用於將物質,特別是分子庫組合合成用單體塗布於支持物的設備和方法
2023-12-01 02:41:31 2
專利名稱：用於將物質,特別是分子庫組合合成用單體塗布於支持物的設備和方法
技術領域：
本發明涉及用於將物質，特別是分子庫組合合成用單體，塗布於支持物的設備和方法，用於對結合於支持物上的分子的光學屬性，更為特別的是發光反應和折射行為的檢測。
此處的術語「分子庫」代表結合於支持物確定位置上的多種各不相同的分子的總和，其中各個各不相同的分子以儘可能緊湊的方式排列。因此，本發明涉及的分子庫更為特別的是通過有限數量單體的組合合成而形成的。組合合成的原理在
圖1中以圖解的形式進行了解釋。
術語「高度複雜」代表了具有103以上不同的典型個體的分子庫，然而，更為特別的代表了具有105以上不同典型個體的分子庫。
該複雜分子庫能夠被特別方便地塗布於二維支持物，藉此，分子庫的每一個成員都可以被定位於支持物上的一個定址精確的位置上。這意味著一個定址精確的反應，例如染色反應，允許對支持物所結合的反應配偶體得到一個精確和唯一的結論。塗布了確定的該分子庫成員的定址精確的位置也被稱為點(spot)，二維支持物上的分子庫的全部也被稱為陣列。
二維陣列可以具有一個光滑的表面，而且該表面基本上不被所用的溶劑滲透。不過，與上述結構相比，它也可以顯示出一個多孔結構，使得其對所用溶劑和要偶聯的物質來說呈現三維狀態。這種類型的支持物是尤其必須的，如果信號強度與具有光滑表面的支持物相比需要被增強。特別是，例如，在一個肽陣列要被用病人血清進行染色，而且相對較弱濃度的抗體反應性的結合信號也需要被檢測的情況下。
隨後的同義術語「二維支持物」或「陣列」既表示不同分子基本上僅以二維形式排列的支持物，也表示不同分子存在於一個附加的第三維度上的多孔支持物，因此不再是真實意義上的(基本上二維的)陣列。
術語「固態聚集態」也包括過冷的液體。
術語「屬性」應該從最廣義的角度進行理解，而且不僅應當包括特定分子的屬性特徵，例如它們的質譜，還應當包括，例如主要僅通過某一特定的反應的出現未展示的性能，使得本發明從而也涉及這樣的方法和設備，對它們來說，通過特定的光學反應最初僅僅能夠斷定某物質的存在，而不能推斷出其類型(物質的類型通過例如其在支持物上的位置進行確定)。
術語「生物的」分子在此引入代表所有類型的分子，特別是在生物學、藥劑學和醫學中相關的分子，因而，例如肽、D-肽、L-肽及其混合物，天然存在的寡聚核苷酸、其鏡象異構體及其混合物，人工衍生的寡聚核苷酸，如那些用於構建aptamer的寡聚核苷酸，寡糖和這些分子的修飾產物。更為特別的，自然界不存在的模式構建的寡聚物可能具有特殊的藥理學相關性。在這方面，特別應當提到的是在化學組合分析的輔助下產生的可以用作生物分子配基的非天然物質，更為特別的是有機化合物，類固醇衍生物等。從許多的這類分子中，可以分離出特定的結合物分子，用於天然存在的分子以修飾該分子的活性。不過，既然這些結合物分子通常不能從天然存在的消化酶中分離，因此它們特別適合用作治療方法。
已經知道各種不同的用於合成高度複雜分子庫的方法，但它們都有某些缺點。已知的方法的實施需要昂貴的特殊裝備，而且在發光信號的讀出速度上相對較慢。特別的，如隨後解釋的具有優勢的不同原因，如果非常多的不同分子基團要被排列在共同的支持物上然後分別進行研究，就需要非常昂貴的機械用於激活每一個分子基團，這樣不僅費用昂貴且易受幹擾，而且在極其精密的操作中會顯示出製造誤差，其大小比足以用於進行研究的分子團的最低限度要大幾個數量級。因此，對於已知的方法和設備來說，支持物所能容納的分子或分子基團的最大數量量是有限的，在數量級上大約為105分子基團。然而，特別是對於某些血清和DNA分析來說，如果約108到109個分子能夠被容納和研究於一個支持物上，將是令人滿意的。
圖2顯示了用於在目前，特別是平板印刷合成方法中作為讀出裝置的共聚焦雷射顯微鏡的原理。可以看出，在該讀出裝置的工作原理中，陣列每一個單獨的點都需要在所有的三個維度上進行搜索，而該過程即消耗時間又降低了精確性。
已經知道平版印刷方法(Lithographische Methode)可以將分子塗布到合適的支持物上，特別是被稱為「診斷晶片」的支持物(圖3)，不過，如在後來的研究中發現的，在非常精確地定位分子以及可重複性有目的激活的支持物位置方面存在的困難限制了可以塗布的分子的最大數量，因為無法在具有可重複的精確性條件下知道哪個分子定位於支持物的哪個位置上，就不足以在支持物上非常緊密的安排大量的不同分子。特別地，在已知的方法和設備中，在一個合理的時間內讀出支持物上的非常多的發光反應並且同時要求相當準確是一個問題。在使用與我們有關的方法和設備進行的方便的染色研究中，所要研究的材料被塗布到固定有不同分子的支持物上，應該能夠得到關於待測材料中各種物質的檢測結論，例如，對於血清中的特定抗體，固定於支持物上的材料分子或其組份和該抗體形成了結合鍵，因此就應該非常準確的知道哪一個分子位於支持物的什麼位置上。
另外，所有已知的平版印刷方法(和其它一些方法，例如，通過可控制的帶電單體的排斥或吸引實現局部的精確合成)還有其它的基本缺陷對每一種不同的單體，幾乎整個的偶聯循環都必須分別進行，即，每一種類型的單體都要被塗布、偶聯以及洗去過量單體，然後再進行下一種類型單體的相同步驟，因此，例如在組合合成層中，每一種情況下每個肽都必須進行20個偶聯循環。該缺點在圖4中進行了簡要圖示。因此，對於一個五肽分子庫，上述方法需要進行100個偶聯循環，藉此，專家可以馬上理解在科技發展的現階段，這對產生的分子庫將會導致嚴重的質量問題，因為每一個偶聯循環中都會產生假象，用這種方法所產生的五肽文庫實際上是不可用的。
這也是為什麼平版印刷方法至今幾乎專門用於寡肽陣列合成的原因，因為在這種情況下，只需要將4種不同的單體偶聯到支持物上。
平版印刷方法的另一個副作用是相對較低的收率，因為對每一個偶聯反應都需要將整個支持物用反應單體進行均一的覆蓋。
除了平版印刷方法，還有許多可用於進行組合合成的印刷方法(圖5、IIa和IIb)。然而到目前為止，這些方法中還沒有一種能達到平版印刷方法的高解析度。這主要是由於溶液中相對較小的單體具有的高擴散率。既然單體和支持物的偶聯反應以及單體塗布到支持物的準確位置都需要一定時間，因此高滲透率就限制了通過組合合成產生的分子庫的緊密度及其複雜程度。
通過與普通彩色噴墨印表機的比較可以清楚的說明上述觀點(圖6)彩色噴墨印表機的色彩鮮明度是通過將不同彩色顆粒的擴散作用控制的儘可能小而實現的。該過程是通過彩色顆粒相對於前述單體的巨大體積，以及含有快速揮發性物質的列印調色劑流體導致彩色顆粒迅速沉澱而實現的。另外，所用的列印紙具有高度吸收性的非常光滑的表面。
這種紙通常具有複雜的結構，因而通常不適合於作分子庫的支持物，而且還有兩點也與將分子庫儘可能緊密的偶聯到支持物上的要求不一致1.用於組合合成的單體相對於彩色噴墨印表機通常所用的彩色生色團來說是非常小的，這種情況單獨作用就大大提高擴散率。
2.不僅被列印的單體不能夠溶於高揮發性的溶劑。甚至幾乎不可能找到一種在所需要的毫微升級範圍內蒸發足夠慢的溶劑，否則的話偶聯配偶體會的濃度就會以不合希望的方式發生改變，因為偶聯到支持物的偶聯反應(以及將單體塗布到支持物準確位置的過程)需要一定的時間。
這也是為什麼所有目前所用的點方法在小尺度範圍塗布中容易產生誤差而且非常昂貴的原因。在這種尺度下，總是會冒著所塗布的點跑得太遠，單體擴散太遠或溶劑部分或全部揮發的危險。
在這個基礎上，對本發明的提出的問題是提供一套方法和設備，通過它們可以克服在支持物分子庫合成中的缺點。
為了解決上述問題提出了一種高度複雜分子庫並行合成的方法，其特徵在於組合合成所用的單體在轉印到支持物上之前或之後溶解於第一種溶劑中，該溶劑在-5℃以下，優選的在20℃以下以固態聚集態狀態存在，而且其汽化點高於100℃，優選的高於150℃。該方法的另一特徵是該固態聚集態狀態可以通過在單體與支持物實際的偶聯反應中提供能量或提供第二種溶劑，在很短時間內優選的被轉換成液態，優選的是凝膠態聚集態。
