一種微生物群落結構的分析方法

2023-09-22 19:27:30

專利名稱：：一種微生物群落結構的分析方法
技術領域：
：本發明屬於生物分析
技術領域：
，具體涉及是一種利用不通過PCR的rRNA測序來分析微生物群落結構的方法。
背景技術：
：微生物群落結構的分析一直是微生物生態學和環境微生物學研究的熱點。因此，根據對目標樣品的種群結構和多樣性解析其微生物群的動態變化，可以為優化群落結構、調節群落功能和發現新的重要功能微生物類群提供可靠的依據。隨著分子生物學技術的發展和廣泛應用，從20世紀90年代初，它也被逐步引入了微生物生態學和環境微生物學領域，為該領域的研究提供了新的方法和前所未有的推動力。分子生物學技術的優勢在於它規避了環境當中絕大多數微生物在目前條件下不可純培養這一問題的困擾。隨著核糖體RNA(rRNA)基因的分子生物學基因分析技術在微生物群落分析上的應用，研究環境樣品的多樣性成為了可能。這些方法主要基於從環境樣品中提取DNA或者RNA，使用rRNA特異性的引物對模板DNA進行擴增，或對RNA先進行反轉錄後進行特異性擴增。基於16S和18SrRNA擴增和克隆文庫構建的測序結果為微生物的群落結構多樣性分析提供了高解析度的分類信息。基因指紋圖譜技術如DGGE，TGGE，T-RFLP等技術也為監測群落中主要種群變化提供了快速、準確的信息。然而基於特異性PCR擴增方法研究微生物群落結構和多樣性的各種方法有其無法避免的缺陷性1)儘管研究者設計了越來越多的含有簡併鹼基的引物，針對rRNA基因序列的引物並不能匹配環境樣品中所有的微生物，這會導致某些微生物群落未能被檢測到，而某些微生物群落的含量被高估；2)由於PCR方法是對模板進行多個循環的擴增，而模板中不同微生物的擴增效率不盡相同，最終得到的PCR產物並不能反應原始模板中不同微生物含量的比例；3)由於所使用的引物是細菌、古生菌、真菌等群落特異性的，因而不能共同分析這些微生物在群落中的多樣性和相對含量。近年來，焦磷酸測序(pyrosequencing)等高通量測序技術快速地發展起來，從而使低成本得到高通量的基因序列成為可能。通過在通用引物前加樣品特異性的標籤後進行PCR擴增，將多個樣品的擴增產物混合後測序可以得到大量的序列，再通過標籤將每個樣品區分開來，這一方法已經廣泛運用到環境樣品的微生物群落結構和多樣性分析。但此方法還是依靠引物，無法避免特異性PCR擴增的缺陷。元(宏)基因組分析可以避免PCR擴增的缺陷，但是因所得的元基因組數據中只有0.2%左右的結果與16S/18SrRNA基因相關，所以元基因組分析方法並不是最適合於微生物多樣性的分析方法。本發明中所使用的利用不通過PCR的rRNA測序來分析微生物群落結構的方法避免了上述基於PCR的方法的缺陷。
發明內容本發明的目的在於提供一種能準確、定量反映環境樣品中微生物的群落結構和多樣性的分析方法。本發明提供的關於微生物群落結構的分析方法，是對環境樣品抽提RNA後，不進行特異性PCR擴增，而是在反轉錄後直接進行高通量測序並進行分析的方法，具體步驟如下步驟一，提取環境樣品的總RNA;步驟二，從總RNA中分離小亞基(16S/18S)rRNA;步驟三，通過隨機引物對小亞基rRNA進行反轉錄，並對反轉錄產物進行測序；步驟四，從測序結果中抽提出小亞基rRNA序列；步驟五，根據所得的小亞基rRNA序列，與公共資料庫對比得到序列相應的分類信息作為分類單元的依據，由此獲得微生物群落結構特徵。所述分離小亞基rRNA，是通過電泳來分離小亞基rRNA和大亞基(23S/28S)rRNA條帶，並割膠回收小亞基rRNA。所述通過隨機引物的反轉錄和測序，是通過隨機引物合成雙鏈DNA，並隨機打斷和/或割膠特定長度條帶來使得適合於測序；或者通過加tag的隨機引物合成雙鏈DNA，並用tag序列對應引物來擴增此雙鏈DNA並用於測序。所述從測序結果中抽取小亞基rRNA序列，是結合所測序列與自建多個微生物的各種類型(16S/18S/23S/28S)rRNA基因序列資料庫和公共核苷酸序列資料庫的BLAST結果來確定所測序列是否屬於小亞基rRNA序列。