金華豬成纖維細胞系的建立及其培養方法

2023-09-22 08:45:15

專利名稱：金華豬成纖維細胞系的建立及其培養方法
技術領域：
本發明涉及細胞生物學領域，尤其涉及一種金華豬成纖維細胞系的建立及其培養方法。
背景技術：
畜禽遺傳資源保護問題最早於50年代在美國提出。自1972年斯德哥爾摩人類環境會議以後，引起聯合國糧農組織(FAO)與環境規劃署(UNEP)的重視，他們聯手在全球開展了家養動物遺傳資源的保護行動，至今前後進行了幾十年的工作，取得了明顯的成效。我國從開始就參加了他們組織的一系列計劃與行動。但目前中國的畜禽遺傳資源保護形勢並不樂觀。在80年代進行的普查中，估計共有品種600個，其中本國地方品種有385個。有 10個地方品種已經滅絕，8個品種瀕臨滅絕。20個品種的有效群體含量急劇下降，佔調查品種數364個的13%。又據中國農科院畜牧所與全國畜牧獸醫總站種畜禽處在2000年完成的 「畜禽遺傳資源多樣性補充調查」的資料稱，在調查的17個省區的331個品種中，處於瀕危與將要滅絕的品種有59個，佔調查總數的18%另有7個品種已經滅絕，例如雲南的大普吉豬，浙江的蕭山雞、文山鵝、思茅鵝、草海鵝等。我國畜禽遺傳資源豐富，它們在畜牧生產和新遺傳資源形成過程中發揮了非常重要的作用。近20年來，為滿足人民對肉、蛋、奶、蜜等畜產品的需求，我國相繼引進了大量的外來高產品種對低產地方品種進行改良，使畜牧生產水平大幅提高。但改良的消極後果使某些地方品種逐漸被培育品種或雜交種所取代，致使具有豐富多樣性的地方品種群體數量下降或消失。最近研究表明，50%以上地方畜禽品種的群體數量處於不同程度的下降，其中一定數量處於瀕危狀態。國內外多年來對保種工作的實踐與經驗，告訴我們要有效保護地方優良的畜禽資源關鍵是要採用經濟合理的方法，即使得畜禽資源得到很好的保護又要節約成本。這裡應用細胞生物學方法建立畜禽的細胞系就是一個有效經濟的方法。在建立細胞系的過程中同時對詞細胞的基本生物學特性進行研究，為以後進一步的研究提供技術與理論支持。金華豬是中國著名的地方品種。又稱兩頭烏，產於浙江東陽、義烏、金華等地。據金華縣古方出土的西晉(公元沈5-316年)陶豬和陶豬圈考證，早在1600年前這一帶的養豬業已相當發達。相傳在古代就有「家鄉肉」的醃製品，爾後演變成火腿。隨著火腿遠銷，金華豬也隨之揚名。金華豬體型中等，耳下垂，頸短粗，背微凹，臀傾斜、蹄質堅實。全身被毛中間白，頭頸、臀尾黑。以早熟易肥、皮薄骨細、肉質優良、適於醃製火腿著稱。7 8月齡、體重70 75千克時為屠宰適期，胴體瘦肉率40% 45%。目前，由於外來豬種的大量引進和一些社會因素的幹擾使得金華豬的種群數量持續減少，肉品質持續下降，應該採取有效措施加強金華豬的保種。細胞生物學研究一直都很受人們的重視，隨著科學研究的發展，人們對細胞的研究也越來越深入，細胞生物學的發展為其它生命科學的發展提供了研究基礎，也可以說細胞生物學是其它生命學科發展的前提。這也從另一個側面反映出畜禽資源細胞保存的重要性。這些種質資源一旦失去就無法再進行研究與應用，所以很多國家目前都致力於種質資源的保存。我國保護物種多樣性方面也面臨著許多問題需要解決。哺乳動物核移植技術的發展也日趨完善，細胞核移植技術是將供體細胞核移入出去核的卵母細胞中，使後者不經過精子穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、分裂並發育成新個體，使得核供體的基因得到完全複製。它在動物育種、製備轉基因動物、基因治療及器官移植等方面具有重大的作用，而成纖維細胞是核移植中的一種理想的供體細胞。金華豬作為一個優良的地方豬種，它在育種方面具有巨大的潛力，而且豬也是一種人類器官的比較優良的提供者，因而金華豬成纖維細胞的建系具有重要的科研與生產價值。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種金華豬成纖維細胞系的建立及其
培養方法。為實現上述目的，本發明採取以下技術方案 金華豬成纖維細胞系的培養方法的步驟如下
1)初代培養快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗；Γ4次； 用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗；Γ4次，然後剪成0. 5^1. Omm3的組織塊；將組織塊移入培養瓶並塗布均勻，倒置培養瓶，放入37 39°C，體積百分數為5%C02的培養箱中培養3 4h ；組織塊完全貼壁後加入IOml的培養液，培養液成分DMEM+10%胎牛血清繼續培養8 12個小時；
2)傳代培養倒出步驟1)過程中的培養液，六用PBS清洗2 3次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；消化後的細胞平均分成三瓶，放入37°C，5%C02的培養箱中培養至凍存前對 2他；