結果是1.單體的擴散被顯著抑制，而且2.所用的第一種溶劑在單體的塗布過程或偶聯反應過程中被防止發生部分或全部蒸發。
這在如果不同單體塗布到支持物的精確位置的過程需要相當長時間，的情況下是尤其重要的，這種情況下包括，例如，當高度複雜的多肽庫是通過不同胺基酸衍生物的組合合成方法在噴墨印表機的輔助下產生時。
本方法可以非常方便的被實施使得在一個反覆性過程中所述的顆粒或物質被反覆塗布到支持物的精確位置上，在每一種情況下，接著進行上述的被固定物質的活動化(Beweglich-machen)，偶聯物質到支持物，洗去未偶聯的物質以及去掉臨時性的保護基團。如果使用一個經過改進的彩色雷射印表機或彩色雷射複印機，支持物在整個重複性過程中如果相對於印表機或複印機的支承輥或傳墨輥固定不動將是非常方便的。
一個包含許多可有目的控制的光源(gezielt ansteuerbarenLichtquelle)的陣列，特別是一個微雷射陣列，也可以被方便的使用，以代替單雷射。作為電磁波作用於顆粒或支持物的結果，它們被在精確的位置上被帶上靜電荷或被加熱，這樣就會導致顆粒被定址精確轉印或定址精確固定。
如果顆粒含有可用於組合合成單體，雙體或三體的前體，那麼偶聯到支持物上的分子可以被另外的單體、雙體或三體加長，該過程通過偶聯反應的一個或幾個進一步循環完成。同樣也可以通過非必要相同反應的一個或幾個循環來修飾偶聯到支持物上的分子。經過成功的合成以後，保護基可以被從合成的寡聚物上分離下來，而合成的分子仍然結合在支持物上。
顆粒和/或固定的物質可以通過另外的物質被融化或溶解或者變成一種凝膠狀態。
通過電磁波，特別是雷射，或通過施加電壓或提供熱能或提供溶劑以活動化該被固定的物質將是非常有利的。從而使固定物質的活動化過程可以被限制在特定的區域內。沒有被活動化或偶聯的物質可以用一種溶劑、優選的是加熱的溶劑從支持物上洗脫、或用機械方法，特別是在氣流的輔助下從支持物上被去掉。
不同的材料可以用於作為支持物。特別的，聚苯乙烯薄膜、紙、CDs、MODs、DVDs或FMDs都可以被使用。
根據本發明製造的支持物可以被用於科學研究、特別是醫學研究的各種不同的方面。為此目的，支持物通常被用於與待測流體相接觸。該流體可以是，例如、血液、血清、尿液、排洩物、淋巴液、唾液、羊水、胃液、嘔吐物、汗液、精液、乳汁、淚液、含有抗體的流體或者上述流體的提取物。如果待測流體是血清，可以被方便和一種特定的免疫球蛋白檢測試劑相接觸，特別是檢測IgE、IgM、IgG或IgA類免疫球蛋白的試劑。同樣也可以將支持物和待測DNA相接觸。如果檢測DNA或含有免疫球蛋白的流體，在與支持物接觸之前或之後，待測流體或待測DNA和一種可以與免疫球蛋白或DNA反應，特別是形成鍵的材料相接觸將是非常有利的。在與待測流體或待測DNA接觸之前，可以和免疫球蛋白或DNA反應的材料可以用一種可被激活發光的材料進行染色/或偶聯到另外一種可發光的材料上，特別是用酶或發光材料的前體。上述的其他材料可以方便的是酶，特別是辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶或螢光素酶、或各種酶的結合。
作為可激活發光的材料，更為合適的是使用一種可以被電磁波輻射，特別是雷射或發光二極光發射的光波激發螢光的染料。
這樣的研究結果可以有利於病理樣品的系統分類和分節段(segmentation)，特別是有利於確定診斷性標記物，該標記物用於對測試人群的檢驗方法的實施以及確定實驗結果中對正常分布的偏離量。
例如，可以從每個測試者體內採樣取得血清樣品，然後用上述的方法之一檢測這些樣品。相對於正常分布的偏移量可以，例如，對那些在取樣前或取樣後患有癌症、特別是特殊類型的癌症、帕金森氏症、多發性硬化症、阿爾茨海默病、傳染性疾病、自身免疫病、特別是Crohn氏病、或患有心力衰竭或中風或者曾患過敏症或將有變應性疾病的測試者進行確定。
以這種方式得到的實驗結果可以被自動分類以確定信號以何種診斷模式被用於確定與分子庫中相應分子的結構參數的關係，可以發現其相關性，尤其是使獲得對未知樣品模式診斷性評估成為可能的相關性。同樣也可以尋找可用於確定已發現的分子的結構特徵的相關性。如此定義的所發現分子的結構特徵可以被用作指導性結構用於發展其它功能性同源的分子，特別是可用於治療的分子。因此，一個以重疊肽形式覆蓋了已知人類基因產物的肽陣列可以被有利的使用。
在一個附加的方法中，用於組合合成的單體以0.2μm到200μm，優選的2μm到40μm大小的單體調色劑(Toner)顆粒形式被採用，其在室溫下呈現固態聚集態。術語「室溫」描述了一個介於-10℃到80℃的溫度範圍，優選的介於0℃到40℃。這些顆粒的另外一個特徵是使用上述第一種溶劑時它們含有一種相對於偶聯反應來說是惰性的組份，其聚集體狀態可以通過上述的方法改變。優選的該顆粒還含有磁性組分或偶聯到含有磁性組分的顆粒上。在圖7中上述的單體調色劑顆粒和普通的發色團調色劑顆粒進行了圖示比較。
顆粒定址精確地轉印到支持物的過程，使用市售雷射印表機(laserdruker)(圖8)或雷射複印機來完成，更為特別的是彩色雷射印表機(圖9)或彩色雷射複印機，其中負責轉印顆粒的雷射，特別是在使用雷射複印機時，可以被被一維或二維微雷射陣列所替代。
然後，塗布於精確位置的單體，如上所述被從固態聚集態轉換成液態聚集態，優選的是凝膠狀態，藉此，一個定址精確的偶聯反應就開始進行了。
通過這種方法，與現有技術相比，在組合合成方法的輔助下，十分簡便地、分子十分緊密地排列在支構物上從而產生了高度複雜的、相對無假象的分子庫。
雷射印表機的技術特徵將進一步闡明該理論市售雷射印表機Ep具有600dpi(點/英寸，dot per inch)的列印解析度。這相當於每個列印像素的直徑為約40μm，或者說這樣的雷射印表機在普通的列印過程中可以在DIN A4紙上(約20×30cm)輸出約4500×7000個點。這相應於約3千萬個點/DIN A4紙(圖10)。
圖11顯示了這樣的高解析度在普通列印過程中使用普通調色劑可以幾乎無誤差和可重複地「收穫」。實際上，圖11在最大放大率狀態下也沒有顯示出一個錯誤設置的像素。
因此上百萬的點可以容納在一張DINA4的紙上，而且可以被分辨開。不過，這肯定遠遠不到一個明顯處於快速發展階段的技術的終點。目前市售具有2,400dpi解析度的雷射印表機可以在DIN A4紙上輸出約5億個像素，因此可以在一張DIN A4紙上獨立容納更多的點。
因此，市售雷射印表機正照著使具有所有可能代表的五肽或六肽分子庫的合成成為可能的數量級方向發展。相對數量如圖12所示。
在一個可選的附加方法中，用於組合合成的單體被以流體聚集態形式以本領域標準技術塗布於支持物的精確位置上，例如，在一種主要市售噴墨印表機或其它列印方法的輔助下。
為了此目的，一種溶劑混合物被製備出來，在該混合物中除了用於組合合成的單體和上述第一種溶劑(例如，二苯基甲醯胺)外，至少還加入有第二種溶劑(例如，N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、二甲基甲醯胺、甲醇或異丙醇)，該溶劑在室溫下將該組份從固態聚集態轉變為液態聚集態(即，將其溶解)。該室溫條件描述了介於-10℃到80℃的溫度範圍，優選的介於0℃到40℃。
該溶劑混合物的另一個特徵是在室溫條件下上述第二種溶劑與第一種相比是高度揮發性的，即，兩種溶劑的汽化點差大於80℃。
因而上述第二種溶劑的部分蒸發會產生如下效果第一種溶劑和溶於其中的單體首先被濃縮用於組合合成，然後從液態聚集態狀態轉變回固態或凝膠態聚集態，而不會使單體由於擴散從最初的塗布位置移開太遠。支持物最好保持在比盛有該溶劑混合物的保存容器的溫度低10℃以上的條件下。幾乎不揮發的溶劑部分可以在該混合物被塗布於精確位置之前完全或部分塗布於支持物。所用的溶劑對偶聯反應應呈惰性。
然後，在特定位置塗布的單體被由固態聚集態狀態轉變為如上所述的液態聚集態，優選的是凝膠狀態，藉此，局部特異性確定的偶聯反應開始進行。
