液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品的製作方法
2023-09-22 23:49:20 3
專利名稱：液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品。
背景技術：
近期生物科學技術的不斷進展，已證實真菌多糖成分參與人體重要的生命活動，具有免疫調節、增強抗體形成等生物活性作用，深受醫藥和營養學界的重視。
目前已知的食、藥用菌源中，羊肚菌屬菌種(Morchella sp)是天然珍稀菌，是食、藥用菌中的精品，不但具有較高營養價值而且具有多種藥理活性作用，經濟價值較高。但由於至今未能將該菌馴化為人工培植菌，只在近年來有少量培植成功的報導，因此，僅靠有限的天然出品不能滿足需要量。有研究資料證實，發酵菌絲體和栽培子實體有效成分和藥理作用一致。本發明前期研究的「一種食用菌發酵飲料的製作方法」專利號85104712.2，「一種蘑菇營養液的製作方法」專利申請號92112908.4，已發現該品有免疫調節和抗腫瘤作用，並取得較好的社會經濟效益。
發明內容
本發明的目的在於，在上述兩項專利的基礎上，研製一種液體深層發酵製備羊肚菌的方法及開發羊肚菌營養液和羊肚菌多糖新品種，以彌補其天然出品的不足；完善羊肚菌菌絲體多糖的生物發酵、反滲透膜濃縮和超濾分離濃縮等新工藝技術，分離提純羊肚菌多糖有效成分。經理化和初步構型分析檢測，得出羊肚菌多糖為多糖和蛋白質複合物—MCSP(羊肚菌多糖)、MCS(脫游離蛋白質的羊肚菌多糖)、MCSC(柱層析純化的羊肚菌多糖)，經生物活性初篩試驗得出具有免疫調節和抑制腫瘤等活性作用，為食用真菌中的有效的生物活性成分。
本發明發酵工藝周期短，一個生產周期僅需一周時間，而小量培植方法約需要一年時間，使生產效率提高，且具有易於從發酵物中分離提純有效成分等優點。
羊肚菌製品毒性試驗(亞急性毒性試驗和亞慢性毒性試驗)結果得出MCSP小鼠口服最大耐受量(MTD)為20g/kg.b.w。根據急性毒性分級，受試物屬無毒物，羊肚菌製品食用安全可靠無毒副作用。
羊肚菌製品部分藥理試驗、保健試驗及臨床試驗，生物活性作用試驗結果得出羊肚菌多糖MCSP、MCS具有免疫調節作用，抑制腫瘤、減緩癌症放、化療毒副作用、抗過敏、調節心血管功能等多種生物活性。因而可按照不同需求向藥品發展或應用於保健食品。
本發明的特徵在於製備羊肚菌的方法為選用食、藥用菌羊肚菌Morchella sp菌種(編號EF-11)，該菌種保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號EF-11，保藏中心登記入冊編號CGMCC NO.0019。
用4％的大麥、2％葡萄糖為培養液，在搖床震蕩400～500次/分鐘，培養72～96小時為菌種液；選10％大麥芽、5％大豆為發酵基質，在發酵基質中強化無機鋅，添加硫酸鋅0.9～1.2％，強化無機硒，添加亞酸納0.6～0.9％，經過強化微量元素，且經生物發酵作用後，無機元素轉換為具有生物活性作用的有機鋅和有機硒。通氣培養48～72小時，通過生物發酵期，得到發酵羊肚菌；發酵終止指標pH值為4.0～5.3，折光糖度為3.0～3.5，菌絲體得率為0.6％～0.8％(乾重)；將菌絲體用水提取，浸提比1∶2，浸提溫度85℃，浸提時間3小時，得到羊肚菌提取液；對羊肚菌提取液和發酵液的混合液採用反滲透膜濃縮法或真空濃縮法達到濃縮4倍及折光糖度11.5％。
羊肚菌系列製品—羊肚菌營養液工藝流程，菌絲體浸提工藝參數∶浸提比1∶2(W/V)，溫度90～95℃，時間3小時；採用反滲透膜濃縮或真空濃縮方法處理髮酵液；發酵液pH值6～7，折光糖度3％左右，液體透明清涼無混濁現象，膜設備操壓力40kg/cm2，在室溫下濃縮操作；羊肚菌營養液含有菌多糖；有機鋅；有機硒；有機鍺；核糖核酸等生物活性成分，具有營養保健作用。