3)細胞凍存
(1)準備凍存前對 2他棄除原有培養液並更換新的培養液l(Tl5ml，繼續培養對 2他；
(2)倒出培養瓶中的培養液，用PBS清洗2 3次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；
(3)用紅細胞計數板計數細胞凍存前的總數；
(4)IOOOrpm離心細胞5min，去上清，加入廣1. 5ml的凍存液，輕輕的吹打細胞使其懸浮；細胞凍存液成分體積百分數為50%胎牛血清、體積百分數為40%DMEM及體積百分數為 10%DMS0 ；
(5)把細胞移到凍存管中，用封口膜封口；
(6)將裝有細胞的凍存管轉移到4°C冰箱中放置廣2h，然後轉入-20°C冰箱中放置 2 3h，再移入到-70°C的冰箱中過夜，最後快速將其移入到液氮中長期保存，並做好相應的記錄。所述的胰酶消化的步驟為向培養瓶中加入37 39°C預熱的質量百分數為m的胰蛋白酶1. 5lml，在顯微鏡下觀察體積百分數為9(Γ95%的細胞變成圓形後將胰蛋白酶倒掉，用手輕磕細胞培養瓶使細胞脫落，加入l(Tl5ml新的培養液。所述的凍存細胞進行復甦步驟為將凍存管從液氮中取出後放入37 39°C水浴中，晃動廣anin後，把細胞移入到加入了 l(Tl5ml全培養基離心管中，lOOOr/min離心5min後去上清，加入2ml的培養基，將細胞輕輕吹打均勻後將細胞移入有培養液的培養瓶，放置於37°C，5%0)2的培養箱中培養。本發明對於貼壁培養方法及培養基培養液成分的改進調整，本發明培養得到的成纖維細胞系不含上皮細胞等雜細胞，細胞純度高；凍存細胞質量穩定，細胞凍存復甦後活率可達91. 8^97. 5%，傳代後細胞生長穩定，適合大規模培養。對於培養基及培養方法的改進可以大幅度的降低培養成本。本發明涉及的金華豬成纖維細胞可以用於製作轉基因豬的核移植供體；可以為醫學及分子生物學研究提供原材料；可以作為疫苗生產的主要原料及肝細胞培養的飼養層。農業上可以豐富和改良地方豬種，是我國地方優良豬種的有效保護手段。由於金華豬種質資源匱乏，使得對於金華豬在各個領域內的研究成為空白。而本發明所述的高細胞活率及高純度的金華豬成纖維細胞系可以為以後的研究提供材料，為以後的科學研究提供便利。


圖1為金華豬原代成纖維細胞顯微鏡下圖； 圖2為金華豬傳代前細胞顯微鏡下圖3為金華豬繼代I細胞顯微鏡下圖； 圖4為金華豬繼代II細胞顯微鏡下圖； 圖5(a)為被大腸桿菌汙染的細胞圖； 圖5(b)為被黴菌汙染的細胞圖； 圖6(a)為支原體汙染陽性的細胞對照圖； 圖6(b)為支原體汙染陰性的細胞對照圖； 圖7為金華豬成纖維細胞的生長曲線圖； 圖8為金華豬成纖維細胞的核型分析圖9圖中左圖為蘋果酸脫氫同工酶電泳圖，右圖為乳酸脫氫同工酶電泳圖； 圖10為外源基因在金華豬成纖維細胞中24h表達圖(pEGFP-N3螢光蛋白轉染質粒)； 圖11為金華豬成纖維細胞復甦後細胞凋亡的檢測。
具體實施例方式金華豬成纖維細胞系的培養方法的步驟如下
1)初代培養快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗；Γ4次； 用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗3、次，然後剪成0. 5^1. Omm3的組織塊；將組織塊移入培養瓶並塗布均勻，倒置培養瓶，放入37°C，體積百分數為5%ω2的培養箱中培養3 4h ；組織塊完全貼壁後加入IOml的培養液，培養液成分DMEM+10%胎牛血清繼續培養8 12個小時；
2)傳代培養倒出步驟1)過程中的培養液，六用PBS清洗3、次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；消化後的細胞平均分成三瓶，放入37°C，5%C02的培養箱中培養至凍存前對 2他；
3)細胞凍存
(1)準備凍存前對 2他棄除原有培養液並更換新的培養液l(Tl5ml，繼續培養對 2他；
5(2)倒出培養瓶中的培養液，用PBS清洗3、次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；
(3)用紅細胞計數板計數細胞凍存前的總數；
(4)IOOOrpm離心細胞5min，去上清，加入廣1. 5ml的凍存液，輕輕的吹打細胞使其懸浮；細胞凍存液成分體積百分數為50%胎牛血清、體積百分數為40%DMEM及體積百分數為 10%DMS0 ；
(5)把細胞移到凍存管中，用封口膜封口；