通過這種方法，一個在組合合成方法的輔助下產生的更為緊密的分子排列得以在支持物上實現，從而產生了與現有技術相比，高度複雜的、相對無假象的分子庫。
本發明包括將單體塗布於精確位置所需要的設備，該單體是用於支持物結合的分子庫的組合合成，特別是肽或寡核苷酸率。塗布單體的各個層的偶聯按如上所述之方法完成。
該單體被聯結於如下所述的顆粒。
該顆粒的定址精確轉印到支持物上是通過一臺基本上基於市售雷射印表機或雷射複印機，特別是彩色雷射印表機或彩色雷射複印機的設備(圖13和14)完成的。負責轉印顆粒的雷射，特別是在使用雷射複印機的情況下，可以被一維或二維的微雷射陣列所替代。
如下的改變使該設備和市售雷射印表機或雷射複印機相區別1.含有所述單體的顆粒，而不是普通的調色劑顆粒，按下面的所述被使用。
2.不僅僅是一層單體顆粒被塗布，而是幾層含有該單體的顆粒層被層疊列印。
3.在每一種情況下，在塗布所述的幾個顆粒層之間，所述的單體被偶聯到支持物上，未偶聯的單體被從支持物上除去，以及臨時性保護基團被從支持物偶聯的單體上分離掉。
4.在塗布最後一層單體之前，支持物相對於負責轉印顆粒的雷射保持一種精確的空間關係，其中只要該空間關係是可重複的就可以了。通過這種方法，層間和層內各種單體顆粒可以重疊或並列被置於精確位置上。該空間關係可以通過反饋裝置(圖14)和/或支承輥或轉印單位和雷射離子化輥(von dem Laser ionisierbaren Walze)之間的精確機械偶聯(圖13)而產生。這兩種方法也可以自然的結合起來使用。
例如，一個位置標記網格(Rastster)(圖14，38)可以被設置於支持物或支承輥(35)，然後用掃描器(圖14，37)讀取再和存貯的網格(圖14，39)進行對比。印表機內存中像素對於測量到的偏差值的電偏移(圖14，40)是上述反饋機制的組成部分。
本發明包括根據本發明產生的材料。這些材料包括可以通過所述的設備被塗布於支持物精確位置上的單體調色劑顆粒，該設備是基於主要市售的雷射印表機或雷射複印機的。這些單體調色劑顆粒與市售調色劑顆粒具有以下不同1.單體調色劑顆粒含有合適的用於組合合成單體或其衍生物，更為特別的也包括預激活單體，而不含有發色團。
2.不含有或除了含有可熔性塑料組份(例如聚苯乙烯)外，單體調色劑顆粒含有對單體及支持物的偶聯反應為惰性的溶劑(例如，二甲基甲醯胺)，其在室溫下處於固態聚集態狀態。術語「室溫」描述了一個介於-10℃到80℃的溫度範圍，優選的介於0℃到40℃。
該單體調色劑顆粒的其它特徵是3.其大小介於直徑0.2μm到200μm，優選的介於直徑2μm到40μm之間。
4.該單體調色劑顆粒在室溫下呈現固態聚集態狀態。術語「室溫」描述了一個介於-10℃到80℃的溫度範圍，優選的介於0℃到40℃。
5.該單體調色劑顆粒的另一個特徵是它們含有磁性組分或與含有磁性組分的顆粒結合。
根據本發明產生的其它材料包括單體調色劑流體，該流體通過使用主要市售噴墨印表機或彩色噴墨印表機可以被塗布於支持物的精確位置上。
這些單體調色劑流體與市售調色劑流體相比具有以下區別1.這些單體調色劑流體含有適用於組合合成的單體或其衍生物，更為特別的也包括預激活單體，而不是發色團。
2.除了含有第一種在室溫下是流體的溶劑組分(例如，異丙醇、二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷)外，該單體調色劑流體至少含有一個第二種對單體與支持物的偶聯反應為惰性的溶劑(例如，二甲基甲醯胺)，其在室溫下處於固態聚集態狀態。術語「室溫」描述了一個介於-10℃到80℃的溫度範圍，優選的介於0℃到40℃。因此該第二種溶劑在室溫條件下是溶解於第一種溶劑中的。
第一種溶劑的一個特徵是其熔點和汽化點與第二種流體的相應熔點和汽化點相比到要比後者低超過40℃，優選的是超過70℃。
第一種溶劑的一個特徵是在低於-80℃條件下，優選的是低於-20℃條件下，該流體變成固態聚集態狀態，而且其具有一個大於40℃，優選的大於70℃的汽化點。
第二種溶劑的一個特徵是在低於-5℃條件下，優選的是低於20℃條件下，該流體呈現固態聚集態狀態，而且其具有一個大於200℃，優選的大於250℃的汽化點。
至少上述兩種溶劑和溶解在其中的單體組成的混合物的一個特徵是在低於-20℃條件下，優選的低於0℃條件下，該混合物呈現固態或凝膠態聚集態。
根據本發明產生的其它材料包括用該方法、材料或設備產生的分子庫，特別是肽分子庫或寡肽分子庫。這些分子庫的特徵是1.它們是通過有限數量的單體的組合合成而產生的，
2.它們以二維陣列的形式存在於合適的衍生載體上，藉此，分子庫的各個單獨組份可以被定址精確的排列。載體的衍生按本領域技術人員熟知的技術完成。
作為分子的支持物，特別是生物分子的支持物，更為特別的是在上述方法之一中使用的支持物，可以使用根據本發明的裝有積分位置標記的細孔網柵(engmaschiges Netz von integriertenPositionsmarkierung)的支持物，使得通過傳統機械方法塗布到支持物的一個待測區域的位置可以用檢測器監控。優選的位置標記的構建應該使得其能夠被光電子掃描系統所檢測。
因而本發明建立全新的診斷可行性，特別是提高了發現診斷性標記物和療法的機會。例如，如果將一個完全的6基體肽分子庫被用於和相當大量的病人血清接觸，而且，例如，利用染色反應方法進行檢測以確定對於哪種肽分子血清組分會發生沉澱，從而可以獲得疾病和被染色肽分子之間的相關性。這是因為每個人在其血清中都具有一個極度複雜的個體抗體反應性模式，該模式特別的反應了其免疫系統和急性、慢性或隱蔽性疾病或已經克服的疾病之間的衝突。很大比例的抗體反應性可以通過對五肽或六肽的特異性結合而確定，藉此，通過對與完全五肽或六肽分子庫的結合反應性進行分析，前述的個體抗體反應性模式可以作為尚未了解的複雜性進行確定。
所稱的完全肽分子庫在圖15中進行了解釋。該完全肽分子庫的陣列中每一個定址精確的點代表了一種肽分子混合物，其確定序列僅在以N表示的位點處有一不同。使用這種肽分子混合物的原因是在一個抗體-肽抗原反應中，被識別的肽抗原需要一定的體積才能被抗體特異性識別。不過，既然在科技發展的現階段還不可能產生一個具有2010個成員的完全的十肽分子庫，所以才使用該混合物。
該陣列的一個方便的用途在圖16(也見例(1.))中進行了圖示說明。一個高度複雜的肽陣列用對照血清和病人血清得到的差異性染色情況一方面產生可以被兩種血清識別的反應配偶體(以及肽序列)(圖16，42)，另一方面產生被病人血清特異性識別的肽分子(圖16，43)。這使得鑑定病人特異性著色模式成為可能。在所給的例子中(圖16及例1)，與引起胃潰瘍的幽門螺桿菌表達的基因產物對應的肽被鑑定出來。這說明該疾病和肽分子模式之間可以在上述陣列輔助下建立相關性。
除了確定的單克隆抗體的表位，該完全肽分子庫也適合於通過血清特徵和被診斷疾病的相關性來追蹤診斷性標記，例如，自身免疫性疾病或過敏症(例如，風溼病、花粉病、哮喘、食物過敏症、紅斑狼瘡、青少年性糖尿病等)、傳染性疾病(例如，流感、流感樣感染、AIDS、肝炎、麻疹、流行性腮腺炎、腦膜炎、胃潰瘍、瘧疾、南美洲錐蟲病等)、癌症(例如肺癌、肝癌、腸癌、腎癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質母細胞瘤、淋巴癌等)、和迄今未知或病因可疑的特殊性疾病(如，心臟病、中風、帕金森氏病、多發性硬化症、阿爾茨海默病、克羅恩病、克-雅病等)。
另外，本方法並不局限於單一疾病，非常多的疾病可以並行診斷，或者目前尚未知道的病因的疾病可以利用被鑑定的肽進行追蹤。
該陣列也適合用於尋找相互作用配偶體，例如，在這種情況下該完全分子庫染色可以用於人類或病毒基因產物的相互作用配偶體。例如，用純化的病毒粒子進行染色，一個或多個結合基序可以被快速的鑑定出來，而且通過將相應序列與資料庫中的人類肽序列進行比較，可以鑑定出病毒進入人類細胞的入口位點。