羊肚菌系列製品—羊肚菌多糖MCSP(羊肚菌糖蛋白)、MCS(羊肚菌多糖)、MCSC(羊肚菌多糖『純化』)的分離提純工藝流程，發酵20～25℃、72～96小時；菌絲體浸提90～95℃水提、3小時、浸提3次；乙醇沉澱95％，乙醇1∶3(V∶V)，透析流動水24小時，冷凍乾燥溫度-55℃(約)、壓力8.0×10-1～2.2×10-2mbar，時間42～45小時。羊肚菌多糖MCSP提取率為5.69～5.7g/10L(菌絲體浸提液混合液)，MCS平均0.45g/10L混合液。
羊肚菌多糖分離提純方法用Sephadex G 100層析柱純化的多糖MCSP11，在紫外分光光度儀320nm下測吸光度，收集A值一致的液體，用流動水透析後冷凍乾燥。
用醋酸纖維膜電泳測定羊肚菌多糖3種構型較為一致，為雜多糖結構；經液相色譜和凝膠色譜測定羊肚菌多糖MCSP平均相對分子量組分I為19萬，組分II為50萬，組分III為10萬。
混合液濃縮方法首先用反滲透膜濃縮至折光糖度15％，再經超濾分離濃縮，按濃縮液3倍量(W∶V)加入95％乙醇，用高速離心機分離多糖沉澱物。
將分離的多糖在低溫冷凍乾燥機內冷凍乾燥，溫度不超過-50℃，壓力8.0×10-1～2.2×10-2mbar。
羊肚菌多糖脫去游離蛋白質的方法，是將多糖分離物製成6％糖液，等量加入(V∶V)5％三氯醋酸溶液，分離蛋白5次後，再用氯仿正丁醇溶液脫蛋白5次後，分離出多糖液。
羊肚菌多糖經紅外光譜檢測該多糖為多糖和蛋白質複合物，其中多糖含量為64.026～95.621％，蛋白質含量為1.09％～3.32％，多糖由葡萄糖，甘露糖，果糖和海藻糖組成；蛋白質由天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，穀氨酸，甘氨酸，丙氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯病氨酸，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，r-氨基丁酸，頡氨酸16種胺基酸組成。
請參照附圖及實施例對本發明做進一步的闡述圖1為本發明深層發酵羊肚菌生產工藝流程圖；圖2為本發明羊肚菌營養液生產工藝流程圖；圖3為本發明羊肚菌多糖提取基料製備工藝流程圖；圖4為本發明羊肚菌糖蛋白MCSP製備工藝流程圖；圖5為本發明羊肚菌糖蛋白MCS製備工藝流程圖；圖6為本發明羊肚菌多糖MCSC製備工藝流程圖。
本發明是這樣實現的採用的原材料及設備為原材料麥芽汁、蜂蜜、豆粉、葡萄糖、黃豆、酶製劑、葡聚糖、透析袋；主要設備發酵罐、反滲透膜濃縮設備、小型膜分離設備(超濾)、低溫冷凍設備、瞬時滅菌機、高速離心機、電泳儀、無菌過濾機、提取罐、保溫罐、搖床、顯微鏡。
一.深層發酵羊肚菌工藝技術規程，見圖1。
1.菌種質量標準斜面菌種(EF-11)，在綜合PDA培養基斜面上，25℃培養72小時的EF-11菌種，呈灰白色絨毛狀，緊貼培養基生長，氣生菌絲甚少，菌絲呈白色鏡檢為多分支細胞，有分隔、多核、無鎖狀聯合。斜面菌種每隔5-6個月轉接一次，存放4℃冰箱。
2.I級菌種液，在W.S培養基上，25℃溫度下，400～500rpm旋轉振蕩培養72～96小時，菌絲大多數呈輻射狀團聚物，呈菌絲體狀，少數呈絲狀，布滿液體，檢驗為純菌，菌絲白色較原菌絲粗壯。
3.II級菌種液，在W.S培養基中，25℃溫度下，600rpm旋轉振蕩培養48～72小時，菌絲大多數呈輻射狀團聚物，呈菌絲體狀，少數呈絲狀，布滿液體，菌絲白色較I級菌絲粗壯。檢驗為純菌。
4.深層發酵條件發酵基質WS菌絲體生長發酵條件溫度在20-25℃時最好，PH值為6-7，發酵時間為48小時，當發酵終止時，折光糖度3.1％，PH值4.8左右菌絲體乾重0.7％左右。