(6)將裝有細胞的凍存管轉移到4°C冰箱中放置廣2h，然後轉入-20°C冰箱中放置 2 3h，再移入到-70°C的冰箱中過夜，最後快速將其移入到液氮中長期保存，並做好相應的記錄。所述的胰酶消化的步驟為向培養瓶中加入37 39°C預熱的質量百分數為洲的胰蛋白酶anl，在顯微鏡下觀察體積百分數為90、5%的細胞變成圓形後將胰蛋白酶倒掉，用手輕磕細胞培養瓶使細胞脫落，加入l(Tl5ml新的培養液。所述的凍存細胞進行復甦步驟為將凍存管從液氮中取出後放入37 39°C水浴中，晃動Ilmin後，把細胞移入到加入了 l(Tl5ml全培養基離心管中，1000r/min離心5min 後去上清，加入2ml的培養基，將細胞輕輕吹打均勻後將細胞移入有培養液的培養瓶，放置於37°C，5%0)2的培養箱中培養。下面結合附圖及實施方式對本發明做進一步說明，以使公眾對發明內容有整體和充分的了解。實施例中所用的主要儀器及試劑來源 金華豬胚胎來源浙江金華嘉華種豬場 (一)主要儀器設備
370C 5% C02 培養箱(德國 Heraeus)
PH030A型培養箱(上海)
DHG-9203A型電熱恆溫鼓風乾燥箱(上海)
DL-CJ-2N高性能無菌試驗臺(哈東聯)
YX0-LS-50SI立式高壓滅菌鍋(上海)
IX-71倒置相差顯微鏡(日本Olympus)
雷射掃描共聚焦顯微鏡(日本尼康)
CX31生物顯微鏡(日本Olympus)
電熱恆溫水浴鍋(北京)
TDL-40B水平離心機(上海)
蒸餾水器(上海)
頗爾超純水器(德國1^11)
電動移液器(德國)
-70°C低溫冰箱(美國)
液氮貯存器(四川)
血球計數板(北京)
96孔培養板(Corning)24孔培養板(Corning)
DYY — 111型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠) 水平電泳槽(北京六一儀器廠) 垂直電泳槽(北京六一儀器) (二)主要試劑
1、細胞培養試劑
DMEM培養基(invitrogen)、胎牛血清(thermO)、0. 20%胰蛋白酶溶液(量取0. 2g胰蛋白酶，溶於 IOOml 水中，0. 22Mm 濾膜過濾)、PBS (稱取 NaCl，8. 0g、Na2HPO4 · 12H20，2. 89g、 KC1，0. 2g、KH2PO4,0.2g加適量超純水使其溶解後，用1000ml容量瓶定容。調節pH值7. 2 左右，高壓滅菌30min)
2、染色體標本製備試劑及配製
0. 20%胰蛋白酶溶液(量取0. 2g胰蛋白酶，溶於IOOml水中，0. 22Mm濾膜過濾)、DMEM 完全培養基(invitrogen), PBS,秋水仙素(SIGMA)，吉姆薩(AMRESC0)
(1)秋水仙素配製秋水仙素10mg，PBS10ml，抽濾，此為原液。工作液濃度為100 yg/ml，即取原液1 ml溶於9ml三蒸水中，原液與工作液均保存於4°C ；
(2)吉姆薩原液的配製量取甘油3:3ml;甲醇33ml。將吉姆薩粉0.5g放入研缽中， 先加入少量甘油，研磨至無顆粒為止，然後再將全部甘油倒入，放56°C溫箱中池後，加入甲醇，將配製好的染液密封保存棕色瓶內(最好於0 4°C保存)；
吉姆薩工作液的配製吉姆薩原液1ml，磷酸緩衝液9ml (現用現配)；
(3)磷酸緩衝液的配製1/15mol/L Na2HP04 12H20 :2. 39g溶於100ml雙蒸水中； 1/15 mol/L KH2P04 :0. 907g 溶於 100ml 雙蒸水中。取 1/15 mol/L Na2HP04 12H20
液80ml，1/15 mol/L KH2P04液20ml混合即為ρΗ7· 38的磷酸緩衝液。(4)固定液冰醋酸與甲醇以1 3的比例(現用現配)； (5)低滲溶液(0. 5%KC1溶液)0. 5gKC溶於IOOrnl三蒸水中。3、同工酶所用試劑及配製
EDTA (乙二胺四乙酸)、Tris (PR0MEGA)、Acr (丙烯醯胺)、甘氨酸(Clycine) Triton (曲拉通)X-100、TEMED (四甲基乙二胺)、PMS (吩嗪硫酸甲脂，Phenazine Methosulfate), NAD (氧化性輔酶 I)、MTT (噻唑蘭，Thiazolyl Blue)、Bis (甲叉雙丙烯醯胺)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate, AP)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、乳酸鈉
(1)蛋白抽提液 JritonX-100 0. 9%NaCl 溶液=1 15 (ν/ν)，ρΗ7· 1，含有 0. 6mmol/L 的EDTA，貯於4°C。(2)分離膠儲液配製