更長的結合基序，特別是那些經常發生的具有螺旋結構結合基序，可以通過特定的分子庫被查明，在該分子庫中並不是每個胺基酸都是隨機的，而是只有位於來源於該結構特定位置的胺基酸是隨機的。通過這種方法，新的診斷性標記物和目前未知的相關性可以在疾病和特定抗體反應性之間被找到，包括例如，用於腫瘤疾病、心血管疾病如心肌梗塞的標記物，用於多發性硬化症和帕金森氏病的標記物，用於所有類型的自身免疫性疾病和過敏症的標記物和用於所有類型的傳染性疾病的標記物。
獲得的標記物的特徵可以一方面通過與特定臨床症狀的相關性進行診斷性預測。但最新發現的標記物也可以被單獨塗布到支持物上以進行進一步的研究。
同樣的也適用於稱為單基因產物陣列的塗布。人類具有平均編碼約500種胺基酸的約100,000個基因。在幾年內這些基因中超過90％都會被人們所了解。如果每一個基因產物被平均100個重疊15肽分子所覆蓋，而其中每一個肽分子彼此之間被替換掉5個胺基酸，那麼就需要約1千萬種不同的肽分子以覆蓋人類所有的基因產物。這樣的陣列在圖17中進行了圖示。
中等目標也可以採用每個肽覆蓋人類基因產物的一部分的表達陣列的形式，例如，「致癌基因陣列」、「免疫基因陣列」等。
如上面對完全肽文庫所描述的，這些陣列特別適合用於分析自身免疫疾病病人的血清抗體特徵(見上)。預期可以得到特別清晰的信號，因為這裡使用了個體確定性和相對較長的肽的陣列。
這些陣列也特別適合用於分析病因不明病人的血清。這些陣列可以，例如，回答關於多發性硬化症或帕金森氏病或不同癌症是否具有自身免疫成分的問題。的，這些陣列特別適合作為這些疾病的診斷工具。
如上面所描述的，該陣列也可以用於尋找相互作用配偶體，從而，例如，有助於回答關於哪種人類基因產物是特定病毒的入口位點的問題。
類似的，也進行了疾病和與其它分子文庫例如D-肽文庫或寡糖文庫的結合模式相關性的嘗試。該方法不局限於人類疾病，也適合於檢查法醫學和獸醫學問題以及分析從植物提取液到微生物提取液的其它流體。
在另外一個用途中，感興趣的潛在治療性分子，例如，不能被人消化性酶類所降解的D-肽類被排列在支持物上，然後與醫學相關分子，特別是病原體特異性蛋白或其混合物相接觸。這樣就允許對這些醫學相關分子對應的結合配偶體進行特異性而且快速的搜尋。類似的，也可以用於尋找酶配基、酶底物類似物酶式抑制因子。
最後，與醫學相關分子的結合也可以用，例如，生物素醯化或螢光標記的方法進行檢測，從而使得與病原體至少部分結合的D-肽類或aptamer可以被鑑定。然後這些D-肽類或aptamers可以被一個接一個的測試以確定它們是否抑制該病原體。例如，如果病原體的一種酶類(例如，HIV蛋白酶、逆轉錄酶等)以適當的量存在，這種酶就可以被螢光標記(直接標記或在抗體輔助下標記，或被一個可用單抗染色的小肽標記物的重組表達所標記)。從而就可以確定它結合了哪種D-肽類。然後由酶活性引起的其它染色反應被進行。例如，HIV蛋白酶的切割作用可以沉澱一種可被檢測的螢光多肽。因此我們獲得了不僅結合酶而且同時抑制該酶的D-肽類。
這樣陣列的方便用途在圖18中進行了圖示。這使得酶類可以通過兩種方法檢測。
1.結合該酶(圖18，44)但不阻斷其活性的肽類的鑑定和，2.結合該酶同時阻斷其活性的肽類的差異性鑑定。後者的D-肽類分子組件尤其適合用作潛在療法的組成部件。
在下一個步驟中，具有抑制效應的結合組件可以通過其它的單體或彼此結合而被延長，然後再進行對抑制作用的其它檢測。
為了確定分子被添加到哪一個結合在支持物上分子上，在支持物與血清或DNA接觸之前或之後，可以將血清或DNA和一種可以與該血清或DNA反應，特別是可以形成偶聯鍵，的物質相接觸。更為合適的，在與血清或DNA接觸前，和血清或DNA反應的物質先用一種可以被激發光的物質，特別是一種可以被雷射激發發射螢光的物質對其進行染色。這樣的染料在市場上可以買到，例如，名稱為「Cy3」、「Cy5」、「FITC」或「TRITC」的染料，目前整個系列的這種抗體的結合物已經可以方便的得到(例如，結合Cy5羊抗人抗體)。
如果待測血清和一種對IgE特異性的檢測試劑相接觸，那麼很有可能可以確定病人體內存在的過敏性反應，因為IgE在體內負責如哮喘或花粉熱之類的過敏反應。非過敏患者的血清內幾乎沒有IgE，而過敏患者的血清內則有不同數量的IgE，數量的差異可以揭示不同的變態反應原。最後，本發明使得尋找來源於高度複雜分子庫的一個目標分子的特定結合配偶體成為可能，而且通過同步的鑑定許多(具有不同結合能力)的結合配偶體使得，尋找負責將配基結合到目標分子的結構參數成為可能。用這種方法，指導結構的路徑就被大大簡化了。例如，用上述方法獲得的信號模式可以被自動的與所用文庫中已鑑定配基的結構參數或結構模型相關聯。
上述方便的塗布絕不僅限於肽陣列或對血清的檢查。此外，在總是可以方便的檢測大量的用於結合的結合配偶體的情況下，還會有豐富的其它可能的塗布。這特別適用於兩個分子庫的組合，其中一個分子庫代表該陣列，而血清只是第二個文庫可用的許多對象之一例子。結合配偶體基於其在陣列中的位置在該陣列中被鑑定，而其他方便的檢測方法，例如質譜可以被用於鑑定第二個結合配偶體。
隨後，與根據本發明的方法的實施以及根據本發明的設備的使用相關的一些例子參考附圖進行了描述。
附圖如下所述圖1組合合成I. 適合於組合合成的物質(2)被塗布於支持物(1)II. 各種不同的物質(2)被偶聯到(11)支持物(1)III.未發生偶聯的物質(2)被洗去IV. 保護基(14)被分離V. 更多物質(2)被塗布於支持物(1)，開始下一個循環。
圖2共聚焦雷射顯微鏡作為陣列的讀出器原則如果陣列用共聚焦顯微鏡進行評估，那麼所有三個維度空間都必須被搜索直到所需信號可以被唯一確定為止。與此相比，例如，一個掃描器，要快得多1.它不只有一個可用雷射，而是與一個一維發光二極體陣列並行使用。
2.既然發光二極體的光幾乎平行透射支持物，那麼用掃描器時第三個維度上的搜索就不再必要了。
圖3用於組合合成的平版印刷方法。
在傳統的平版印刷合成方法中，通過光能(圖3，I.)作用或光能敏感保護基團斷裂(圖3.II.)作用，使活化的單體可以接近合成位點，藉此，可能進行位點可確定的鏈增長反應。這兩種方法的的一個優點是它們都具有高解析度。而它們的一個缺點是整個合成循環是在犧牲質量的代價下對每種單體一輪一輪的進行。
Ia.經過光能(16)作用後，一個光敏保護層被定址精確地(18)上被除去。
Ib.用這種方法，用於組合合成的單體(2)可以被被定址精確地(18)偶聯(11)到支持物(1)。
IIa.經過光能(16)作用後，光敏保護基團(16)被被定址精確地(18)分離下來。
IIb.用這種方法，用於組合合成的單體(2)可以被定址精確地(18)偶聯(11)到支持物(1)。
圖4用於合成的平版印刷方法的缺點在所有的印刷方法中，整層的不同單體(2)通常都被塗布於支持物(1)上，它們都是在下一層單體被印上之前通過一個偶聯循環完成的。在圖3所示的用於合成的平版印刷方法中，每一種單體(2)都必須被分別按順序塗布、偶聯(11)以及洗去過量單體。這意味著對於相同的寡聚物陣列的合成，平版印刷合成方法必須比列印過程多進行Nx個偶聯循環。數字N在這裡代表不同的單體(2)數量，即，對於寡肽陣列合成，平版印刷合成法與列印方法相比需要多20x個偶聯循環。
圖5用於組合合成的列印方法(Druckverfahren)Ia.含有適合於組合合成的物質(2)的調色劑顆粒或轉印單元(19)被定址精確地(18)塗布於合適的衍生載體(1)的上。
Ib.然後，用於組合合成的單體(2)被從調色劑顆粒或轉印單元(19)中釋放出來，接著定址精確地(18)偶聯(11)到支持物(1)上。
IIa.含有適合於組合合成的物質(2)的流體被定址精確地(18)塗布於合適的衍生載體(1)上。
IIb.然後，用於組合合成的單體(2)被尋址精確地(18)偶聯到支持物(1)上。
IIa和IIb描述了標準技術的用於組合合成的列印方法。Ia和Ib描述了本發明的新的方法。它結合了列印方法和平版印刷方法的優勢。這裡，如在平版印刷方法中一樣，雷射的高解析度也被用來獲得密集的分子庫。另一方面，如同在其他的列印方法中，整層的不同單體可以被並行的塗布到支持物上。