5.主要工藝參數配料主要成分大麥芽30KG，蜂蜜19.8KG，豆粉5.4KG，總量600L殺菌配料用瞬時滅菌機135℃，3秒II級種子液2-5％接種量，無菌手續介入發酵罐發酵25℃，通氣量1∶0.5-1∶1.5，48～72小時
6.實施例
羊肚菌菌絲體和發酵液質量分析結果
二.羊肚菌(EF-11)營養液工藝技術規程，見圖2。
深層發酵羊肚菌，菌絲體和發酵液，都含有多糖、胺基酸、微量元素和維生素等營養物質，其中以菌絲體含量高於發酵液。由於菌絲細胞的細胞壁由幾丁質和纖維素聚合物組成，其中有效成分不易溶出，發酵液水分含量大，有效成分較低，為了提高有效成分含量，本發明對菌絲體草用機械粉碎和人水浸提方法，並對發酵液採用濃縮處理工藝。
羊肚菌菌絲體水浸提結果
菌絲體浸提工藝參數∶浸提比1∶2(W/V)，溫度90～95℃，時間3小時。
發酵液濃縮工藝採用反滲透膜濃縮或真空濃縮方法。
發酵液PH值6～7，折光糖度3％左右，液體透明清亮無混濁現象，膜設備操壓力40kg/cm2，在室溫下濃縮操作。經濃縮工藝處理前、後的液體有效成分中多糖、胺基酸等質量指標的含量見下表。
羊肚菌營養液實施例
羊肚菌營養液質量分析
三.羊肚菌多糖類物質的製作工藝1.羊肚菌發酵法製備多糖條件採用固體培養基代替液體基質選定發酵基質、PH值。用直徑9cm培養皿，取5mm2的羊肚菌菌絲體塊接種平板中心，置25℃培養箱培養，各重複三次，測定菌絲生長量，取平均值，確定PH值為6～7，溫度20～25℃。
液體培養基1.基本培養基PDA；2.PDA綜合培養基；3.W.S培養基(大麥芽4％，蜂蜜3.3％，豆粉1％，瓊脂2％)；4.G.P培養基(葡萄糖2％，蛋白腖1％，磷酸二氫鉀0.05％，酵母浸膏0.2％，瓊脂2％)。確定W.S為羊肚菌多糖製備培養基。
2.羊肚菌多糖提取基料的製備方法，見圖3。
3.羊肚菌多糖分離提純方法發酵以後，經粗濾處理的菌絲體洗滌後，經膠體磨研磨處理，置提取罐中，按鮮重加入3倍去離子水(W∶V)，在90℃下提取三次，第一次3小時，第二次3小時，第三次2小時，合併三次濾液過濾成清液。水提後，再加酶提取，加酶量0.5g/100g菌絲體(溼重)，60℃、2小時後過濾，濾液和水提取後的清液合併為混合提取液。再用反滲透膜濃縮6倍，再用超濾設備分離濃縮至透過液折光糖度在1％以下，濃縮液濃度在6％左右，將濃縮液加入3倍(W∶V)95％乙醇沉澱多糖，置4℃溫度10小時左右，用高速離心機分離下層多糖沉澱物，繼續用95％乙醇沉澱洗滌兩次，用去離子水溶解，調整PH至中性，置透析袋中，用去離子水透析48小時，取出，分裝安培瓶，低溫冷凍乾燥。
4.羊肚菌多糖脫去游離蛋白質處理方法用SeVag法對MCSP進行脫蛋白處理，由3.製成的乙醇沉澱物，配製成6％糖液(以折光糖計)，等量(V∶V)加入5％三氯醋酸正丁醇溶液(5％TCA)，置分液漏鬥充分振蕩分離，重複操作5次後，分離出糖液層，按1∶1加入氯仿正丁醇(5∶1)溶液，充分振蕩，重複5次，取出糖液。
5.羊肚菌多糖層析分離提純法層析柱高20×400mm吸附劑、矽膠、溶劑0.1％NaCl溶液將SephaDex G 100 1g加入30m10.1％NaCl溶液中製成混懸液，上柱洗脫液流速0.5ml/min，以分離的多糖MCS用無菌水溶化製成6％濃度上柱，上液流速0.5ml/min，在紫外分光光度儀320nm下測吸光度(A值)，收集液體，每管3.5ml，用α-萘酚硫酸顯色，測試為糖液後合併A值一致的液體，用流動水透析8小時後取出透析液分裝於安培冷凍乾燥。
6.醋酸纖維膜電泳法用DF-D電泳儀測定MCS、MCSP、MCSC電泳圖譜，泳動條件恆壓恆流，電壓250～300V，電流3～5mA，醋酸纖維膜2cm×8cm，硼砂緩衝液，甲苯胺藍染色，漂洗液採用90％乙醇。
7.糖含量分析液相色譜法，α-萘酚硫酸顯色法.
