一種大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法
2023-10-09 11:56:29 2
專利名稱：一種大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法
技術領域：
本發明屬於生物製品技術領域，涉及偽狂犬病毒疫苗大規模生產方法。
背景技術：
偽狂犬病毒(PRV)屬於皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，具有在細胞生長物上快速生 長，強烈的嗜神經性與潛伏感染等特性。該病毒在自然條件下可感染豬、牛、羊、犬、貓、家 兔、小白鼠、水貂、狐等各種家畜和野生動物。豬是該病毒的儲存者和傳播者，主要表現為 妊娠母豬流產、死胎或木乃伊胎，初生仔豬出現神經症狀、麻痺、衰竭甚至死亡，死亡率幾乎 100 %，斷奶仔豬發病率為20 40 %，死亡率為10 20 %，該病已成為目前種豬繁殖障礙 綜合症的主要病因並逐年呈上升趨勢，給養豬業造成巨大的損失，因此注射疫苗是預防本 病的主要措施。目前我國生物製品生產中培養貼壁依賴性細胞如非洲綠猴腎細胞(Vero)、豬腎細 胞(ΡΚ15)細胞等多採用傳統轉瓶培養，但其生產中細胞所能增殖的區域僅限於培養瓶的 有限面積，培養的環境條件難以監測和控制，因此細胞密度低，而且勞動強度大，操作過程 易汙染，疫苗產量及質量受到極大限制。目前偽狂犬疫苗生產存在的問題如下一、勞動強 度大，佔地空間大；二、單位體積提供的細胞生長面積有限，細胞密度低；三、培養時監測和 控制環境條件受到限制，批間差異大。
發明內容
本發明的目的是提供一種偽狂犬病毒疫苗大規模生產方法。本發明目的是通過如下技術方案實現的(a)在具有潮汐式微載體懸浮培養系統的生物反應器中，添加網狀的聚酯纖維作 為載體，接種制苗用細胞；(b)培養細胞生長至一定密度，接種偽狂犬病毒，使所述偽狂犬病毒感染細胞；(c)使病毒在適宜的條件下大量增殖；(d)細胞病變率(CPE)達70%以上時收穫病毒；(e)將收穫的病毒液凍融1 2次，使細胞完全脫落、分散，加入凍幹保護劑，混勻， 定量分裝，凍幹。本發明所述生物反應器是潮汐式微載體懸浮培養系統，主要由載體罐、儲液罐、PH 控制器、DO監測器、輸入和輸出系統。該生物反應器工作過程如下①細胞貼附生長在載體 罐的載體上，當儲液罐的培養液被泵入載體罐時，培養液液面上升向細胞供給養分並促進 細胞新陳代謝產物的去除。②當載體罐的培養液泵入儲液罐時，培養液隨之下降，使細胞進 行通風供氧。這個重複的運動使載體上的細胞能夠得到足夠的營養和氧氣，同時產生的代 謝廢物如CO2能夠有效的被排出去。其中培養基的灌流速度隨著所培養細胞的不同、接種 病毒的不同而不同。在本發明中，可用於本發明的制苗用細胞為可增殖偽狂犬病毒的細胞系，如非洲綠猴腎細胞(Vero)、豬腎細胞(PK15)、牛腎細胞(MDBK)、雞胚成纖維細胞(CEF)等。在本發 明的較佳實施方案中宜採用PK15細胞，偽狂犬病毒對PK15細胞具有較高的敏感性，適宜於
病毒增殖。細胞接種於載體時的，細胞的密度可在2 4X 107cell/g載體，較 佳為 3X 107cell/g載體，能夠在較短時間、細胞損耗較少的情況下吸附於載體，培養達到接種 病毒的細胞密度。接種病毒時細胞的密度5. OX IO8 8. OX 108cell/g載體，接種病毒的 Μ. 0. I. = 0. 01 0. 1。本發明中培養細胞和增殖病毒設置的液體灌流速度較適宜的參數為細胞貼附程序:up2400 2800mL/min、hold 10 20s，Down2400 2800mL/ min、hold 5 15s ；細胞培養程序up 1800 2200mL/min、hold 5 15s，Down 1800 2200mL/min、hold lmin45s 2minl5s。病毒吸附程序:up 2100 2500mL/min、hold lmin50s 2minl0s，Down 2100 2500mL/min、hold 15 25s ；病毒繁殖程序up 1700 2100mL/min、hold 15 25s，Down 1700 2100mL/min、hold lmin50s 2minl0s。細胞貼附和(或)病毒吸附程序為3 4h後置換為細胞培養程序和(或)病毒