0. 8%配製稱14g Acr和0. 4g Bis，加蒸餾水定容至50ml，過濾，裝到棕色瓶，4°C避光保存。②0. 6M Tris - HCI (pH8. 9) /TEMED 配製稱 7. 3g Tris-Base，溶於 50ml 的蒸餾水中，用IN HCI調pH值至8. 9，加0.細1 TEMED，定容到100ml，過濾，4°C避光保存。③1%AP的配製稱l.Og AP，溶於50ml的蒸餾水中，定容到100ml，過濾，裝到棕色憑，4°C避光保存。(3)濃縮膠儲液配製①38%Acr 2% Bis配製稱30g Acr和2g Bis，加蒸餾水定容至100ml，過濾， 裝到棕色瓶，4°C避光保存；
②0. 124M Tris-HCI (pH6. 7)配製稱 1. 5g Tris-Base，溶於 50ml 的蒸餾水中，用 HCI調pH值至6. 7，定容到100ml，過濾，4°C避光保存；
③10%AP的配製稱0.5g AP，定容到5ml，過濾，裝到棕色憑，4°C避光保存。④TEMED原溶液分裝少量TEMED原液於棕色瓶中，4°C避光保存。(4)電極緩衝液配製稱3. Ig Tris-Base和l.Og Gly，溶於400ml的水中，用 IN
HCI調pH值至8. 7，定容到IOOOml0(5)制膠
①7.5%分離膠(12ml)
PH8. 9 Tris — HCl5ml
30%丙烯醯胺3ml
1%TEMED0.9ml
雙蒸水6. 51ml
10%AP0.09ml
②3%濃縮膠(細1)
PH6. 7Tris — HCl 0.5ml 30%丙烯酞胺0. 4ml
1%TEMED0. 3ml
雙蒸水2. 74ml
10%AP0.06ml
(7)同工酶顯色劑的配置
0.05M PH8.0 Tris — HCl 稱0.61g Tris-Base，溶於 50ml 的蒸溜水中，用 IN HCI 調 PH 8.0，定容到100ml,過濾，4°C避光保存。
①MDH顯色劑
NAD (氧化型輔酶I) 15mg NBT8mg
TMSImg
0. 05M PH8. 0 Tris — HCl 30ml ②LDH顯色劑
5M乳酸鈉6ml
NAD20mg
NBT15mg
PMS2mg
(6)溴酚蘭蔗糖溶液
溴酚蘭
蔗糖
加雙蒸水至0. 05M PH8. 0 Tris — HCl 40ml
4、繪製細胞增殖曲線所用試劑
臺盼藍(sigma)、PBS、DMEM 細胞培養基(invitrogen )
5、細胞轉染所用試劑
pECFP-Nl anvitrogen)、陽離子脂質體(Lipofectamine 2000, Invitrogen)和大腸桿菌感受態細胞
6、細胞細菌汙染檢測
Hoechst 33342 (sigma)、4% 多聚甲醛固定液、PBS (稱取 NaCl，8. 0g、Na2HP04 ·12Η20， 2.89g、KCl，0. 2g、KH2P04，0. 2g加適量超純水使其溶解後，用1000ml容量瓶定容。調節pH 值7. 2左右，高壓滅菌30min)
7、細胞凋亡檢測
細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、0. OlM TBS，PH7.5(配法IL三蒸水中加入 8. 5g 氯化鈉。1. 2gTris 和 0. 45-0. 50ml 純乙酸)、0. OlM PBS, PH7. 4 (配法7. 9g 氯化鈉，0. 2g氯化鉀，0. 24g磷酸二氫鉀，1. 8g磷酸氫二鉀溶於800ml蒸餾水中，用鹽酸調 PH至7. 4，最後加蒸餾水定容至1L)
實施例1金華豬成纖維細胞系的構建
(1)初代培養快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗;Γ4 次；用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗3、次，然後剪成0. 5^1. Omm3 的組織塊；將組織塊移入培養瓶並塗布均勻，倒置培養瓶，放入37°C，5%C02的培養箱中培養 3^4h ；組織塊完全貼壁後加入IOml的培養液，培養液成分DMEM+10%胎牛血清繼續培養12 個小時；
(2)傳代培養倒出(1)過程中的培養液，用PBS清洗2次後，用胰蛋白酶消化後加入 IOml的培養液終止消化；消化後的細胞平均分成兩瓶，放入37°C，5%C02的培養箱中培養至凍存前Mh ；
(3)細胞凍存
①準備凍存前24h棄除原有培養液並更換新的培養液10ml，繼續培養Mh;
②按步驟(2)消化細胞，加入IOml培養基終止消化；
③用紅細胞計數板計數細胞凍存前的總數；IOOOrpm離心細胞5min，去上清，加入 Iml的凍存液，輕輕的吹打細胞使其懸浮；細胞凍存液成分50%胎牛血清、40%DMEM及 10%DMS0,把細胞分裝到凍存管中，用封口膜封口 ；