所述根據小亞基rRNA序列的確定分類信息確定，是以小亞基rRNA序列與公共資料庫的相似度或同源性來確定分類信息，從而確定微生物群落結構。本發明可以同時對一個環境樣品中的細菌、古生菌、真核微生物進行定量的分析，它能夠克服現有的基於PCR擴增的研究微生物群落結構和多樣性的分子生物學方法的缺陷，由於本發明所研究的對象為微生物的RNA，因此能準確的反應環境樣品中具有活性的微生物的群落結構和多樣性，具有準確，定量化等顯著優點，並適合於現有的高通量測序。本發明具有以下優點(—)本發明可以分析各種不同類型的環境樣品的微生物群落結構多樣性。本發明中所使用的方法操作簡便，成本低廉，適用於一般的分子生物學實驗室操作。(二)本發明所分析的對象為微生物的rRNA，因此反應的是樣品中具有活性的微生物群落結構和多樣性。(三)本發明不通過PCR擴增，因此規避了PCR過程中由於引物特異性和非特異性，擴增效率以及PCR本身固有的偏向性所產生的偏差。由於本發明不需要對RNA進行擴增，因此測序結果能夠定量地反應樣品種各類微生物的比例。圖1為提取的RNA電泳圖示。具體實施例方式取自汙水處理廠曝氣池中的活性汙泥的微生物多樣性分析活性汙泥樣品取自上海市一家城市汙水處理廠的曝氣池，實驗步驟如下(—)液氮研磨法和Trizol總RNA抽提試劑盒(上海生工，上海)相結合提取環境樣品的總RNA。1)將泥水混合物加入的50mlRnase-free的離心管中，lOOOOrpm離心5分鐘，去掉液體。將樣品分成0.5g每份裝入1.5mlRnase-free的離心管中，浸入液氮待凍住後於-80。C保存。2)取0.5g樣品和0.5g直徑為212-300ym的玻璃珠於高溫滅菌後的研缽中。3)加液氮覆蓋，待液氮揮發後立即用力研磨至樣品變為粉末。4)重複2)—次。5)在研缽中加入1000ii1Trizol，待粉末溶解後，將渾濁液轉入1.5mlRnase-free的離心管中。6)將0.5g直徑為212-300iim的玻璃珠加入含有0.5g樣品的1.5mlRnase-free的離心管中，加入300ii1DEPC-ddH20。7)將離心管置于振蕩器(Labnet，美國)上，使用最高轉速振蕩10分鐘。8)在離心管中加入500ii1Trizol。注步驟2)-5)可以根據不同的樣品改為步驟6)-8)，步驟2)-5)適用於樣品中微生物含量較多，雜質較多的樣品，步驟6)-8)適用於微生物含量較少，雜質較少的樣品。9)加入100ii1氯仿，劇烈振蕩30秒，120000rpm室溫離心5分鐘10)將水相轉入新的1.5mlRnase-free的離心管中，加入150ii1無水乙醇，將管子反覆顛倒數次混勻後將液體移到RNA結合柱中，將RNA結合柱放置在2ml收集管上。11)室溫放置2分鐘，8000rpm離心1分鐘。12)將收集管中的液體倒掉，加入450ii1RPE溶液，10000rpm離心30秒。13)重複步驟12)—次。14)將收集管中的液體倒掉，10000rpm離心1分鐘。15)將RNA結合柱放置於新的1.5mlRnase-free的離心管上，加入50iUDEPC-ddH20，75t:放置2分鐘。16)10000rpm離心1分鐘。(二)從總RNA中分離小亞基rRNA。1)將上述得到的RNA進行1%的瓊脂糖電泳，緩衝液1XTAE，電壓100V，30分鐘。2)將瓊脂糖膠放入300ml2yg/ml溴乙錠的TAE溶液中浸泡10分鐘。3)將膠塊至於312nm紫外光下，結果如圖1所示，將16S/18SrRNA位置的膠塊割下。4)按照Zymoclean(美國)的RNA膠回收試劑盒(貨號R1011)的說明書操作，得到RNA純化產物。5)使用nanodrop3300(美國)對回收的RNA進行定量，染料使用Ribogreen(Sigma，美國)。(三)對RNA反轉錄產物隨機測序。1)使用Invitrogen(美國)的雙鏈cDNA合成試劑盒將回收的RNA合成雙鏈DNA，合成使用隨機六聚體引物。2)合成的雙鏈DNA隨機打斷成400-1000bp的片段。53)對這些片段使用羅氏GS-FLX焦磷酸測序系統進行高通量測序。(四)將16S/18SrRNA序列從大量隨機測序序列中抽提出。