8.胺基酸組成分析稱取20.1mgMCSP溶於5ml 6N Hcl中，110℃封管水解24小時，水解液用濾紙過濾，冷幹濃縮，用胺基酸分析儀分析。
羊肚菌多糖類物質(MCSP、MCS、MCSC)製備研究羊肚菌液體培養生長條件以豆粉為主要氮源的W.S培養基，以蜂蜜和麥芽汁為碳源，PH值6.6，溫度20～25℃為最佳生長條件。
羊肚菌多糖物質主要存在於菌絲細胞中，適宜發酵時間為72小時。
羊肚菌菌絲體多糖的組成
羊肚菌多糖分離提純工藝技術指標提純分離條件用去離子水提取多糖最佳條件溫度90～95℃，PH7.0，浸提比W/V1∶30，90分鐘，在此條件下提取的菌絲體中的大部分多糖物質，為水溶性多糖；加入3倍95％乙醇分離提取多糖；多糖提純物經冷凍處理後，置冷凍乾燥機內進行冷凍乾燥，平均42小時達到乾燥(恆重)，乾燥後每安培平均重量為32mg。
羊肚菌多糖MCSP工藝流程，見圖4。
工藝參數發酵27℃，72小時；浸提按菌絲體鮮重加入3倍去離子水(W∶V)，在90～95℃下3小時後過濾，重複三次，過濾後合併濾液，取菌絲體殘渣加3倍去離子水(W∶V)，60℃、2小時後過濾，濾液與水提液合併；反滲透膜濃縮混合液濃縮至15％；超濾超濾膜分子量1～10萬、5萬以上、10萬以上，超濾至透過液1％(折光糖度計)；乙醇沉澱將濃縮液加入3倍(W∶V)95％乙醇沉澱，置4℃下過夜，高速離心分離下層沉澱物；透析流動水24小時，透析袋直徑49mm，截流分子量8000～10000；
冷凍乾燥溫度-55℃，壓力8.0×10-1～2.2×10-2mbar。
羊肚菌糖蛋白MCS製備工藝流程，見圖5。
工藝參數脫蛋白處理經乙醇沉澱後的多糖製成6％多糖液，等量加入5％三氯醋酸正丁醇溶液，置分液漏鬥中振蕩分離，重複5次後，分離出糖液層，按1∶1(V∶V)加入氯仿正丁醇溶液(5∶1)，重複3～5次，分離出糖液層。
羊肚菌多糖MCSC製備工藝流程，見圖6。
工藝參數發酵以後，經粗濾處理的菌絲體洗滌後，經膠體磨研磨處理，置提取罐中，按鮮重加入3倍去離子水(W∶V)，在90℃下提取三次，第一次3小時，第二次3小時，第三次2小時，合併三次濾液過濾成清液。水提後，再加酶提取，加酶量0.5g/100g菌絲體(溼重)，60℃、2小時後過濾，濾液和水提取後的清液合併為混合提取液。再用反滲透膜濃縮6倍，再用超濾設備分離濃縮至透過液折光糖度在1％以下，濃縮液濃度在6％左右，將濃縮液加入3倍(W∶V)95％乙醇沉澱多糖，置4℃，10小時左右，用高速離心機分離下層多糖沉澱物，繼續用95％乙醇沉澱洗滌兩次，用去離子水溶解，調整PH至中性，置透析袋中，用去離子水透析48小時，取出，分裝安培瓶，低溫冷凍乾燥。
上柱取吸附劑Sephadex G 100 1g加入30ml 0.1％NaCL溶液，溶解後裝入層析柱(20×40mm)，洗脫液流速0.5ml/min；收集液在紫外分光光度儀320nm下測吸光度(A值)，用α-萘酚硫酸法測糖液，合併A值一致的收集液進行透析。
羊肚菌多糖製備試驗結果
羊肚菌多糖特性和鑑定分析。
1.特性物理性質MCSP羊肚菌糖蛋白、MCS羊肚菌多糖、MCSC羊肚菌多糖(純化)均為灰白色粉末，較難溶於冷水，易溶於熱水、生理鹽水、稀酸、稀鹼溶液，易被高濃度醇和酮等有機溶劑析出。
化學定性反應MCSP羊肚菌糖蛋白、MCS羊肚菌多糖、MCSC羊肚菌多糖(純化)與硫酸蒽酮液和硫酸苯酚液均呈陽性反應。
2.鑑別純度羊肚菌菌絲體多糖經水浸提、乙醇沉澱、透析、冷乾等工藝程序，獲得多糖MCSP，純度為98.276～58.186％，經層析柱純化後純度為67.664～73.964％；MCS純度為95.621～64.804％。