④將裝有細胞的凍存管轉移到4°C冰箱中放置lh，然後轉入-20°C冰箱中放置2 3h，再移入到-70°C的冰箱中過夜，最後快速將其移入到液氮中長期保存，並做好相應的記錄。(4)凍存細胞復甦將凍存管從液氮中取出後放入37°C水浴中，晃動廣aiiin後，把細胞移入到加入了 IOml全培養基離心管中，lOOOr/min離心5min後去上清，加入2ml的培養基，將細胞輕輕吹打均勻後將細胞移入有培養液的培養瓶，放置於37°C，5%0)2的培養箱中培養。實施例2金華豬成纖維細胞系生物學特性的檢測
對實施例1培養的金華豬成纖維細胞系進行生物學特性的檢查，方法如下 一、觀察細胞生長狀態、培養液顏色變化情況以及細胞是否發生汙染。
結論
如圖1為金華豬原代成纖維細胞；圖2為金華豬傳代前細胞顯微鏡下圖；圖3為金華豬繼代I細胞顯微鏡下圖；圖4為金華豬繼代II細胞顯微鏡下圖；細胞培養液清亮透明，細胞質突起豐滿，細胞核清晰可見，整個細胞呈長梭形、火焰，細胞分裂迅速，細胞形態趨於一致，為單核纖維裝細胞。對整個細胞群體觀察結果證明細胞生長旺盛，分裂速度快。二、微生物檢測 1、細菌、真菌檢測
方法1)取凍存細胞快速將凍存管放入到37°c水浴中，晃動廣ailin後，把細胞移入到加入了 IOml全培養基離心管中，1000r/min離心5min後去上清。2)重複步驟(1)加入2ml無抗生素的培養基，將細胞輕輕吹打均勻。3)將細胞以0. 5ml接種於不含抗生素培養基的培養瓶中，分別置於37°C和^TC 的培養箱中培養兩周。4)設對照組
(1)陽性對照將細菌接種於剛接種復甦細胞的培養瓶中，置於37°c和^rc的培養箱中培養兩周；
(2)陰性對照不加抗生素的培養基放於37°C和^rc的培養箱中兩周。結論
肉眼觀察接種有復甦後的成纖維細胞及同時接種成纖維細胞和細菌的培養基，發現只接種復甦成纖維細胞的培養基清澈透明，而同時接種成纖維細胞和細菌的培養基出現渾濁。用顯微鏡觀察發現只接種復甦成纖維細胞的培養瓶瓶中除了成纖維細胞外沒有其它雜物。2、支原體檢測
(1)取凍存細胞快速將凍存管放入到37°c水浴中，晃動廣ailin後，把細胞移入到加入了 IOml全培養基離心管中，1000r/min離心5min後去上清。(2)重複步驟(1)加入2ml無抗生素的培養基，將細胞輕輕吹打均勻。將細胞以 0. 5ml接種於不含抗生素培養基的培養瓶中，分別置於37°C的培養箱中培養48h ；
(3)用PBS或合適的緩衝液製備10 50μΜHoechst33342染料；
(4)將1/10細胞培養基體積的HoeChst33342染料溶液加入細胞培養物中(可以用 1/10濃度的Hoechst33342染料緩衝液代替培養基)；
(5)在37°C培養細胞10 20分鐘；
(6)用PBS或合適的緩衝液洗細胞兩次；
(7)直接加入4%多聚甲醛固定液，與培養液按1:3混合，固定細胞IOmin ；
(8)用帶有350nm激發波長，461nm發射波長的濾光片的螢光顯微鏡觀察細胞。結論
Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色螢光染料，對細胞的毒性較低。被支原體汙染的細胞在螢光細胞周圍仿佛有一層薄紗，與沒有被汙染的細胞形成鮮明的對比，如圖6所示。從圖中可以發現此細胞系沒有被支原體汙染，細胞生長狀況良好。三、細胞生長曲線的繪製方法(1)製備細胞懸浮液，取待測生長狀況良好的細胞，待細胞長到80、0%時，用常規的方法將細胞消化；
(2)向M孔板中分別接種等量的細胞，最好為2X104個/ml，置於37°C，5%0)2的培養箱中培養；
(3)從接種時間算起，每隔24h計數3孔內的細胞密度，用血球計數板分別計數細胞的總數，取3孔的平均值，直到第八天結束；
(4)以培養時間為橫坐標以，以細胞密度為縱坐標，將結果在坐標紙上繪製，得到培養細胞的生長曲線。結論
通過對接種後的細胞連續8天的計數，得到培養細胞的生長曲線。從曲線中可以發現細胞接種第1天生長比較緩慢，這可能是由於胰酶的作用使細胞損傷沒有恢復，這段時間為細胞適應的階段；在接種的第2天細胞生長速度明顯加快，第3天時細胞生長速度達到最大；到第5天後細胞生長速度開始變慢，這可能是由於細胞數量變多，導致營養物質消耗， 細胞之間的競爭加劇。6 7天細胞密度基本保持在最大，到第8天細胞數量有所減少，這可能是由於細胞之間的相互競爭導致細胞的生存環境進一步惡化，少量的細胞不能適應這種惡化的環境而死亡。四、細胞活率檢測
方法1、細胞凍存前，取收集好的10μ1細胞懸浮液加入10μ1的1%臺盼藍染液，混勻。 血球計數板計數活細胞及死細胞(細胞透明，不著色的為活細胞；細胞被染色的為死細胞)。 計數1000個細胞，計數細胞活率。2、細胞復甦後，取10μ1細胞懸浮液加入10μ1的1%臺盼藍染液，混勻。同步驟(1) 計數細胞活率。結論