繁殖程序。液體的最大換液量隨著載體罐的體積而有所不同。在本發明中，最大換液量在 17 19L之間，較佳的為18L，既能保持充足的氣體交換，又能提供做夠的營養物質。在本發明中，生物反應器內的最有利於細胞和病毒增殖的條件為最適宜的溫度 為37°C ；二氧化碳濃度為2. 5% 5%，較佳的為3. 5% ；溶氧90%以下；pH值7. 0 7. 4， 較佳的為7. 2。偽狂犬病毒能夠引起細胞的病變，所以通過細胞病變率(CPE)決定病毒收穫時 機，當CPE達70%以上時可收穫病毒。通過接種細胞觀察細胞病變，按Reed和Muench法計 算TCID5tl，在本發明中毒液每1. Oml病毒含量彡IO8 0TCID500本發明使用過的微載體，通過以下方法滅菌後可再次利用將PBS(磷酸鹽緩衝液 0. 01mol/L pH 7. 2)淹沒載體；121°C消毒30分鐘，消毒後，排空PBS0本發明大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，特點在於(1)本發明生產規模大，產量高；解決了生產生物製品傳統轉瓶大規模生產產量 不高，勞動強度大，成本高的問題。(2)本發明中以聚酯纖維為載體，細胞貼壁面積大，Ig載體能夠提供2400cm2的細 胞貼壁面積，單位體積大大提高了細胞的生長面積，解決了轉瓶工藝中細胞密度低的問題， 提高了單位體積的病毒含量。(3)本發明提供的方法可以全封閉生產，自動換液，減少了汙染的機率，產品質量 均一穩定，批間差異小。解決了傳統工藝僅能控制溫度和轉速，不同批次質量差異大批間差 異大的問題。
具體實施例方式實施例1偽狂犬病毒疫苗的大規模生產本實施例中採用的生物反應器是美國CESCO公司生產的TideCel 1-020型，載體罐體積為20L，培養基袋體積為500L。採用的載體為該公司生產的BioNoc II聚酯纖維，該纖 維是網狀結構，具有親水性和生物無害性，Ig載體約提供2400cm2的貼壁面積，能夠提供約 1.0X109細胞的生長空間，每升載體罐體積需要數量為Ilg的BioNoc II聚酯纖維。 (1)製備制苗用豬腎細胞(PK15)種子液，使細胞總數達到5X109。(2)向含有載體的載體罐中加入步驟(1)所述的PK15細胞種子液，向培養基袋加 Λ 500L^ 5%ψMMWDMEM(Dulbecco 『 s modificationof Eagle' s medium Dulbecco) 細胞生長液，同時連接載體罐與培養基袋。(3)在37°C、pH 7. 2、3. 5% CO2環境下進行培養細胞，設置培養參數如下，細胞貼 附程序up 2600mL/min、hold 15s, Down 2600mL/min、hold IOs ；此過程持續 4h ；切換細胞
:up 2000mL/min>holdl0s, Down 2000mL/min> hold 2min。(4)待細胞濃度達到6. O X IO8Cel 1/g載體，將DMEM細胞生長液全部抽出，換上2% 牛血清的DMEM細胞維持液，接種感染複數M.0. I. = 0.05的偽狂犬病毒。(5)在37°C、pH 7.2,3.5% CO2環境下進行培養病毒；設置培養參數如下，病毒吸 附程序up 2300mL/min、hold 2min，Down2300mL/min、hold 20s ；此過程持續 3h ；切換病毒 MMfMj^ :upl900mL/min>hold 20s, Down 1900mL/min> hold 2min。(6)細胞病變率(CPE)達70%以上時收穫病毒。偽狂犬病毒抗原液的檢驗按照《中華人民共和國獸藥典》2005年版第三部附錄 15頁、19頁、20頁進行檢驗，無細菌和黴菌、支原體、外源病毒汙染。安全性和免疫原性均符 合《中華人民共和國獸藥生物製品規程》198頁。測定病毒含量方法如下將PK15細胞接種於96孔細胞板中，每孔細胞含量為 1 X IO4個，培養16 24h備用；按含毒組織量用DMEM培養液將毒種做10倍系列稀釋， 取10_3、10_4、10_5、10_6、10人ΙΟ"8六個稀釋度各接種上述製備好的96孔細胞培養板，每孔