圖6單體定點的缺點當紙用染料列印時，被列印的發色團必須儘可能少的擴散，因為這會干擾被列印圖片的鮮明度。這可以通過使所塗布的發色團非常快速的固定於列印點上來實現，快速固定是在調色劑流體中使用高揮發性組分的結果。此外，所用的發色團相對較大，也相當程度上限制了其擴散速率。另外，使用了特殊的具有高吸收性的高度光滑的紙張。
然而，所塗布的單體(用於組合合成)會發生很大程度的擴散，因為用於合成的溶劑具有非常低的揮發性而且需要較多時間偶聯反應配偶體。所用的單體相對也較小，這也會大大提高其擴散速率。特殊紙張一般不適合用作分子庫的支持物。
圖7普通調色劑(46、47、48)和「胺基酸調色劑」(46、49、2、50)的顆粒圖示比較-室溫下普通調色劑中的固體聚苯乙烯小球(47)的對應物在這種情況下是熔點約為71℃的二苯基甲醯胺(50)。
-兩種情況下的磁性組分(46)由磁性顆粒控制。
-胺基酸調色劑含有活化的胺基酸(49、2)而不是發色團，該活化胺基酸在N-末端有保護基。
圖8雷射印表機的運行方式由含有磁性組分的聚苯乙烯小珠組成的調色劑顆粒(19)由於磁性組分的作用而附著到磁力輥(21)上。在那裡它們被帶上靜電荷，然後作為帶電的結果跳躍到一個雷射可記錄的滾筒(22)的定址精確區域上。這些區域是通過雷射而確定的，雷射通過開關的打開和關閉而記錄下特定區域。作為電荷吸引力的結果，調色劑顆粒(19)從磁力輥(21)跳躍到被雷射所記錄的滾筒(25)特定區域上。從這裡調色劑顆粒再次跳躍到支持物(24)(例如，紙或複印膜)上並且被一個加熱壓光輥(25)所熔化或在用胺基酸調色劑顆粒的情況下，吸收的物質被活動化(26)。
圖9彩色雷射印表機的運行方式與黑白印表機(圖8)類似，對於彩色雷射印表機調色劑顆粒也是由聚苯乙烯和磁性組分所組成。它們由於磁性組分的作用而附著到一個磁力輥(21)上。在那裡它們被帶上靜電荷，作為帶電的結果跳躍到一個雷射可記錄的滾筒(22)的定址精確區域上。這些區域是通過雷射而確定的，雷射通過開關的打開和關閉而記錄下特定區域。作為電荷吸引力的結果，調色劑顆粒(19)從磁力輥(21)跳躍到被雷射所記錄的滾筒(25)特定區域上。從這裡調色劑顆粒在跳躍到支持物(24)(例如，紙或複印膜)上並且被一個加熱壓光輥(25)所熔化或在胺基酸調色劑顆粒的情況下，吸收的物質被活動化(26)。
與黑白雷射印表機不同(圖8)，彩色雷射印表機必須不僅列印一種調色劑(20)顆粒，而且是以精確的彼此緊挨的方式列印4種不同的彩色調色劑(31、32、33、34)顆粒(20)。
解決此問題的方法之一在圖9中進行了圖示
-所用的雷射可記錄滾筒(22)比黑白雷射印表機所用的(圖8)要大得多-按這種方式雷射可以在滾筒上記錄一整張紙的內容-雷射用第一種顏色在雷射可記錄滾筒(22)上進行記錄-磁力輥(21)將第一種顏色的調色劑(21、31)轉印到可記錄滾筒(22)上-在那裡調色劑顆粒(21、31)跳躍到已記錄的可記錄滾筒(22)上-可記錄滾筒(22)以機械方式非常緊密的和同樣大的第二個滾筒(35)結合在一起-在這個滾筒(35)上支持物(1)被塗布並固定-兩個滾筒(22和35)以相反方向轉動-從而使第一種調色劑(27)被轉印到固定於滾筒(35)的支持物(1)上-雷射用第二種顏色在可記錄滾筒(22)上進行記錄-然後另外交變的磁力輥(21、32、33、34)移向可記錄滾筒(22)-從而將其它的顏色(28、29、30)轉印到可記錄滾筒(22)上-在那裡其它的顏色(28、29、30)被轉印到支持物(1)上-只有到整個列印過程完成後，支持物才會被釋放一個被稱為轉印單元的裝置可以被用來代替支承輥(35)，該轉印單元以反饋機制不斷的相對於可記錄滾筒而進行調整。
圖10市售雷射印表機具有600dpi的解析度，即，被該裝置列印的每個點具有約40μm的直徑。
圖11一個可買到的具有600dpi解析度印表機的列印圖像用一個可買到的具有600dpi解析度的掃描儀進行掃描。這裡被掃描的雷射列印圖像的掃描結果有代表性的顯示了在更高放大率下也沒有錯置的點。
圖12組合肽文庫的複雜性。
圖13用於組合合成的裝置。
不像圖9中所描述的彩色雷射印表機，在這個裝置中熱輥筒(25)被一個可以將氣態或液態的偶聯反應物或清洗溶液帶到旋轉支承輥(35)，並使之接觸的設備(36)所代替。氣態物質(也包括熱空氣)在一個寬噴嘴的輔助下進行供給，而流體與固定於支承輥(35)上的分子庫的支持物(1)相接觸則是通過，例如使用無極皮帶進行(36)。一行紅外光源(36)也可以被用來激活物質(2)。具有四種不同顏色調色劑(31，32，33，34)的交變磁力輥(Wechselmagnetwalze)(21)被替換為具有20種不同胺基酸調色劑(2，19)的交變磁力輥。
圖14用於組合合成的具有內置反饋機制的裝置掃描單元(37)掃描塗布於支持物(1)或支承輥(35)的模式(38)，然後將其和以前保存的相同的模式(39)進行比較。如果與預期值產生了偏差，則加載到印表機內存中的圖像，將電偏移該偏差(40)。通過這種方法轉印單元(19)或其中含有的物質(2)可以被可重複地定址準確地並列或重疊印刷。
圖15完全的肽分子庫所示的十聚體混合物的陣列可以在上述的方法的輔助下合成到支持物上。以N表示的所有可能的胺基酸組合都被該陣列所覆蓋。
圖16疾病與肽分子模式的相關性用對照血清和病人血清對高度複雜的肽陣列的差異性染色一方面產生可以被兩種血清(42)識別的肽(和肽序列)，另一方面產生被病人血清(43)特異性識別的肽。這使得鑑定病人特異性染色模式成為可能。在所給的例子中，與表達的幽門螺旋桿菌基因產物對應的肽被鑑定出來(43)，該細菌會引起胃潰瘍。
本方法並不局限於單一疾病，可以用於同時診斷幾種疾病，或者利用被鑑定的肽分子對目前未知的病因進行的追蹤。
圖17基因產物陣列，單基因產物陣列約100,000個人類基因(即，基因組)中每個基因編碼了平均略少於500個胺基酸。幾年內這些基因中的大部分將被了解。每一種相應的基因產物可以被平均100個重疊的15基體的多肽分子所代表，這些多肽之間相互被有5個胺基酸的偏差。因而總體上需要約1千萬種不同的多肽分子以覆蓋全部100,000種人類的基因產物(即其proteom)。
圖18搜索酶抑制因子兩種不同的檢測酶的方法可以被使用a.鑑定和酶(44)結合但不阻斷其活性的多肽。
b.差異性鑑定與酶結合同時阻斷其酶活的多肽(45)。後者D-多肽的組件適合作為潛在治療方法的組成部件。
圖19普通商業性調色劑和各種「胺基酸調色劑」列印質量的比較各種調色劑被加載到調色劑盒中，然後用雷射印表機在普通紙上列印。胺基酸調色劑用其中含有的磁性顆粒進行著色。
圖20賴氨酸和其後的天冬氨酸被成功的均勻偶聯到衍生紙的游離氨基基團上。然後兩種不同肽分子以棋盤方式被合成於衍生紙的支持物上。用這種方法產生了與圖20所示的胺基酸1到10對應的胺基酸調色劑。在圖20中標記的胺基酸1到5被以常規的橢圓型模式11進行列印，而標記的胺基酸6到9則以第二種常規的矩形模式12被列印。兩種模式以棋盤方式互相結合。在最後一個步驟中，N-末端胺基酸天冬氨酸均勻的與支持物再次偶聯，然後分離保護基。
在(A)中所示的多肽合成位點與(B)中可見的灰色橢圓或矩形對應。條形紙用奶粉在PBS溶液中進行封閉，然後和抗-FLAG M1抗體或抗生物素抗體一起溫育。結合的第一種抗體用過氧化物酶偶聯的羊抗鼠抗體(底物13)或鹼性磷酸酶偶聯的羊抗鼠抗體(底物14)進行檢測。
圖21將具有DMTr保護基的核苷在5`羥基末端偶聯到固定於固體底物的NH2基團上。
圖22在寡聚物合成中常用的保護基(用於鹼基和磷酸基團)。
圖23未反應5`羥基末端的「加蓋」。
圖24三價磷酸基團的氧化。
圖25根據權利要求1的方法的圖示說明。