細胞凍存前後對金華豬細胞系活率進行測定。結果表明細胞凍存前活率達 94. 2^97. 5%，而細胞復甦後活率達91. 8^93. 5%，由此可得細胞凍存後成活率依然很高。在凍存後將細胞培養發現細胞的形態符合成纖維細胞的形態，而且細胞的生物學活性沒有受到影響，此金華豬的成纖維細胞系質量比較穩定。五、同工酶分離
方法不連續梯度聚丙烯醯胺凝膠電泳法 1、樣品的製備
(1)採集指數增長期待檢細胞，IOOOg離心5min，去上清；
(2)加PBS漂洗，離心。再漂洗、離心2遍，最後棄上清液；
(3)向細胞沉澱中加蛋白質提取液，用吸管反覆吹打，使細胞完全溶解；
(4)把細胞溶解液轉入1.5ml離心管中，再用吸管反覆吹打，使細胞膜徹底溶解；
(5)置入微型離心機中，高速離心(9000r/min、2min)，收集上清，分成若干份，-70°C中儲存。2、凝膠的製備和注模
(1)根據所需濃度和配量，先用吸管按凝膠成分配比準確地吸取各貯液，在15ml的離心管中配製成凝膠工作液，均勻混合各成分，靜置lmin，儘量抽去溶液中的空氣。把混合好的凝膠工作液灌入其中。要防止灌膠裡有氣泡的產生。此後緩慢加入蒸餾水進行水封，水層約0. 5cm左右高度；
(2)室溫靜置45min左右後，水封層與分離膠層之間出現明顯界面。倒出水層，並用吸紙吸取殘留的水分。然後將配製的濃縮膠工作液注入凝膠腔內的分離膠液上面。直至距離短玻璃上沿5mm處，立即將樣品梳子插入凝膠液頂部。此過程也要應避免出現氣泡。室溫靜置，Ih後濃縮膠聚合完成。小心取出樣品梳子，將凝膠腔安裝在電泳架上，準備加樣
P
m ；
(3)取出在-70°C中儲存的蛋白提取液，解凍，快速加入約蛋白提取液一半的40%蔗糖溶液和2.5μ1的溴酚藍指示劑，混勻，此時正常的蛋白質樣品會呈現出深藍色。用微量加樣器在樣品槽內加樣，10 μ 1為宜。在樣品液上面，緩慢加入電極緩衝液，使每個凹槽內空隙完全被充滿。在電泳盒的上槽(負極)及下槽(正極)內分別倒入電極緩衝液。將電泳槽置入4°C冰箱，準備電泳；
(4)電泳與染色調節電壓60V電泳約30min，待指示劑到分離膠後將電壓調節為120V 電泳約6h，當溴酚藍指示劑遷移至下緣邊緣時，停止電泳，切斷電源；取下凝膠腔，小心除去玻璃板，將凝膠平板放在搪瓷託盤中，注入染色液，37°C避光染色至出現蛋白條帶為止；
(5)拍照與計算用照相機將染色後的凝膠照相，測量區帶泳動距離(d)及指示劑泳動距離(D)，計算相對遷移率(Rf)。結論如圖9(左)所示，金華豬成纖維細胞蘋果酸脫氫同工酶(MDH)的酶譜中有2 個條帶靠近陽極的泳動較快的為細胞溶質型(s-MDH)，靠近陰極的泳動較慢的為線粒體型 (m-MDH),相對遷移率的s-MDH和m_MDH的分別為20. 12%和35%。如圖9 (右)所示，金華豬成纖維細胞乳酸脫氫同工酶(LDH)的酶譜中有4個條帶從陰極到陽極依次為LDH1、LDH2、 LDH3、LDH4，相對遷移率分別為 15. 87%,33. 33%,47. 62% 和 63. 49%。六、核型的製備
1、選取處於指數生長期、用較大瓶培養的、80 90%匯合單層培養
細胞加秋水仙素從冰箱中取出培養瓶，加秋水仙素，使其最終濃度為0. 4μ g/ml培養液；溫箱中繼續培養幾；
2、採集分裂細胞胰蛋白酶消化收集細胞。轉入離心管中，以lOOOr/min離心5min， 收集細胞；
3、低滲吸除上清液，加入預熱至37°C、0.5% KCl溶液anl，輕輕吹打均勻，繼續加至 8ml，吹打均勻。37°C溫箱中溫育30min;
4、預固定懸液中加入新鮮固定液1ml，打勻(打勻時要輕輕吹打防止細胞破裂)；
5、固定將懸液以lOOOr/min離心5min，吸除上清液，加入新鮮固定液10ml，打勻，室溫靜置20min ；
6、重固定重複步驟6，離心後小心吸除上清液，視懸液細胞密度大小，剩餘固定液 0. 5 1. 0ml，吹打均勻；
7、製片取出在冰箱中預冷的乾淨載玻片，待表面有一層水霧出現時，在距玻片約 50cm高處用吸管迅速滴上1 2滴細胞懸液。滴片後，置於室溫自然乾燥，將滴片快速通過酒精燈的外焰上方，來回2 3次，將樣本固定到載玻片上
8、吉姆薩工作液染色15min，自來水衝洗，室溫自然乾燥；9、鏡檢染色體核型，選擇分散程度良好、無丟失、形態清晰、背景乾淨的中期分裂相進行顯微照相。對100個細胞的染色體數目進行計數，對其是否為整二倍體進行分析，統計出染色體2η眾數。結論對染色體數目統計得到二倍體數在中細胞中所佔的比例為85%，即2η Φ 38 所佔比例為15%，這達到了建系正常的二倍體要求的75%-80%。七、脂質體介導的質粒DNA轉染體外培養細胞方法
1、螢光蛋白報告質粒(PEGFP-N3)的製備按照說明書，提取純化pEGFP-隊螢光蛋白報告質粒，用紫外分光光度計測定質粒得到的質粒濃度為0. 15μδ/πι1質粒DNA，0D260/0D280 值為1. 75^1. 83之間，結果表明製得的質粒DNA純度、濃度等適合用於轉染成纖維細胞。2、細胞轉染