3.構型分析醋酸纖維膜電泳檢測所分離的羊肚菌多糖MCSP、MCS脫去游離蛋白質和純化羊肚菌多糖MCSC(Sephadex G100層析柱純化)三種多糖類物質的醋酸纖維膜電泳圖譜基本一致，可以說明三種物質構型較一致。
紫外光譜檢測經紫外光譜檢測的MCS、MCSP的吸收峰均為280nm。
液相色譜測定糖和蛋白質含量MCSP中多糖含量平均為73.496，蛋白質含量平均為2.846；MCS中多糖含量平均為75.99％，蛋白質含量平均為2.51％；MCSC中多糖含量為67.664～73.964g/100g。
相對分離量測定經液相色譜和凝膠色譜測定羊肚菌多糖MCSP平均相對分離量組分19～50萬。
MCSP樣品經加酸水解後用胺基酸分析儀測定，檢測結果見下表
本發明分離提純的羊肚菌多糖MCSP、MCS、MCSC三種物質，經紫外光譜檢測含有蛋白質，紅外光譜測出均含有多糖和蛋白質，醋酸纖維膜電泳測定三種多糖構型較為一致，均為多糖和蛋白質複合物，多糖含量平均為73.496-75.99％，蛋白質含量平均為2.51-2.846％。經層析柱純化多糖MCSC多糖含量為67.664-73.964g/100g。MCSP與MCS比較，前者多糖含量較後者少，而蛋白質含量稍高。多糖由葡萄糖、甘露糖、果糖、海藻糖組成；構型為雜多糖；蛋白質由16種胺基酸組成。
羊肚菌多糖(MCSP、MCS、MCSC)生物活性試驗結果和分析1.免疫調節作用具有明顯的免疫增強作用。
從免疫調節作用測試結果(見下表)得出多糖MCSP(超濾膜分子量1-10萬)的淋巴細胞增殖率或抑制率最高為56.3％，其次為多糖MCSP(超濾膜分子量10萬以上)柱層析為MCSP44.2％，其他依次排列為多糖MCSP(超濾膜分離量5萬以上)為40.4％，多糖MCS(超濾膜分離量5萬以上)為39.8％，多糖柱層析為38.4％。MCSP、MCS、MCSC批次免疫調節活性檢測均顯一定藥理活性。
羊肚菌多糖免疫調節作用測試結果
2.羊肚菌多糖具有免疫增強和抑制作用的雙向調節作用由上表得出羊肚菌多糖除具有較明顯的免疫增強作用以外，在MCSP、MCSP和MCS組分具有明顯的免疫抑制作用，說明本品具有免疫雙向調節作用。
3.脫去游離蛋白質對羊肚菌多糖免疫調節作用的影響經脫蛋白處理後的羊肚菌多糖與相應的未脫蛋白的組分相比，大糞自量組分的免疫增強和抑制作用稍有提高，小分子量組分的免疫增強有所降低。
4.免疫調節作用與分子量的關係免疫調節作用以MCSP最顯著，初步說明小分子量羊肚菌多糖免疫增強作用較好，而大分子量羊肚菌多糖免疫抑制作用較好。
5.免疫調節作用與分離純度的關係從柱純化與未經純化的樣品相比，二者免疫活性作用無明顯區別。
羊肚菌多糖抗腫瘤藥效試驗結果1.羊肚菌多糖(MCSP)對肝癌H22經口服或腹腔注射給藥均有明顯抑瘤作用。口服給藥25mg/kg組的瘤重抑制率為31.9％～37.6％，50mg/kg組為31.7～36.2％。腹腔注射給藥10mg/kg組的瘤重抑制率為31.0～34.6％，20mg/kg組為36.7～40.8％，羊肚菌糖蛋白按同樣方法經腹腔注射給藥抑制率為35.8～37.8％，亦有明顯抑瘤作用。
2.羊肚菌多糖MCSP對大白鼠瓦克癌W256抑瘤試驗結果表明，經口服和腹腔注射給藥均有明顯作用，口服給藥25mg/kg組的瘤重抑制率為13.2～30.1％，50mg/kg組為36.3～39.6％，腹腔注射給藥10mg/kg組的瘤重抑制率為25.8～35.8％，20mg/kg組的為35.6～39.4％，可以看出口服和腹腔給藥效果相差不大，兩種瘤種的抑制率區別不大，與分子量大小關係也不明顯。