a)彩色雷射印表機到寡聚體合成機的轉變(圖13)將市售彩色雷射印表機的程序控制在如下方面進行修改-偶聯到支承輥(或轉印滾筒)的支持物(特別是用於肽分子合成或寡肽分子合成的主要由聚苯乙烯組成的衍生拷貝膜或用於肽分子合成或寡肽分子合成的衍生紙)保持固定於支承輥(或轉印滾筒)的狀態，直到外部信號終止其對支承輥的固定狀態。
-用24個不同的附有調色劑容器的交變磁力輥代替4個不同的附有調色劑容器的交變磁力輥，在可記錄滾筒附近起控制作用。
可選的，轉印單元也可以順次用於6臺改裝的彩色雷射印表機中，其每一個含有4個不同的調色劑容器。因此，一層中總共24種不同的調色劑顆粒被塗布於轉印單元。根據設備的不同，在事先測量雷射定位，在列印過程中予以考慮。
另外，一臺由如下部分組成的外部設備被構建-一個加熱單元，特別是使用紅外光能或熱空氣鼓風機(heiβluftfon)進行加熱-一個旋轉滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時間程控的方式被轉印到固定於支承輥或轉印單元上的支持物上-一個旋轉滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時間程控的方式被從固定於支承輥的支持物上導出b)另一臺彩色雷射印表機到寡聚體合成機的轉變(圖14)支持物被固定於可買到的彩色雷射印表機轉印滾筒的無極皮帶上。在支持物上，特別是在轉印單元上，裝有可以被光電掃描儀單元所識別的結構，該結構允許轉印單元的位置以及固定於其上的支持物的位置相對於負責以反饋機制轉印調色劑顆粒的雷射的位置進行調整。
另外，一臺由以下部分組成的外部設備被構建-一個加熱單元，特別是使用紅外光能或熱空氣鼓風機進行加熱-一個槽，利用它各種不同的流體能夠以時間程控的方式被轉印到固定於轉印單元的支持物上-一個旋轉滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時間程控的方式被從固定於支承輥的支持物上導出。
所述的具有固定於其上的支持物的轉印單元可以在每偶聯循環之間被從所述的其它彩色雷射印表機中移去，然後裝入到所述的其它外部設備中。在各種不同的流體被導入和導出後，使用光電掃描儀單元，將轉印單元相對於轉印調色劑顆粒的雷射的位置進行精確重調。
c)胺基酸調色劑的製備用保護基，特別是fMoc保護基保護的各種胺基酸，特別是其相應的酸酐和磁性顆粒一起在75℃條件下被溶解於二苯基甲醯胺中，驟然冷凍然後充分磨碎，以產生儘可能均一的顆粒，該顆粒直徑約1-200μm，特別是5-40μm。這些顆粒被裝填到調色劑盒中然後列印到紙上。圖19比較了普通調色劑和各種胺基酸調色劑的列印質量。
d)亞磷醯胺調色劑顆粒的製備不同的具有保護基的亞磷醯胺和磁性顆粒一起在25℃條件下被溶解於二苯基甲醯胺/乙腈中，驟然冷凍然後將可溶性組分在低溫下升華。將得到的產物進行充分研磨以產生儘可能均一的顆粒，該顆粒直徑約為1-200μm，特別是2-40μm。這些顆粒被裝填到調色劑盒中然後列印到紙上。
e)用雷射印表機合成多肽陣列在例(c)中描述的胺基酸(也見於圖19)被用於合成以棋盤方式相互嚙合的兩種肽模式(Peptidmustern)。首先將紙按照標準方法用游離氨基基團進行衍生。然後將另外兩種胺基酸按照標準方法均一的結合到紙上。使用例(c)中描述的分別的胺基酸調色劑，一個棋盤模式的橢圓和更換調色劑盒後一個互相嚙合模式的矩形被列印到衍生紙上。總共5層胺基酸被列印，每一層列印後都接著進行包含於胺基酸調色劑中的具有保護基團的胺基酸的偶聯反應以及N-末端保護基團的去除。在另一個步驟中，最後一個N-末端胺基酸按照標準方法被均一的偶聯，然後按照標準方法進行位於多肽鏈側鏈上的保護基的去除。在該方法中，兩種以棋盤方式互相嚙合的多肽(N-末端)-DYKDDDDK-(支持物)和(N-末端)-DDEETTDK-(支持物)被合成。
f)按照標準方法用雷射印表機合成的多肽模式的檢測例(e)中所描述的偶聯有兩種棋盤嚙合多肽模式的衍生紙被切成小片，然後，首先用合適的水相溶液，例如2％的奶粉PBS溶液對非特異性偶聯進行封閉。將兩種不同的單克隆抗體(來源於鼠)也用同樣的緩衝液稀釋。然後，將不同的紙片用兩種單抗中的一種通過輕微振蕩60分鐘進行著色，然後洗滌三次。偶聯到酶上的羊抗鼠抗體被稀釋於2％奶粉PBS溶液中；將支持物用得到的溶液通過輕微振蕩60分鐘弄溼，然後洗滌三次。圖20顯示了用不同的酶底物對紙片的染色結果單克隆鼠抗體FLAG M1(Sigma)特異性識別用雷射印表機產生的矩形棋盤多肽模式的多肽(N-末端)-DYKDDDDK-(支持物)。
g)利用改裝的彩色雷射印表機合成完全5肽分子庫將一個合適的平面支持物按照標準方法用游離胺基酸基團進行衍生。紙或基本上由聚苯乙烯組成的拷貝膜特別適合於此方法。利用為專家所熟悉的標準的無水條件下fMoc多肽合成方法，一個合適的間隔子，特別是2-3個胺基酸長度的間隔子，首先被合成於支持物的游離氨基基團上。隨意的2或3個其它的被偶聯的胺基酸層，優選的是19或20種不同胺基酸(即，任選地不含半胱氨酸)混合物，可以按照標準方法被加到該間隔子上。然後，衍生的支持物被固定到例(a)或例(b)中所描述的經過改進的彩色雷射印表機的支承輥或轉印單元上。
在例(a)或(b)中所描述的經過改進的彩色雷射印表機的調色劑容器含有如例(5)所述的各種胺基酸調色劑。
然後列印過程被起始，使得特別是19或20種胺基酸調色劑基本上按照普通彩色雷射印表機的運行原理被並列列印到精確位置上。從而使支持物被分為19或20個分離的、定址準確的區域。接著被列印於精確位置的活化胺基酸，特別是胺基酸酸酐的偶聯反應在約65℃條件下進行5-30分鐘。在該過程中具有牢固固定於其上的衍生支持物的支承輥(或轉印滾筒)在一行紅外燈照射下勻速轉動，這些紅外燈在例(a)或例(b)中被描述為加熱單元。
然後，在例(a)或例(b)中描述的未轉化的胺基酸調色劑被洗掉，fMoc保護基團被按照標準方法分離去掉，再次洗滌後，用例(a)或例(b)中描述的加熱單元將支持物烘乾。在這段時間中支持物保持牢固固定於支承輥(或轉印滾筒)的狀態，該滾筒在整段時間內都在勻速轉動。
然後列印過程被再次起始，使得19或20種不同的胺基酸調色劑也再次以並列或重疊方式被列印到精確位置上。這次支持物被優選的分為192或202個定址精確的區域。如剛才所述的，活化的胺基酸被偶聯到支持物上，未轉化的胺基酸調色劑被洗去，以及fMoc保護基團被去除。
再進行3次類似的列印過程，從而將支持物優選的分為195或205個定址精確的區域。任意的2或3層被偶聯的胺基酸，優選的是19或20種不同胺基酸(即，半胱氨酸可以任選省略)混合物，可以被加到游離的氨基末端。
最後，所有的保護基，包括那些側鏈上的保護基被用10％矽烷三氟乙酸溶液分離除去，支持物用DMF和甲醇進行洗滌和乾燥，使得具有，例如，205＝3,200,000個不同區域的支持物產生於最後的作用中，其中每一個不同的區域代表了所有可能天然存在的C-末端偶聯的五肽之一。
h)利用改進的彩色雷射印表機在支持物上合成完全的12聚體的寡聚核苷酸庫如例(d)中所描述的，產生4種不同的亞磷醯胺調色劑顆粒，優選的含有用於寡聚核苷酸合成的4種不同的活化單體。這些調色劑被加載到調色劑容器中，然後被用一臺改進的彩色雷射印表機列印到如例(a)或例(b)中所描述的載體上。
如例5中對完全5肽分子庫合成進行的描述，一種按照標準方法生產的具有游離氨基基團(或羥基基團)的合適的支持物被使用。如果沒有作為第一步反應的結果而存在，一種合適的接頭在被專家所熟悉的無水條件下按照標準合成方法被合成到游離氨基基團(或羥基基團)上，它可以再次將游離氨基基團(或羥基基團)固定於支持物上，不過這次這些基團距離平面約有22個原子遠。
如例5中對完全5肽分子庫合成進行的描述，位於四種不同的亞磷醯胺調色劑顆粒中的單體在被四唑活化後通過加熱單元的作用被活動化。然後它們偶聯到支持物2-10分鐘。
在標準條件下的用於寡聚核苷酸合成的活化亞磷醯胺(具有保護基)偶聯到固體支持物上，保護基的去除和洗滌步驟為專家所熟悉。