(1)將成纖維細胞用96孔細胞培養板含10 %胎牛血清的DMEM培養液中。(2) 37°C，5 %C02，飽和溼度培養細胞直到細胞長至50 % 80 %匯合。(3)取適量DMEM培養液(無抗生素、血清)加入DNA混勻此為A液，靜置。(4)向DMEM培養液(無抗生素、血清)中加入脂質體(L; ipofwctamine 2000) 混勻此為B液，靜置5min。(5 )將A液與B液慢慢混勻，室溫靜置20min。(6)於轉染前用PBS清洗細胞兩次。(7)向培養板中加入A液與B也的混合物，放置於37°C，5 %C02，飽和溼度培養箱中孵育18 48h，中途Mi後換入新鮮含10 %胎牛血清及抗生素的DMEM培養液。3、細胞轉染效率的觀察488nm激發光下觀察細胞的轉染數，計算轉染率。結論如圖10所示，在4 細胞的轉染率最高，轉染率為32. 4%。轉染7 後陽性細胞和轉染有螢光的細胞的螢光強度開始減弱。此過程中細胞的轉染率在32. 4%和一般的細胞轉染率相比轉染效率較高，適合於以後的應用研究。八、細胞凋亡的檢測
方法按細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司，產品編號MK1024)說明書進行試驗。觀察結果此過程採用的細胞凋亡檢測試劑盒可以將凋亡細胞的細胞核染成棕黃色，在普通顯微鏡下觀察統計凋亡細胞，計算凋亡率。結論如圖11所示，檢測培養傳代的50代細胞的凋亡率。結果顯示，細胞的凋亡率為2. 0%，此凋亡率比其它實驗所示的凋亡率高可能是由於所用的方法不同，或者是採用相同的方法而採用的觀察細胞凋亡的準則不同所引起的。實施例2
1)初代培養快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗3次；用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗3次，然後剪成廣0. 5mm3的組織塊； 將組織塊移入培養瓶並塗布均勻，倒置培養瓶，放入37°C，體積百分數為5%C02的培養箱中培養池；組織塊完全貼壁後加入IOml的培養液，培養液成分DMEM+10%胎牛血清繼續培養 8個小時；
132)傳代培養倒出步驟1)過程中的培養液，六用PBS清洗2次後，用胰蛋白酶消化後加入IOml的培養液終止消化；消化後的細胞平均分成三瓶，放入37°C，5%0)2的培養箱中培養至凍存前Mh ；
其餘實施方法如實施事例1
3)細胞凍存
(1)準備凍存前24h棄除原有培養液並更換新的培養液10ml，繼續培養Mh;
(2)倒出培養瓶中的培養液，用PBS清洗2次後，用胰蛋白酶消化後加入IOml的培養液終止消化；
(3)用紅細胞計數板計數細胞凍存前的總數；
(4)IOOOrpm離心細胞5min，去上清，加入Iml的凍存液，輕輕的吹打細胞使其懸浮； 細胞凍存液成分體積百分數為50%胎牛血清、體積百分數為40%DMEM及體積百分數為 10%DMS0 ；
(5)把細胞移到凍存管中，用封口膜封口；
(6)將裝有細胞的凍存管轉移到4°C冰箱中放置lh，然後轉入-20°C冰箱中放置2h，再移入到-70°C的冰箱中過夜，最後快速將其移入到液氮中長期保存，並做好相應的記錄。所述的胰酶消化的步驟為向培養瓶中加入37°C預熱的質量百分數為m的胰蛋白酶1. 5ml，在顯微鏡下觀察體積百分數為90%的細胞變成圓形後將胰蛋白酶倒掉，用手輕磕細胞培養瓶使細胞脫落，加入IOml新的培養液。所述的凍存細胞進行復甦步驟為將凍存管從液氮中取出後放入37°C水浴中，晃動Imin後，把細胞移入到加入了 IOml全培養基離心管中，lOOOr/min離心5min後去上清， 加入2ml的培養基，將細胞輕輕吹打均勻後將細胞移入有培養液的培養瓶，放置於37°C， 5%C02的培養箱中培養。實施例3
1)初代培養快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗4次；用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗4次，然後剪成廣0. 5mm3的組織塊； 將組織塊移入培養瓶並塗布均勻，倒置培養瓶，放入39°C，體積百分數為5%ω2的培養箱中培養4h ；組織塊完全貼壁後加入IOml的培養液，培養液成分DMEM+10%胎牛血清繼續培養 12個小時；
2)傳代培養倒出步驟1)過程中的培養液，六用PBS清洗3次後，用胰蛋白酶消化後加入15ml的培養液終止消化；消化後的細胞平均分成三瓶，放入37°C，5%0)2的培養箱中培養至凍存前^h ；
3)細胞凍存
(1)準備凍存前2 棄除原有培養液並更換新的培養液15ml，繼續培養對 2他；