3.羊肚菌多糖MCSP的受體結合實驗結果得出MCSP抑制率為51.35％，多糖MCS的抑制率為52.97％，說明本品有抑制體內5-脛色胺、多巴胺2及其受體的相互作用，進而影響相關的生理和病理作用，初步說明MCSP、MCS與精神、神經和心血管方面的作用有關。
4.肥大細胞脫顆粒試驗(抗過敏)，MCSPII-1脫顆粒抑制率為61.9％，MCSPIII脫顆粒抑制率為43.7％，具有抗過敏作用。
5.毒性試驗-羊肚菌多糖(MCS、MCSP混合型)小鼠口服最大耐受量(MTD)測定。羊肚菌多糖毒性較低，一次灌胃給藥測不出LD50，故測定一日內兩次給藥的口服最大耐受量，得出最大耐受量為20mg/kg。
本發明羊肚菌多糖經鑑定為多糖和蛋白質複合物，是一種新的大分子物質，其生理活性作用優於多糖。羊肚菌多糖3組分MCSP、MCS、MCSC經生物試驗檢測結果，均具有免疫調節作用，抑制腫瘤，抗過敏，調節心血管功能等多種生物活性作用。本發明得出的製品純度較高，分離提純工藝、設備簡單，提取率高，成本費用低。經過純化和未經純化的製品活性作用都較明顯。是一種生產開發前景較好的產品。另外經超濾處理的透過液中含有小分子糖類及其他可溶性物質，可作為添加劑綜合利用。
本發明通過完善菌絲體生物發酵技術、水溶性提取分離、超濾分離濃縮、提純等技術對該珍稀菌種多糖類物質進行研究開發並製成產品，為開發藥用真菌多糖類製品增添了新品種。
權利要求
1.一種液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，製備羊肚菌的方法為選用食、藥用菌羊肚菌Morchella sp為菌種(編號EF-11)，用4％的大麥、2％葡萄糖為培養液，在搖床震蕩40C～500次/分鐘，培養72～96小時為菌種液；選10％大麥芽、5％大豆為發酵基質，在發酵基質中強化無機鋅，添加硫酸鋅0.9～1.2％，強化無機硒，添加亞酸納0.6～0.9％，通氣培養48～72小時，通過生物發酵期，得到發酵羊肚菌；發酵終止指標PH值為4.0～5.3，折光糖度為3.0～3.5，菌絲體得率為0.6％～0.8％(乾重)；將菌絲體用水提取，浸提比1∶2，浸提溫度85℃，浸提時間3小時，得到羊肚菌提取液；對羊肚菌提取液和發酵液的混合液採用反滲透膜濃縮法或真空濃縮法達到濃縮4倍及折光糖度11.5％；羊肚菌系列製品—羊肚菌營養液工藝流程，菌絲體浸提工藝參數∶浸提比1∶2(W/V)，溫度90～95℃，時間3小時；採用反滲透膜濃縮或真空濃縮方法處理髮酵液；發酵液PH值6～7，折光糖度3％左右，液體透明清涼無混濁現象，膜設備操壓力40kg/cm2，在室溫下濃縮操作；羊肚菌系列製品—羊肚菌多糖MCSP(羊肚菌糖蛋白)、MCS(羊肚菌多糖)、MCSC(羊肚菌多糖『純化』)的分離提純工藝流程，發酵20～25℃、72～96小時；菌絲體浸提90～95℃水提、3小時、浸提3次；乙醇沉澱95％，乙醇1∶3(V∶V)，透析流動水24小時，冷凍乾燥溫度-55℃、壓力8.0×10-1～2.2×10-2mbar，時間42～45小時。羊肚菌多糖MCSP提取率為5.69～5.7g/10L(菌絲體浸提液混合液)，MCS平均0.45g/10L混合液。
2.根據權利要求1所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，經過強化微量元素，且經生物發酵作用後，無機元素轉換為具有生物活性作用的有機鋅和有機硒。