如例(g)中所描述的，未轉化的亞磷醯胺調色劑按照例(a)或(b)中的描述被洗去，DMTr保護基按照標準方法從亞磷醯胺的5`末端被分離掉，再次洗滌，然後如例(a)或(b)中的描述用加熱單元乾燥支持物。在這段時間裡，支持物保持牢固固定於支承輥的狀態。
所用的保護基的例子有-用於亞磷醯胺5`末端保護的4`，4`-二甲氧三苯甲遊基氯(DMTr)(圖21)-用於腺嘌呤和胞嘧啶鹼基保護的苯甲醯基(圖22)-用於鳥嘌呤鹼基保護的異丁醯基(圖22)-用於磷酸基團保護的加氧基或β氰乙基(圖22)在單體被偶聯到支持物以後，在每一步驟中保留下來的所有游離5`羥基被「加蓋」使得它們不能夠參與以後的反應(圖23)。三價磷酸基團被氧化的最後步驟結束了合成循環(圖24)。
在DMTr保護基從亞磷醯胺的5`末端被分離後，支持物在下個步驟中如例(g)中所描述的被再次列印，使得支持物這次被分為42個獨立的區域。16種可能的二聚體核苷酸存在於每一個這樣的獨立區域中，這些核苷酸通過間隔子以3`末端偶聯到支持物上，其5`末端具有一個游離的羥基基團。
該過程總共被重複10x次，每次都使用，例如，全部四種活化的亞磷醯胺，使得上述的16個獨立的區域被分為總共412個定址精確的區域，在每個合成步驟中，按如上所述對保留的游離5`羥基末端「加帽」後，進行三價磷酸基團的氧化以及用TCA去除DMTr保護基。
上面描述的合成方法與專家所熟悉的標準寡聚核苷酸合成方法一致。不象所熟悉的標準合成方法，寡聚核苷酸被固定在固體支持物上，使得在最後保護基被全部分離後，它們不會被從支持物上被分離掉，而是保持偶聯於支持物的狀態。
最後，所有保護基被用二氯甲烷和三氯乙酸分離掉，支持物用乙腈洗滌過後進行乾燥，從而在最後的作用中具有412＝16,777,216種不同區域的支持物被產生出來，每一個區域代表了所有的通過3`末端偶聯的12基體寡聚核苷酸之一。
i)用噴墨印表機合成肽陣列各種不同的具有保護基團，特別是具有fMoc保護基團的胺基酸，及相應的酸酐和異丙醇或NMP和二苯基甲醯胺一起進行溶解。該流體被倒入多色調色劑盒內，放入一臺基本上可買到的彩色噴墨印表機內，然後按照例(g)中描述的方法列印到紙上。
所述的噴墨印表機事先被按照例(a)或例(b)中描述的彩色雷射印表機類似的方法進行改進，使得支持物在重複的列印循環中相對與列印頭(Druckkopf)保持固定，藉此，優選的使用一個旋轉的支承輥。如例(a)或例(b)中所描述的，一臺外部設備被構建並由以下部分組成-一個加熱單元，特別是使用紅外光能或熱空氣鼓風機進行加熱-一個旋轉滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時間程控的方式被轉印到固定於支承輥的支持物上-一個旋轉滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時間程控的方式被從固定於支承輥的支持物上導出將一個合適的平面支持物按照標準方法用游離氨基基團進行衍生。紙或基本上由聚苯乙烯組成的拷貝膜特別適合於此方法。利用為專家所熟悉的標準的無水條件下的fMoc多肽合成方法，一個合適的間隔子，特別是2-3個胺基酸長度的間隔子，首先被合成於支持物的自由氨基基團上。任意的2或3個其它的被偶聯的胺基酸層，優選的是19或20種不同胺基酸(即，可以任意的省略半胱氨酸)混合物，可以按照標準方法加到該間隔子上。
然後支持物可以任意的被二氯甲烷和二苯基甲醯胺的混合物所浸泡。二氯甲烷在轉印過程中被蒸發，藉此，衍生紙被固定於支持物上，該支持物可以相對於上述改進的彩色噴墨印表機的列印單元而被移動。
然後列印過程被起始，使得特別是19或20種不同的胺基酸調色劑基本上按照普通噴墨印表機的操作原理被並行地定址精確地列印。這樣，該支持物被劃分為19或20個相互獨立的，定址精確的區域。接著被列印於精確位置的活化胺基酸的偶聯反應在約65℃條件下進行5-30分鐘。在該過程中具有牢固固定於其上的衍生支持物的支承輥在一行紅外燈照射下勻速轉動，這些紅外燈在例(a)或例(b)中被描述為加熱單元。
然後，未轉化的胺基酸調色劑在上述滾筒的輔助下被洗掉，fMoc保護基團被按照標準方法分離去掉，用上述的加熱單元將支持物烘乾。在這段時間中支持物保持牢固固定於支承輥的狀態，該輥在整段時間內都在勻速轉動。
然後列印過程被再次起始，使得19或20種不同的胺基酸調色劑再次以並列或層疊的方式被列印到精確位置上。通過這種方法使得這次支持物被優選的分為192或202個定址精確的區域。如剛才所述的，活化的胺基酸被偶聯到支持物上，未轉化的胺基酸調色劑被洗去，以及fMoc保護基團被去除。
再進行3次類似的列印過程，從而將支持物優選的分為195或205個定址精確的區域。任意的2或3層其它偶聯的胺基酸，優選的是19或20種不同胺基酸(即，半胱氨酸可以隨意省略)混合物，可以按照標準方法被加到該陣列的游離的氨基末端。
最後，所有的保護基，包括那些側鏈上的保護基被用10％矽烷三氟乙酸溶液分離除去，支持物用DMF和甲醇進行洗滌和乾燥，使得具有，例如，205＝3,200,000個不同區域的支持物產生於最後的作用中，其中每一個不同的區域代表了所有可能天然存在的C-末端偶聯的五肽之一。
j)用具有固定於其上的肽分子庫的支持物檢測血清在例(g)中描述的完全肽分子庫被用病人血清進行著色，其中非特異性偶聯反應首先用合適的水相溶劑，例如2％的奶粉PBS溶液進行封閉，然後將血清用相同的緩衝液稀釋。接著將支持物用血清通過輕微搖動60分鐘弄溼，然後洗滌3次。
來源於血清的結合的人類抗體被通過標準方法進行檢測。羊抗人抗體或抗體結合蛋白，如蛋白質G或蛋白質A被用於此目的。這些檢測試劑被偶聯到諸如過氧化物酶或磷酸酶的酶類或染料或如Cy5或碘131的放射活性物質上。
檢測試劑被稀釋於2％的奶粉PBS溶液中，支持物用該溶液通過輕微搖動60分鐘弄溼，然後洗滌3次。酶的作用可以產生一種有色的沉澱物，它可以通過可買到的掃描儀被讀出。對結合放射活性或螢光的定址精確檢測通過市售磷成像儀(phosphoimager)來實現。
信號被分為總共10種不同的信號階段，每階段都分派給肽陣列的不同的5肽。
k)用具有固定於其上的肽分子庫的支持物鑑定血清中疾病特異性的反應活性例(g)中描述的五肽分子庫被用如例(j)中描述的來源於50個胃潰瘍病人的血清進行染色。這裡幾個病人的血清可以被混合在一起使用或者每一份血清染色一個陣列。然後陣列中每一種肽分子的來源於幾個染色反應的平均信號強度被確定。
然後用50份對照血清再進行相同的步驟。這裡每一種肽分子的來源於幾個染色反應的平均信號強度也同樣被確定。
通過比較得到的平均值可以鑑定出一些與相應的對照血清相比，被病人血清顯著染色的肽分子。結果在圖16中進行了圖示。利用這些肽分子序列進行的資料庫檢索在這些肽分子和胃幽門螺旋桿菌的基因產物之間建立了相關性。
l)用固定於支持物上的12基體寡聚核苷酸分子庫檢測病人DNA在例(h)中描述的具有固定於其上的完全寡聚核苷酸分子庫的支持物被用病人DNA進行染色。採用了專家所熟悉的標準方法。非特異性的偶聯用，例如，來源於鯡魚精子的DNA進行飽和。
一份腫瘤組織樣品和一份健康組織樣品被同時從病人體內取出，其中含有的基因組DNA在腫瘤特異性聚合酶鏈式反應引物(對例如p53、p16、ras、c-myc、n-myc基因具有特異性)中的一對或幾對的幫助下進行擴增。腫瘤樣品用例如fluorescein-12-dUTP進行標記，而普通樣品用例如四甲基-若丹明-5-dUTP進行標記。樣品被混合在一起然後在支持物上進行雜交。
結合螢光活性(或放射活性)的定址精確檢測是通過使用如例(j)中描述的可買到的磷成像儀而實現的。這裡綠色螢光對紅色螢光的比值，即或產生的混合顏色作為例子被確定。每一種信號被分派給陣列中的不同12基體寡聚核苷酸。
這樣，對腫瘤疾病的預後非常重要的基因點突變就可以被診斷出來。與市售其他系統相比，多個基因可以用完全12基體寡聚核苷酸庫同時進行分析。