0. lml，每個稀釋度設置8個重複。觀察細胞病變率(CPE)，計算TCID5tlt5細胞制苗毒液每
1. Oml 病毒含量彡 ΙΟ8'0TCID500(7)將收穫的檢驗合格的病毒液置-20°C和20°C之間凍融2次，使細胞完全脫落、 分散，加入脫脂奶，混勻，定量分裝，凍幹。實施例2偽狂犬病毒疫苗的檢驗(1)性狀檢驗微黃色海綿狀疏鬆團塊，加PBS (0. 01mol/L pH7. 2)後迅速溶解，呈 均勻的懸液。(2)純粹檢驗按照《中華人民共和國獸藥典》2005年版第三部附錄15頁、19頁、 20頁進行檢驗，無細菌和黴菌、支原體、外源病毒汙染。(3)病毒含量按瓶籤註明頭份用PBS (0. 01mol/LpH7. 2)稀釋，並按實施例1步驟 (6)中測定病毒含量的方法測定，每頭份的病毒含量> 5000TCID50O(4)安全檢驗按瓶籤註明頭份用PBS(0. 01mol/L pH7. 2)稀釋為每5ml含14頭 份，肌肉注射6 18月無偽狂犬病病毒中和抗體的綿羊2隻，每頭5ml，觀察14日，無臨床 反應。結果如表1。 表1注射疫苗綿羊的臨床症狀綿羊編號觀察天數_臨床症狀_
0900114d精神狀態良好，體溫正常，皮膚
沒有瘙癢症狀
0900214d 精神狀態良好，體溫正常，皮膚 _沒有瘙癢症狀_(5)效力檢驗按瓶籤註明頭份用PBS稀釋為每Iml含0. 2個使用劑量，肌肉接種 6 18月齡綿羊4頭，每頭lml，14日後連同條件相同的無偽狂犬病病毒中和抗體對照綿羊 3頭，每頭肌肉注射強毒lml (IOOOLD50)，觀察14天，對照綿羊2頭髮病死亡，免疫綿羊全部 保護為合格。如表2。表2實驗綿羊與對照組的動物反應
注射疫苗後反應 注射強毒後反應死亡日期
精神狀態良好，體溫精神狀態良好，體溫在 實驗組稩押識&民燈，件敘P2日略有升高，皮膚 均健康成活
. 正常，沒有瘙瘁症狀 沒有瘙癢症狀
+皿,口精神沉鬱，體溫升高』攻毒後4、5天各死
對照組------------------------一隻，另一隻存活，
皮膚有瘙癢症狀 但精神沉鬱，身體削
_____M_(6)剩餘水分、真空度測定按照《中華人民共和國獸藥生物製品規程》2000年版 第三部附錄438、437頁進行，符合規定。實施例3懸浮培養工藝與傳統轉瓶培養技術比較在本發明中對TideCell和3000ml轉瓶培養系統做了統計分析，結果如表3。表3不同培養系統增殖偽狂犬病毒的相關比較一培養方式 TideCell-020懸浮培養系統 3000ml轉瓶培養系統 細胞貼壁面積528000cm21250cm2
產量比值. 1個微載體培養系統423個轉瓶
佔地面積20 m2150m2
人工投入2個人x4h30個人x8h
風險暴露點<20個423個
耗材成本低高 清洗成本低高
收穫抗原500L423x300ml=126.9L
操作工藝. 全自動微電腦控制_程序繁瑣_本發明中使用的TideCell-020懸浮培養系統載體罐體積為20L，載體為BioNoc II聚酯纖維，添加載體220g，Ig載體能夠提供2400cm2的細胞貼壁面積，若要達到和 TideCel 1-020相同的貼壁面積則需要423個3000ml的轉瓶，然而獲得的抗原量是轉瓶系統 的3倍還多。整個TideCell採用全自動封閉式培養，需要的人力明顯低於轉瓶系統，並且 抗原液汙染的機率也明顯降低。再從耗材成本上比較，TideCell僅需要懸浮培養的整個系 統，而轉瓶系統則需要大量的轉瓶和轉瓶機。從清洗成本上，TideCell若採用拋棄式的設 備則清洗成本為0，若採用原地滅菌式則只需要對系統做整體滅菌，而轉瓶系統則需要對成 百甚至上千的瓶子進行清洗滅菌，不僅消耗清洗成本，而且消耗人力。因此，採用TideCell懸浮培養系統，能夠提高細胞的生長密度，節約資源消耗，實 現對同批產品的質量控制，生產出產品規模大、成本低、品質高的偽狂犬病毒疫苗。
權利要求