1)將所有的序列運行NCBI資料庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行本地BLAST。2)分別選取多種細菌，古生菌，真菌，原生動物的16S，23S，或18S，28SrRNA基因的全長序列自建資料庫，與所測序列進行BLAST。3)結合1)和2)得到的結果，將所有序列分為16S，18S，23S，28SrRNA基因和其他。不好區分類型手工進行分析。(五)對大量隨機測序的16S/18SrRNA序列使用序列對應的分類信息作為分類單元確定的依據。1)對於16SrRNA序列，使用RDP資料庫的Classifier工具(httD:〃rdo.cme.msu.edu/classifier/classifier.isp)進行分類。2)對於18SrRNA序歹lj，運行NCBI資料庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)本地BLAST,資料庫日期為最新，使用MEGAN軟體(http:〃www_ab.informatik.uni-tuebingen.de/software/megan)對BLAST結果進行分析和查看。通過上述實驗步驟共得到原始序列33017條，其中大於400bp的序列20783條，16S，18SrRNA序列所佔的比例分別為32.3%(6721條)和25.8%(5361條)。18SrRNA序列可以分為11個真核生物的門，主要為葉足門，纖毛門，輪蟲門，脊椎動物門，環節動物門，頂復門等。16SrRNA序列主要為細菌和少量的古生菌，細菌可以分為19個門，主要為變形菌門，放線菌門，擬桿菌門，疣微菌門，綠彎菌門，厚壁菌門，浮黴菌門等，有34條序列為古生菌16SrRNA的序列，主要為甲烷微菌綱。除此之外，還有大量的可以確定為16S或者18SrRNA的序列在現有的公共資料庫中沒有對應的分類信息，這是由於現有的PCR引物是不能匹配所有的微生物的，而本發明避開了特異性PCR擴增的步驟，避免了引物的偏向性和局限性，因而可以得到更多的，以往沒有發現過的微生物的序列信息。為了驗證與本發明的結果對比，對該樣品同樣使用基於PCR的高通量測序方法進行分析，具體步驟如下(—)對樣品提取RNA、16SrRNA割膠回收步驟與本發明所述相同。(二)對於(一)中得到的16SrRNA進行引物特異性的反轉錄並得到16SrRNAV3(細菌16SrRNA基因上的高變區域，通常用來分析細菌群落結構和多樣性)區域PCR擴增產物。1)使用Invitrogen(美國)的雙鏈cDNA合成試劑盒將回收的RNA合成單鏈DNA，使用的引物為519R(5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3')。2)將1)中得到的cDNA作為模板，使用Tiangen(北京)的MasterMixPCR試劑盒進行擴增，使用的引物為338F(5'-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3')和519R，反應條件為95。C預變性5分鐘，94°C30秒，53°C30秒，72°C45秒，30個循環，最後72。C延伸7分鐘。3)將PCR產物跑1%瓊脂糖電泳，將相應的條帶(約200bp)割下。4)使用Axygen(美國)DNA膠回收試劑盒進行純化。(三)對16SrRNAV3區域PCR擴增產物使用羅氏GS-FLX焦磷酸測序系統進行高通量測序。對本發明中不通過PCR擴增所得到的16SrRNA序列中含有V3區域的序列進行篩選，得到含有完整的V3區的2428條序列。將這組序列與通過PCR擴增所得到的序列進行比較發現(如表l所示)1)兩組序列所得到的分類信息的結果大致是相似的。2)兩組序列所得到的分類信息中優勢菌差異不大，但是含量較少的疣微菌門、綠彎菌門和浮黴菌門則有較大的差異。為了進一步分析這一差異產生的原因，將兩組序列的引物與本發明得到的序列進行了對比分析(參見表1)，在這3個門的序列中，現有引物與本發明得到的序列不匹配的比例較高，這也正解釋了通過PCR方法得到的序列中這3個門的序列較少的理由。