在一種可選的方法中，取自病人的DNA被用作稱為Alu引物擴增的模板，該引物可以和基因組中頻繁出現的Alu重複序列的邊緣發生雜交並且擴增兩個Alu重複序列之間的非重複DNA。腫瘤樣品再次用例如fluorescein-12-dUTP進行標記，而四甲基-若丹明-5-dUTP則被普通樣品吸收。樣品被如上混合在一起然後在支持物上進行雜交。
螢光信號按如上所述的方法讀出。在這種方法中，基因組的很大一部分都被掃描用於尋找普通組織和腫瘤組織之間的差異，因此新的腫瘤演進產生重要的信息的診斷性標記物可以被發現。
術語列表1支持物2物質3基質4第一種溶劑5轉印單元6朝支持物(1)方向的移動7固態或凝膠態聚集態8改進的物理環境9活動化的物質10朝支持物平面(1)方向的移動11共價偶聯於支持物(1)的物質(2)12第二種溶劑13液態14保護基15被光分解的保護基16電磁波，光17光敏保護層18在支持物(1)或陣列上的定址精確的區域19調色劑顆粒，轉印單元20調色劑存貯器21磁力輥22雷射可記錄的滾筒23帶電的調色劑顆粒跳躍到可記錄滾筒(22)上24載體(1)上的調色劑顆粒25加熱壓光輥26熔化的或活動化的調色劑顆粒27列印於紙上的第一種顏色28列印於紙上的第二種顏色29列印於紙上的第三種顏色30列印於紙上的第四種顏色31含有第一種顏色的調色劑顆粒(19)的調色劑存貯器
32含有第二種顏色的調色劑顆粒(19)的調色劑存貯器33含有第三種顏色的調色劑顆粒(19)的調色劑存貯器34含有第四種顏色的調色劑顆粒(19)的調色劑存貯器35彩色雷射印表機的支承輥或轉印單元36偶聯反應物、洗滌溶液或氣態物質的供給37掃描單元38塗布於支持物(1)的模式39用掃描單元測量得到的模式和相同的以前保存的模式的比較40印表機內存中的圖像電偏移預期值的偏差41未使用的42被病人血清和對照血清所識別的肽分子43被病人血清特異性識別的肽分子44可結合酶的陣列中的D-肽類45結合酶並同時使酶失活的陣列中的D-肽類46磁性組分47可熔性塑料組分48發色團49用於組合合成物質(2)的單體50以固態聚集態存在的溶劑
權利要求
1.一種將物質，更為特別的是用於分子庫的組合合成的單體塗布到支持物的方法，其特徵在於-物質(2)首先被包埋進基質(3)中，基質(3)至少由一種溶劑(4)組成，該溶劑(4)在低於90℃的條件下，優選的在低於50℃的條件下以固態聚集態形式(7)存在，-物質(2)被包埋至至少由一種溶劑(4)組成的基質(3)中形成以單元形式被移動(6)的轉印單元(5)，-然後該轉印單元(5)在低於90℃條件下，優選的低於50℃條件下，以固態聚集態(7)形式被塗布(6)於支持物(1)，或該轉印單元(5)被溶解於一個第二種溶劑組分(12)中，並且在該溫度條件下處於液態聚集態(13)被塗布(6)於支持物(1)，其中，在該第二種溶劑組分(12)全部或部分蒸發後，它們呈現出固態或凝膠態聚集態(7)，-該轉印單元(5)在塗布到支持物(1)後保持固態或凝膠態聚集態(7)，-位於支持物(1)上，溶解於所述的第一種溶劑的物質(2)，接著通過改變物理環境(8)，更為具體的在所述的第一種溶劑(4)內，被活動化，-被活動化的物質(2，9)通過一個物理過程進入支持物平面(10)附近，-被活動化的物質(2，9)共價偶聯到位於支持物(1)的分子上，或者進入與這些分子的化學反應或催化這些分子，-被活動化並共價偶聯到支持物的物質(11)是或產生許多不同的物質(2)，-超過1層的該物質(2)被反覆的一個接一個的定址精確地塗布到支持物(1)上，在每一種情況下，隨後進行物質與支持物(11)的共價偶聯和洗去未偶聯的物質。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於該物質(2)在90℃條件下，優選的在50℃條件下以顆粒形式呈現固定化狀態，其顆粒大小介於0.2μm和200μm之間，優選的介於2μm和40μm之間。
3.根據權利要求1或2的方法，其特徵在於在單體與支持物(1)的偶聯反應(10，11)開始之前，該支持物(1)保存在與所述的轉印單元(7，13)相比低至少10℃的條件下。
4.根據權利要求1到3之一的方法，其特徵在於物質的定址精確轉印是在合適的經過改進的列印方法的輔助下，更為特別是在一臺雷射印表機、一臺雷射複印機或一臺噴墨印表機的幫助下發生的。
5.根據權利要求1到4之一的方法，其特徵在於物質的定址精確轉印是在許多可有目的控制的光源的輔助下，更為特別的是在發光二極體或微雷射陣列的輔助下發生的。
6.根據權利要求1到5之一的方法，其特徵在於被塗布到支持物的顆粒是被噴灑到支持物上。
7.根據權利要求1到6之一的方法，其特徵在於支持物上的顆粒是被冷卻並深度冷凍的。
8.根據權利要求1到7之一的方法，其特徵在於顆粒含有至少一種來源於下組的成分或結合於含有來源於下組的成分的顆粒磁性組分、二苯基甲醯胺、用於組合合成的單體、二體或三體的前體、更為具體的，D或L胺基酸、核苷或衍生的核苷或其鏡像異構體或它們的衍生物的前體或者聚苯乙烯或纖維素，更為具體的是被偶聯到一層或多層單體上的聚苯乙烯或纖維素。
9.根據權利要求1到8之一的方法，其特徵在於在第一輪偶聯反應循環後，保護基按照標準方法被去除，使得優選的可與單體、二體或三體的前體偶聯的游離氨基基團或羥基基團出現。
10.將物質特別是用於分子庫組合合成的單體塗布於支持物的方法，其特徵在於電磁波、更為特別的是雷射，被反覆定址準確地照射支持物的特定區域，使得支持物的特定區域被或將被帶上不同分子或這些分子上的不同的聚集體，不同分子或這些分子上的不同的聚集體和入射的電磁波相互作用，位於特定區域的不同分子或這些分子上的不同聚集體或其他分子和入射的電磁波相互作用，並且通過入射的電磁波和不同分子或這些分子上的不同聚集體或其他分子的相互作用，使得定址的物理或化學過程開始進行。
11.用於將分子塗布到支持物的一個基本平面的表面上的設備，該設備包括用於可旋轉地固定支持物的裝置，使得可以圍繞基本垂直於支持物平面的軸進行旋轉，用於將不同流體塗布到支持物表面旋轉軸區域的裝置以及至少一臺可以相對於支持物表面進行操作的雷射發射器以用雷射照射支持物的特定區域。
12.用於將分子塗布到支持物的一個基本平面的表面上的設備，該設備包括類似噴嘴的裝置，其用於將微量待固定的分子塗布於支持物上，用於使塗布分子的裝置和載體互對彼此操作的裝置，以及至少一臺雷射發射器，其用於雷射照射支持物的特定區域。
13.用於將分子塗布到支持物的一個基本平面的表面上的設備，包括一個用於含有待塗布分子的顆粒的容器，一臺雷射發射器和將支持物和雷射發射器相對彼此移動的裝置。
14.根據權利要求13的設備，其特徵在於其特徵在於該設備是一個改進的主要市售雷射印表機或雷射複印機，其中的調色劑顆粒被含有待塗布分子的顆粒所替換。
全文摘要
本發明提供一種將物質,更為特別的是用於分子庫的組合合成的單體塗布到支持物的方法,物質首先被包埋進基質中,基質至少由一種溶劑組成,該溶劑在低於90℃的條件下,優選的在低於50℃的條件下以固態聚集態形式存在,物質被包埋至基質形式的轉印單元中,然後該轉印單元在低於90℃條件下,優選的低於50℃條件下,以固態聚集態形式被塗布於支持物,或該轉印單元被溶解於一個第二種溶劑組分中,並且在該溫度條件下,以液態聚集態被塗布支持物,其中,在該第二種溶劑組分全部或部分蒸發後,它們呈現出固態或凝膠狀態聚集態,該轉印單元在塗布到支持物後保持固態或凝膠態聚集態,位於支持物上的物質,接著通過改變物理環境被活動化,通過一個物理過程進入支持物平面附近,被活動化的物質共價偶聯到分子上。多層該物質被反覆的一個接一個的定址精確地塗布到支持物上,該方法可通過基本具有雷射印表機或雷射複印機或噴墨印表機結構的設備進行。
文檔編號C07B61/00GK1357004SQ99816181
公開日2002年7月3日 申請日期1999年12月14日 優先權日1998年12月14日
發明者A·普斯特卡, F·布雷特林, K·－H·格羅斯, S·迪貝爾, R·薩夫裡希 申請人:德國癌症研究公共權益基金會, 歐洲分子生物學實驗室