3.根據權利要求1、2所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，所說的羊肚菌營養液含有菌多糖；有機鋅；有機硒；有機鍺；核糖核酸等生物活性成分，具有營養保健作用。
4.根據權利要求1～3所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，所說的羊肚菌多糖分離提純方法用Sephadex G 100層析柱純化的多糖MCSP11，在紫外分光光度儀320nm下測吸光度，收集A值一致的液體，用流動水透析後冷凍乾燥。
5.根據權利要求1～4所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，用醋酸纖維膜電泳測定羊肚菌多糖3種構型較為一致，為雜多糖結構；經液相色譜和凝膠色譜測定羊肚菌多糖MCSP平均相對分子量組分I為19萬，組分II為50萬，組分III為10萬。
6.根據權利要求1～5所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，混合液濃縮方法首先用反滲透膜濃縮至折光糖度15％，再經超濾分離濃縮，按濃縮液3倍量(W∶V)加入95％乙醇，用高速離心機分離多糖沉澱物。
7.根據權利要求1～6所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，將分離的多糖在低溫冷凍幹機內冷凍乾燥，溫度不超過-50度℃，壓力8.0×10-～2.2×10-mbar。
8.根據權利要求1～7所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，羊肚菌多糖脫去游離蛋白質的方法，是將多糖分離物製成6％糖液，等量加入(V∶V)5％三氯醋酸溶液，分離蛋白5次後，再用氯仿正丁醇溶液脫蛋白5次後，分離出多糖液。
9.根據權利要求1～8所述的液體深層發酵製備羊肚菌的方法及其產品，其特徵在於，羊肚菌多糖經紅外光譜檢測該多糖為多糖和蛋白質複合物，其中多糖含量為64.026～95.621％，蛋白質含量為1.09％～3.32％，多糖由葡萄糖，甘露糖，果糖和海藻糖組成；蛋白質由天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，穀氨酸，甘氨酸，丙氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯病氨酸，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，r-氨基丁酸，頡氨酸16種胺基酸組成。
全文摘要
本發明涉及一種液體深層發酵製備羊肚菌的方法及開發羊肚菌營養液和羊肚菌多糖新品種；選用食、藥用菌羊肚菌Morchella sp為菌種(編號EF－11)，完善羊肚菌菌絲體多糖的生物發酵、反滲透膜濃縮和超濾分離濃縮等新工藝技術，分離提純羊肚菌多糖有效成分。經理化和初步構型分析檢測，得出羊肚菌多糖為多糖和蛋白質複合物MCSP(羊肚菌多糖)、MCS(脫游離蛋白質的羊肚菌多糖)、MCSC(柱層析純化的羊肚菌多糖)，經生物活性初篩試驗得出該品具有免疫調節、抑制腫瘤、抗過敏、調節心血管功能等多種生物活性。食用安全可靠無毒副作用，因而可按照不同需求向藥品發展或應用於保健食品。
文檔編號C12P19/00GK1507772SQ02156450
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月16日 優先權日2002年12月16日
發明者宋淑敏, 王熊, 郭宏, 賈建會, 呂曉蓮, 郭洪源, 曹煒 申請人:北京市食品研究所