大鼠骨髓msc體內移植定向分化為視網膜結構的方法
2023-09-23 08:01:05
專利名稱：大鼠骨髓msc體內移植定向分化為視網膜結構的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用骨髓間充質幹細胞體內定向分化為視網膜結構的方法。
背景技術：
視網膜疾病佔重症眼病的一半以上，因而自身修復效果往往不好，對於較輕的視網膜損傷目前主要採取抗炎治療或營養因子治療，而對重度損傷迄今尚無很好的治療方法，主要是玻璃體止血、促進凝血的吸收。許多病例由於未能及時治療或無藥可就而導致視力下降甚至失明，因此尋找更好的治療方法對於治療視網膜疾病至關重要。
幹細胞工程的研究為視網膜損傷的治療提供了一種新的途徑。骨髓間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，是在骨髓中類似成纖維細胞的一類細胞，具有多方向分化潛能，可以向多種組織細胞轉化。自體骨髓間充質幹細胞還具有取材方便、無免疫原性、具有多向分化潛能、合乎倫理學要求並且無致瘤性，具有其它幹細胞不可比擬的優勢。
由於視網膜結構複雜、組成細胞種類多，加之此處為免疫赦免區，血液內的幹細胞很難達到。即使骨髓內的幹細胞、具有分化為視網膜的能力也很難達到損傷部位。因此，探討MSCs向視網膜細胞誘導分化條件及細胞移植方式將對損傷視網膜的修復治療具有深遠意義。
發明內容
本發明的目的是為了提供一種骨髓間充質幹細胞體內移植定向分化為視網膜結構的方法。採用以下技術方案1)從大鼠骨髓中分離出的骨髓間充質幹細胞在體內進行定向誘導分化的方案，其特徵在於利用特定的細胞密度(2×105/mL)進行體內移植；2)將MSCs移植到大鼠體內，其特徵在於移植時使用的體積為10μL/眼，採用單點注射；3)將MSCs移植到大鼠體內，其特徵在於注射方式為視網膜下移植；4)將MSCs移植到大鼠體內，其特徵在於骨髓間充質幹細胞在原位分化成的視網膜結構包括視網膜色素上皮細胞、視錐、視杆細胞、雙極細胞及節細胞。
本發明的內容未公開發表，本領域的技術人員如不花費創造性勞動根本不能根據現有的技術推斷得到本發明的分離方法。
具體實施例方式
1.大鼠MSCs的體外培養(全過程注意無菌操作，戴滅菌手套)6周齡雄性大鼠斷頸處死，75％酒精中浸泡1min，於超淨臺內消毒腰盤中剝去大鼠皮，做MSCs的分離培養，具體步驟為①去雙側股骨，剝淨上面的肌肉，用D-Hank’s液衝洗；②將兩頭的關節面小心橫斷切開，用注射器帶9號針頭吸取2mL含10％胎牛血清(Hyclone)的低糖DMEM插入骨髓腔衝洗；③如此反覆衝洗4-5遍，1500rpm×5min離心收集細胞，用培養液洗滌一次，離心；④現配Percoll將骨髓細胞重懸於2-3mL培養液中，3000rpm×30min離心，吸取界面上的細胞層(其中含有紅細胞，界面呈淺紅色)，用培養液稀釋至5mL，1500rpm×5min離心收集細胞；⑤以2.3×105cell/well接種於Φ30mm的塑料平皿中。
2.視網膜下移植治療並觀察MSCs移植均採取如下方法①細胞經0.25％胰酶消化，至終濃度為2×105/mL，用50μL微量注射器吸取10μL備用；②大鼠(♀)於麻醉後即刻沿結膜顳側邊緣1mm處剪開約1/2，以能夠暴露顳側眼球為準；③用6.5號針頭斜向插入顳側鞏膜，再將吸取細胞的微量注射器的針頭沿外切方向插入此孔，針面對準視網膜，輕輕將細胞液體注入到視網膜下，滴加抗生素類眼藥防止外傷感染。
3.大鼠Y染色體sry基因的獲得及sry基因探針標記①設計針對大鼠sry基因的擴增引物根據文獻確定sry基因兩端引物為primer 15′-AGA TCT TGA TTT TTA GTG TTC-3′primer 25′-TGC AGC TCT ACT CCA GTC TTG-3′②從雄性大鼠腎臟提取基因組DNA，利用PCR擴增sry基因片段；
③sry探針的DIG標記應用PCR DIG probc synthesis kit(Rochc，cat#1 636 090)對探針進行PCR方法的DIG標記，利用Roche High Pure PCR product purification kit回收；④組織切片的檢測將組織切片先行HE染色，觀察其結構，進行掃描式的切片進行原位DNA雜交檢測。
結果在正常大鼠注射MSCs組各層均發現sry雜交陽性細胞，細胞形態與各層細胞相符。
權利要求
1.一種富集大鼠骨髓間充質幹細胞的方法，其特徵在於培養的骨髓間充質幹細胞為原代至2代細胞。
2.按權利要求1的分離方法分離出的細胞在體內進行定向誘導分化的方案，其特徵在於以特定的細胞密度及注射體積進行移植。
3.按權利要求2的方法將分離出的細胞在體內進行定向誘導分化的方案，其特徵在於注射方式為視網膜下注射。
4.按權利要求3的方法將分離出的細胞在體內進行定向誘導分化的方案，其特徵在於使骨髓間充質幹細胞在原位分化為視網膜結構(包括視錐、視杆細胞、雙極細胞及節細胞)。
全文摘要
本發明為大鼠骨髓MSCs體內移植定向分化為視網膜結構的方法。本發明的目的是提供一種將骨髓間充質幹細胞移植於視網膜下並在原位分化為視網膜結構的方法。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案分離出的大鼠骨髓間充質幹細胞在體內進行定向誘導分化的方案，其特徵在於利用特定的細胞密度和注射方式使骨髓間充質幹細胞在原位分化為視網膜結構(包括視網膜色素上皮細胞、視錐、視杆細胞、雙極細胞及節細胞)。本發明提供了神經細胞缺失後的補充來源，為臨床研製視網膜損傷修復供體奠定了基礎。
文檔編號A61F2/14GK1611597SQ20031010339
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月31日 優先權日2003年10月31日
發明者裴雪濤, 張 傑, 單清, 錢煥文, 馬萍 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所