胰島素-Fc融合蛋白的製作方法

2023-11-30 06:00:31

胰島素-Fc融合蛋白的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，更具體地，本發明公開了一種胰島素-Fc融合蛋白、其製備方法和用途。本發明公開的胰島素-Fc融合蛋白具有半衰期長，可減少胰島素使用的間隔時間，減少病人的用藥痛苦等優點。
【專利說明】胰島素-Fe融合蛋白
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，更具體地，本發明公開了一種融合蛋白、其製備方法和用途。
【背景技術】
[0002]糖尿病是一種日漸普遍的流行病，據估計，到2025年，糖尿病將影響3億以上的人口，因此急需一種有效的藥物治療方法。2型糖尿病佔所有病例的90-95 %。因血糖水平持續升高引起的併發症包括心血管疾病、腎病、神經病和視網膜病。此外，在2型糖尿病晚期時，胰腺的β細胞死亡，從而停止分泌胰島素。目前對糖尿病的治療會產生多種有害的副作用，其中包括低血糖和體重增加。此外，目前對2型糖尿病的治療並不能治癒這種疾病，而只是延緩時間，直至患者需要接受胰島素治療。
[0003]胰島素這樣的天然或者重組蛋白在水溶液狀態下半保存期通常比較短，由於這些分子製劑的不穩定性使之必須凍幹保存，給運輸和保存帶來不便。[0004]胰島素類的重組治療蛋白的體內半衰期也很短，為了使用藥間隔延長，必須生產體內半衰期長的藥物。

【發明內容】

[0005]本發明公開了一種胰島素-Fe融合蛋白，其通式為
[0006]B-C-A-Fc，其中A為胰島素A鏈，B為胰島素的B鏈，C為4-50個胺基酸的C肽連接序列，優選為6-30個胺基酸，Fe為免疫球蛋白Fe段或其突變體。
[0007]優選地，C為 GGGPGKR、GGGPQT, GGGPGAG, AAGGGPSVR 之一 ；C 可以是天然或者人工序列，序列長度在4-50之間，主要為6-30個胺基酸。天然序列可以通過替代，增減修飾形成人工序列。為了減少免疫反應，C優選包含人血液中的天然人蛋白序列，例如天然胰島素C 肽序列(RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)、IGF-1 C 肽連接(GYGSSRRAPQT)，抗體重鏈鉸鏈區序列(EPKS⑶KTHTCPPCPAP)等。在有些結構中連接序列也可以只包含部分的上述序列，或者替代、增減修飾上述序列中一個或者幾個胺基酸。連接序列可以被增減某個特定胺基酸。但是在一些結構中，連接序列不能包含兩個連續的鹼性胺基酸，例如KK，RR,RK。選擇沒有賴氨酸或者精氨酸的序列，或者選擇沒有酪氨酸的序列作為連接序列。
[0008]融合蛋白序列還包含一個N端的引導序列或者信號肽。例如抗體的信號肽，胰島素的引導序列，酵母a因子信號序列，白蛋白信號肽序列，胰島素樣生長因子結合蛋白4信號肽序列，酸性磷酸酶信號肽序列等等。
[0009]在本發明中，該構造的抗體Fe部分保留了結合蛋白質A的能力並且可以利用蛋白質A親和色譜法進行純化。通過重組方法合成，並且可以代表任何人類或動物抗體的任一亞型。公眾可從某些出版物(例如Kabat, et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest, U.S.Dept.Health (1983) (Kabat 等人,免疫學相關蛋白質序列，美國衛生部，1983年))或在線獲得人和動物免疫球蛋白的序列。抗體的Fe區域通過對其Fe受體結合區域(H235-H236)進行突變例如從亮氨酸突變為丙氨酸，可降低補體結合、抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)以及通過將該二聚體結構的亞區與免疫細胞表面受體(Fcy受體)結合來介導的其他功能。
[0010]融合蛋白的基因可以連入真核表達載體pcdna3.1, pngfpN, PEE144等真核載體，轉染CHO，NSO，SP2/0等細胞進行表達，或者連入pet22，pet32，Pgex等質粒轉染BL21 (DE3)，ROSETTA, AD494等菌株進行表達，或者連入pPICZ等載體轉染畢赤酵母進行酵母表達。
[0011]融合蛋白可以通過proteinA親和層析柱，proteinG親和層析柱以及其它層析柱純化獲得高純度的蛋白分子。
[0012]本發明所述的胰島素-Fe融合蛋白具有胰島素活性，能夠結合胰島素受體，刺激表達胰島素受體的細胞攝取葡萄糖。胰島素-Fe融合蛋白包含通過連接序列連接的A鏈和B鏈,例如胰島素-Fe融合蛋白包括抗體的Fe段或其突變體通過N端或者C端與胰島素類似物連接，其胰島素類似物公式為-B-C-A-，其中C為C肽連接序列。在一些實例中，連接序列為6-30個胺基酸，一般情況下，連接序列可以使A鏈和B鏈形成具有胰島素活性的分子。
[0013]本發明公開的胰島素-Fe融合蛋白為治療性蛋白，可為具有胰島素-Fe融合蛋白活性的胰島素、胰島素類似物以及胰島素片段和突變體與免疫球蛋白及其片段連接形成的融合蛋白，通過與Fe蛋白連接形成的融合蛋白，可以極大的改善胰島素的藥代動力學表現，提高胰島素的體內半衰期，減少胰島素使用的間隔時間，減少病人的用藥痛苦。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1 pDRl表達載體結構示意圖，hCMV表示人巨細胞病毒Major Immediate早期啟動子；BGH pA表不Bovine growth hormone多腺苷化信號；SV40 ori表不SV40病毒早期複製起點；DHFR表示二氫葉酸還原酶基因；pUC origin為質粒複製起點；AMP為氨苄青黴素抗性基因。
[0015]圖2.胰島素-Fe融合蛋白基因結構示意圖；信號肽是指胰島素的信號肽或其他蛋白的信號肽基因，A鏈B鏈分別是指胰島素的A鏈基因和B鏈基因，Fe是指突變後抗體的Fe段基因，C連接序列是指專利中提到的各種連接序列基因。
[0016]圖3.胰島素-Fe融合蛋白結構示意圖，A鏈B鏈分別是指胰島素的A和B鏈，Fe是指突變後抗體的Fe段。
【權利要求】
1.一種膜島素-Fe融合蛋白，其通式為B-C-A-Fc,其中A為膜島素A鏈,B為膜島素的B鏈，C為4-50個胺基酸的C肽連接序列，Fe為免疫球蛋白Fe段或其突變體。
2.權利要求1所述的胰島素-Fe融合蛋白，其中C為6-30個胺基酸的C肽連接序列。
3.權利要求2所述的胰島素-Fe融合蛋白，其中C為GGGPGKR、GGGPQT,GGGPGAG、AAGGGPSVR 之一。
4.權利要求1所述的胰島素-Fe融合蛋白，其中Fe為免疫球蛋白Fe段H235、H236位從亮氨酸突變為丙氨酸。
5.權利要求1-4任一所述的胰島素-Fe融合蛋白，其胺基酸序列為SEQIDNO:2、SEQID NO:4, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10 之一。
6.一種核酸分子，編碼權利要求1-4任一所述的胰島素-Fe融合蛋白。
7.權利要求6所述的核酸分子，其核苷酸序列為SEQID NO:U SEQ ID NO:3、SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:9 之一。
【文檔編號】C12N15/62GK103509118SQ201210198941
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優先權日:2012年6月15日
【發明者】顧娜娜, 郭懷祖 申請人:郭懷祖