(2)倒出培養瓶中的培養液，用PBS清洗3次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；
(3)用紅細胞計數板計數細胞凍存前的總數；
(4)IOOOrpm離心細胞5min，去上清，加入1.5ml的凍存液，輕輕的吹打細胞使其懸浮；細胞凍存液成分體積百分數為50%胎牛血清、體積百分數為40%DMEM及體積百分數為 10%DMS0 ；(5)把細胞移到凍存管中，用封口膜封口；
(6)將裝有細胞的凍存管轉移到4°C冰箱中放置池，然後轉入-20°C冰箱中放置3h，再移入到-70°C的冰箱中過夜，最後快速將其移入到液氮中長期保存，並做好相應的記錄。所述的胰酶消化的步驟為向培養瓶中加入39°C預熱的質量百分數為m的胰蛋白酶anl，在顯微鏡下觀察體積百分數為95%的細胞變成圓形後將胰蛋白酶倒掉，用手輕磕細胞培養瓶使細胞脫落，加入15ml新的培養液。所述的凍存細胞進行復甦步驟為將凍存管從液氮中取出後放入39°C水浴中，晃動aiiin後，把細胞移入到加入了 15ml全培養基離心管中，lOOOr/min離心5min後去上清，加入2ml的培養基，將細胞輕輕吹打均勻後將細胞移入有培養液的培養瓶，放置於 37°C,5%C02的培養箱中培養，其餘步驟與實施例1相同。
權利要求
1.一種金華豬成纖維細胞系的培養方法，其特性在於它的步驟如下1)初代培養快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗；Γ4次； 用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗；Γ4次，然後剪成0. 5^1. Omm3的組織塊；將組織塊移入培養瓶並塗布均勻，倒置培養瓶，放入37 39°C，體積百分數為5%C02的培養箱中培養3 4h ；組織塊完全貼壁後加入IOml的培養液，培養液成分DMEM+10%胎牛血清繼續培養8 12個小時；2)傳代培養倒出步驟1)過程中的培養液，六用PBS清洗2 3次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；消化後的細胞平均分成三瓶，放入37°C，5%C02的培養箱中培養至凍存前對 2他；3)細胞凍存(1)準備凍存前對 2他棄除原有培養液並更換新的培養液l(Tl5ml，繼續培養對 2他；(2)倒出培養瓶中的培養液，用PBS清洗2 3次後，用胰蛋白酶消化後加入l(Tl5ml的培養液終止消化；(3)用紅細胞計數板計數細胞凍存前的總數；(4)IOOOrpm離心細胞5min，去上清，加入廣1. 5ml的凍存液，輕輕的吹打細胞使其懸浮；細胞凍存液成分體積百分數為50%胎牛血清、體積百分數為40%DMEM及體積百分數為 10%DMS0 ；(5)把細胞移到凍存管中，用封口膜封口；(6)將裝有細胞的凍存管轉移到4°C冰箱中放置廣2h，然後轉入-20°C冰箱中放置 2 3h，再移入到-70°C的冰箱中過夜，最後快速將其移入到液氮中長期保存，並做好相應的記錄。
2.根據權利1要求所述的一種金華豬成纖維細胞系的培養方法，其特徵在於所述的胰酶消化的步驟為向培養瓶中加入37 39°C預熱的質量百分數為洲的胰蛋白酶1.5lml，在顯微鏡下觀察體積百分數為90、5%的細胞變成圓形後將胰蛋白酶倒掉，用手輕磕細胞培養瓶使細胞脫落，加入l(Tl5ml新的培養液。
3.根據權利1要求所述的一種金華豬成纖維細胞系的培養方法，其特徵在於所述的凍存細胞進行復甦步驟為將凍存管從液氮中取出後放入37 39°C水浴中，晃動廣aiiin後，把細胞移入到加入了 l(Tl5ml全培養基離心管中，lOOOr/min離心5min後去上清，加入anl 的培養基，將細胞輕輕吹打均勻後將細胞移入有培養液的培養瓶，放置於37°C，5%0)2的培養箱中培養。
全文摘要
本發明公開了一種金華豬成纖維細胞系的培養方法。利用金華豬胚胎肌肉組織進行初代培養、傳代培養最終獲得高純度、高活率的金華豬成纖維繫，此成纖維繫屬於生物學領域。培養得到的成纖維細胞系不含上皮細胞等雜細胞，細胞純度高；凍存細胞質量穩定，經過細胞凍存復甦後活率可達91.8~93.5%，細胞傳代後生長穩定，適合大規模培養。經過細胞學特性的檢測，表明該細胞系符合細胞系建系要求。本發明涉及的金華豬成纖維細胞可以用於製作轉基因豬的核移植供體；可以為醫學及分子生物學研究提供原材料；可以作為疫苗生產的主要原料及肝細胞培養的飼養層。農業上可以豐富和改良地方豬種，是我國地方優良豬種的有效保護手段。
文檔編號A01N1/02GK102409021SQ20111042585
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者彭靜, 徐寧迎, 沈一飛, 王穎, 郝柱, 郭曉令 申請人:浙江大學