其它門中也有一定比例的序列與現有引物是不能匹配的，這也說明了本發明的方法避免了使用PCR，避免了引物的幹擾，可以得到更廣泛的微生物群落多樣性。表1本發明所得V3區域序列與基於PCR擴增得到的V3序列所對應的細菌多樣性比較以及對PCR擴增中用到的通用引物序列的分析。tableseeoriginaldocumentpage7對本發明序列中V3序列和基於PCR擴增得到的V3序列的多樣性進行統計學分析，兩種方法得到的序列中隨機選取400條序列，採用0.03到0.3的序列差異來人為對序列分為可操作分類單元(0TU)時，rarefaction,ACE，Chaol等統計學的結果如表2所示。本發明所體現的細菌群落多樣性都遠遠大於基於PCR擴增所得到序列。這再一次說明本發明方法應用於微生物多樣性分析中的優點。表2本發明序列中V3序列和基於PCR擴增得到的V3序列統計學分析序RarefactionACEChaol列本發明序基於PCR擴本發明序基於PCR擴本發明序基於PCR擴差列中V3序增得到的V3列中V3序增得到的V3列中V3序增得到的V3異列序列列序列列序列0.03299(1187)12382712(5703)7871261(3422)5170.0274(963)2071789(3105)527911(2084)3780.1212(571)148709(1151)301470(968)2520.2103(177)54167(197)61152(198)640.332(41)1439(41)2339(41)17括號中的值為本發明序列V3序列數目為2428條時的0TU數目。權利要求微生物群落結構的分析方法，其特徵在於具體步驟如下步驟一，快速提取樣品的總RNA；步驟二，從總RNA中分離小亞基(16S/18S)rRNA；步驟三，通過隨機引物對小亞基rRNA進行反轉錄，並對反轉錄產物進行測序；步驟四，從測序結果中抽提出小亞基rRNA序列；步驟五，根據所得的小亞基rRNA序列確定分類信息，並獲得微生物群落結構特徵。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述分離小亞基rRNA，是通過電泳來分離小亞基rRNA和大亞基(23S/28S)rRNA條帶，並割膠回收小亞基rRNA。3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述通過隨機引物的反轉錄和測序，是通過隨機引物合成雙鏈DNA，並隨機打斷和/或割膠特定長度條帶來使得適合於測序；或者通過加tag的隨機引物合成雙鏈DNA，並用tag序列對應引物來擴增此雙鏈DNA並用於測序。4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述從測序結果中抽取小亞基rRNA序列，是結合所測序列與自建多個微生物的各種類型rRNA基因序列資料庫和公共核苷酸序列資料庫的BLAST結果來確定所測序列是否屬於小亞基rRNA序列。5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述根據小亞基rRNA序列的確定分類信息，是以小亞基rRNA序列與公共資料庫的相似度或同源性來確定分類信息，從而確定微生物群落結構。全文摘要本發明屬於生物分析
技術領域：
，具體為一種分析微生物群落結構的分析方法，該方法包括如下步驟提取環境樣品中的總RNA；從總RNA中分離小亞基rRNA；通過隨機引物對小亞基rRNA進行反轉錄，進行測序；從測序結果中抽提出小亞基rRNA序列；根據所得的小亞基rRNA序列確定分類信息並獲得微生物群落結構特徵。本發明不使用特異性PCR擴增，避免了PCR過程中產生的諸多偏差，同時分析細菌、古生菌、真核微生物的群落結構，從而真實、全面地反映環境樣品中微生物群落結構的特徵。文檔編號C12Q1/02GK101792807SQ20101013209公開日2010年8月4日申請日期2010年3月25日優先權日2010年3月25日發明者全哲學,李曉然申請人:復旦大學