一種大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於包括下列步驟(a)在具有潮汐式微載體懸浮培養系統的生物反應器中，添加網狀的聚酯纖維作為載體，接種制苗用細胞；(b)培養細胞生長至一定密度，接種偽狂犬病毒，使所述偽狂犬病毒感染細胞；(c)使病毒在適宜的條件下大量增殖；(d)細胞病變達70％以上時收穫病毒；(e)將收穫的病毒液凍融1～2次，使細胞完全脫落、分散，加入凍幹保護劑，混勻，定量分裝，凍幹。
2.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於生物反應器中每IL載體罐中添加Ilg載體。
3.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於生物反應器中載體罐的最大換液量為17 19L。
4.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於制苗用細胞選自可增殖偽狂犬病毒的非洲綠猴腎細胞、豬腎細胞、牛腎細胞或雞胚成纖維細胞。
5.根據權利要求4所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於制苗用細胞為豬腎細胞。
6.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於制苗用細胞接種於載體時的密度為2 4X107cell/g載體；接種病毒時的細胞密度為5. OXlO8 8. 0X108cell/g載體，接種偽狂犬病毒的M. 0. I. = 0.01 0. 1。
7.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於接種制苗用細胞後參數設置為，細胞貼附程序up 2400 2800mL/min、hold 10 20s，Down 2400 2800mL/min、hold 5 15s ；細胞培養程序up 1800 2200mL/min、hold 5 15s，Down 1800 2200mL/min、hold lmin45s 2minl5s。
8.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於增殖病毒參數 設置為，病毒吸附程序up 2100 2500mL/min、hold lmin50s 2minl0s，Down 2100 2500mL/min、hold 15 25s ；病毒繁殖程序up 1700 2100mL/min、hold 15 25s，Down 1700 2100mL/min、hold lmin50s 2minl0s。
9.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於生物反應器內條件為溫度37°C，二氧化碳濃度2. 5% 5%，溶氧90%以下，pH值7. 0 7. 4。
10.根據權利要求1所述大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，其特徵在於細胞貼附和(或)病毒吸附程序啟動3 4h後置換為細胞培養程序和(或)病毒繁殖程序。
全文摘要
本發明公開了一種大規模生產偽狂犬病毒疫苗的方法，包括下列步驟(a)在具有潮汐式微載體懸浮培養系統的生物反應器中，添加網狀的聚酯纖維作為載體，接種制苗用細胞；(b)培養細胞生長至一定密度，接種偽狂犬病毒，使所述偽狂犬病毒感染細胞；(c)使病毒在適宜的條件下大量增殖；(d)細胞病變達70％以上時收穫病毒；(e)將收穫的病毒液凍融1～2次，使細胞完全脫落、分散，加入凍幹保護劑，混勻，定量分裝，凍幹。該工藝具有穩定性好、過程控制指標明確、可控性強、操作容易、生產規模大等優點。
文檔編號C12M3/02GK101804203SQ20101016655
公開日2010年8月18日 申請日期2010年5月10日 優先權日2010年5月10日
發明者喬榮岑, 習向鋒, 孫進忠, 張海洋, 張許科, 李三, 陶家權, 駱愛芳 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司