的發生。β I-腎上腺素受體(β -adrenoceptor, β I-AR)是經典的G蛋白偶聯受體家族的成員，其生物學效應主要由經典的Gs-cAMP-PKA信號通路介導。β I-AR激活後通過Gs蛋白調節能夠激活腺苷酸環化酶(AC)活性，增加細胞內cAMP的水平，激活蛋白激酶A(PKA)及其調控的蛋白質磷酸化，在調控交感神經和中樞神經系統去甲腎上腺素神經元的神經遞質釋放方面起關鍵性作用。β I-AR與中樞神經系統(CNS)的突出可塑性(synapticplasticity)有關，β 1-AR的激活可引起海馬體和杏仁核的長時程增強效應(long-termpotentiation，LTP)，增強動物的記憶組織。國外研究表明，內源性去甲腎上腺素(NA)可使促炎症因子IL-I β、IL-6和腫瘤壞死因子TNF-α等水平下降，還可對抗體外神經膠質細胞穀氨酸引起的興奮性毒性，產生神經保護作用；同時，β I-AR激動劑還可劑量依賴性的增加皮質紋狀體富集的酪氨酸磷酸酶(STEP)翻譯水平，這種酶可以增強認知、改善學習記憶。這些研究提示腦內了 β I-AR的代謝和調節可能與AD發病、預防和治療有一定關係，但目前臨床上尚無此類藥物出現。
發明內容
本發明的目的在於提供一種治療阿爾茨海默病的化合物，該化合物是β I-腎上腺素受體激動劑，對阿爾茨海默病有預防或者治療作用。本發明所述的化合物包括含治療有效量的化學式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽。本發明採用高通量篩選技術，建立了 β I-腎上腺素受體激動劑高通量篩選模型並應用於化合物大規模篩選，通過篩選一批從CHEMDIV公司購買的化合物並進行功能性驗證尋找到了具有化學式(I)的β -腎上腺素受體激動劑，同時對其進行相關的AD藥效學和機制研究。本發明的技術方案為在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)內穩定轉染β I腎上腺素受體，建立β I腎上腺素受體激動劑高通量篩選模型，進行初篩，復篩，構效關係分析，得到一類具有抗阿爾茲海默病的候選藥物。具體步驟如下步驟一建立及培養穩定轉染β I腎上腺素受體的CHO細胞株。步驟二 標準曲線的測定及最佳細胞數確定。步驟三陽性藥驗證。步驟四採用穩轉細胞株和摸索的最佳檢測條件對化合物進行β I腎上腺素受體激動劑的高通量篩選，得到有明顯量效關係的化合物。
圖I :標準曲線及最佳細胞數曲線圖2 :陽性藥扎莫特羅(XamoteiOl)量效關係曲線圖3 :化合物1-6的EC50圖4 :化合物 7-12 的 EC50
具體實施例方式以下結合
本發明的
具體實施例方式I.建立及培養穩定轉染β I腎上腺素受體的CHO-β I細胞株。應用重組酶介導的盒交換技術(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量構建G蛋白偶聯受體細胞株，並使其穩定轉染β I腎上腺素受體，培養CHO-β I細胞使其達到穩定生長狀態。2.標準曲線的測定及最佳細胞數確定。為驗證實驗體系的正確性以及能篩選出可靠的β I腎上腺素受體激動劑，在建立模型時需要測定標準曲線並確定最佳細胞數。待CHO-β I細胞生長到80%的時用O. 5mMEDTA的PBS消化細胞，離心去除上層液體，最後將細胞用刺激緩衝液重懸用於確定最佳細胞數。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit試劑盒，配製標準環磷酸腺苷(cAMP)梯度稀釋液及腺苷酸環化酶激活劑(forskolin)梯度稀釋液。標準曲線測定方法^fcAMP的標準溶液50 μ mol/L (LANCE cAMP檢測試劑盒自帶)，用刺激緩衝液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，cAMP與抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個小時後檢測；最佳細胞數檢測方法將50mM的forskolin母液用刺激緩衝液逐級稀釋為終濃度4倍的工作濃度，forskolin與含有細胞的抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個小時後在EnVision微孔板測讀儀上檢測。根據forskolin量效曲線窗口(性噪比S/B)及曲線與cAMP標準曲線斜率相近的細胞濃度作為最佳細胞數。標準曲線及最佳細胞數確定見圖I。3.選用β I腎上腺素受體激動劑的陽性藥Xamoterol對所建立的β I腎上腺素活性篩選模型進行驗證並且根據量效曲線計算其的EC5Q。陽性藥測定方法將IOOmM的Xamoterol母液，用刺激緩衝逐級稀釋為終濃度2倍的工作濃度，陽性藥Xamoterol 5 μ I與含有最佳細胞數的抗體溶液5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液再孵育一個小時後用EnVision微孔板測讀儀檢測，陽性藥量效曲線見圖2。4.在上述的最佳檢測條件下進行β I腎上腺素受體激動劑的的初篩和復篩。
初篩與復篩過程相同，初篩只選用一個濃度對8萬個化合物進行初步篩選，再選擇初篩有效的化合物梯度稀釋8個濃度進行復篩，過程如下用Janus全自動加樣工作站稀釋化合物並吸取5 μ I轉移到384孔板中，再用Multidrop自動加樣儀將含有最佳細胞數的抗體溶液5 μ I加入384孔板中，兩者共同孵育45分鐘後，Multidrop自動加樣儀將10 μ I終止液加入384孔板中，再次孵育一個小時，用EnVision微孔板測讀儀檢測。復篩得到一系列具有Dl受體激動作用的化合物。處理數據，計算化合物EC5tl，各個化合物的EC5tl見圖3，圖 4。復篩實驗結果篩選得到的化合物可以根據母核的結構總結為一類，結構式與EC5tl如下
權利要求
1.下述化合物(I)或其藥學上可以接受的鹽
2.權利要求I要求保護的式(I)的化合物或其藥學上可以接受的鹽作為PI腎上腺素受體激動劑的藥理作用用途。
3.按照權利要求2的用途，作為PI腎上腺素受體激動劑，用於改善阿爾茲海默病。
全文摘要
本發明涉及一類具有β1-腎上腺素受體激動活性的化學式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽，有很強的體外激動β1-腎上腺素受體的活性，EC50均為nM水平，其中活性最強的化合物的EC50為24.34±0.94，可以作為神經保護劑，用於治療阿爾茨海默病。
文檔編號A61P25/28GK102977111SQ20121054359
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者張陸勇, 何玲, 嚴明, 蘇冉 申請人:中國藥科大學