一種具有穿膜作用的抗炎短肽的製作方法

2023-11-30 15:11:36 2

專利名稱：一種具有穿膜作用的抗炎短肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種治療用的以核因子-k B (NF- k B) p65亞基 拮抗肽為母體的改構肽，該改構肽具有穿膜作用。更具體而言，涉及一種不僅能夠拮抗核因 子-k B p65亞基活性，還可作用於其他未知耙點的小分子肽Lys(D-Pro)ValCit，本發明還 涉及這種抗炎短肽的製備和應用。
背景技術：
自1986年核因子-k B(皿clear factor-k B，NF_ k B)被偶然發現以來，其重要性 正日益受到關注並成為目前最活躍的研究領域之一。典型的NF- k B是由多肽鏈p50和p65 兩亞基形成的異二聚體。當細胞處於靜息狀態時，NF-kb主要與kB抑制蛋白(IkBs，，其 中起重要作用的是IkBci ， IkBP)結合形成三聚體，以無活性方式存在於細胞質中；當細 胞受到多種外界信號(如炎性剌激、致癌物、電離輻射、生長因子及其它應激原等)剌激進 而啟動細胞第二信使系統時，IkBs在IkB激醇(IkKs :由lKKa 、 IkKP 、NIK、 IKAP組 成的複合物)的作用下發生磷酸化並降解，NF-k B失去I k Bs的嚴格控制而被激活，並移位 進入細胞核內；其亞基形成環狀結構與靶基因特定部位結合，啟動400餘種與炎症、細胞存 活、增殖、侵襲及血管生成密切相關的基因轉錄表達。已證實NF- k B的活化不僅與腫瘤的 生長、增殖、存活、侵襲、轉移、新生血管生成以及放、化療耐受有關，而且也與多種炎症相關 性疾病的發生發展密切相關，如(類)風溼性關節炎、哮喘、慢性腎小球性腎炎、幽門螺桿菌 相關性胃炎、炎症性腸道疾病等慢性炎性疾病，膿毒症、膿毒性休克、急性腎小球性腎炎等 急性炎性疾病，Alzheimer' s病，動脈粥樣硬化，系統性紅斑自狼瘡等身免疫性疾病和癌 症的發生和發展均於NF-k B過度或持續活化密切相關。因此，NF-k B被認為是極具潛力的 抗腫瘤、抗炎靶點。目前眾多醫藥公司斥巨資研發具有治療潛力的NF-KB抑制劑，部分已 進入I/II期臨床實驗。可見有關NF-k B的研究態勢正逐漸"從克隆向臨床"(from clone to clinic)過渡。 鑑於NF-k B在上述疾病的發生和發展中的潛在作用，以NF-k B及其信號傳導通 路中的相關蛋白為靶點，研發NF-KB相關疾病的治療藥物已成為本領域中的研究熱點。目 前國外有關以NF-KB為靶點的拮抗治療策略主要包括以下幾個方面(l)抗氧化治療如 抗氧化劑——吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate， PDTC)非特異抑制 NF-k B的轉錄活性；(2)抑制IKK的形成及活性應用IKK a的反義核酸、表達IKK a顯 性失活突變體以及應用幹擾IKK複合物形成的幹擾肽等抑制IKK的形成及活化；(3)減少 IkB的降解:某些蛋白酶小體抑制劑如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近 來發現的印oxomicin等均可通過抑制I k B的降解，達到拮抗NF- k B活性的目的。(4)促 進I k B的生成應用I k B a的腺病毒表達載體，使I k B a顯型失活突變體過量表達，可明 顯抑制NF- k B的核移位及其後續效應；(5)抑制NF- k B的合成設計P50和P65的反義核 酸和siRNA阻滯NF- k B的合成；(6)傳統非甾體類抗炎藥物抑制NF- k B的活化；(7)來源 於中藥的薑黃素、黃酮類化合物和白藜蘆醇等化合物非特異地抑制NF-k B信號通路的活化。 上述以NF- k B為耙點的治療策略在體外和動物實驗中已表現出不同程度的療效，部分治療策略已進入臨床試用階段，且已通過United States Patent and TrademarkOffice和European Patent Office等註冊並受專利保護。如第一個臨床應用治療復發或難治的多發性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑——硼替佐米(bortezomib，商品名為萬珂Velcade，最初被稱為PS-341)，主要對抗NF-k B路徑。如美國醫藥公司Corgentech和AlgoRx於2005年12月聯合註冊了商品名為Avrina的藥物，對溼疹進行I、 II期臨床試驗。該藥物為NF-kb誘騙(Decoy)分子，被認為是高度選擇性的NF_ k b抑制劑。但眾所周知，NF-kb拮抗劑的應用必然要面對如下不可迴避的問題①安全性由於NF-kB遍布全身所有的細胞，不加選擇的抑制其活性會導致廣泛的生理功能紊亂。如上述硼替佐米使用後可出現顯著的神經病變。解決該問題的理想選擇有兩個一是採用藥物靶向傳輸系統，使其只在病灶部位或病變細胞中起作用；二是局部用藥，如上述Avrina藥物對溼疹治療時採用的是局部塗抹用藥方式。②穿膜性NF-kb拮抗劑只有進入細胞內才能發揮抑制作用。解決方法如下一是選擇小分子拮抗劑，因其可自由穿過細胞膜；二是通過轉染製劑如脂質體轉染；三是通過連接穿膜肽後，由其導入細胞內。③高效性對獲得的陽性多肽或化合物，在提高其藥代動力學性質(如溶解度、疏水性、轉運特性等)的基礎上，通過改構、優化等策略提高其與靶分子的親和力或同時作用多個靶標發揮作用。目前有關NF-kb拮抗劑的安全性(靶向性)、穿膜性、高效性的研究正成為該領域的研究熱點和難點。 我們在國家自然科學基金項目的資助下，利用酵母雙雜交技術，以NF-k B亞基p65的DNA結合域為"誘佴"，篩選出系列p65相互作用多肽，後經Pull-down、表面等離子共振分析、報告基因實驗、離體細胞培養和在體炎症動物模型實驗驗證，成功獲得系列NF-k B亞基拮抗肽，其中5條分別見專利200510007479. 2,200510069451. 1。 為了提高多肽的活性並降低其副作用，需要對現有的活性多肽進行結構改造或結構優化。目前對多肽進行結構改造的方法可分為兩大類①在不改變多肽本質基礎上進行的改造。包括將直鏈肽改造成環肽、定位突變或化學修飾(如聚乙二醇修飾)、結構拼接組裝、微囊包埋等設計策略。②把肽結構變換成非肽分子。我們通過不同的策略對自行研製的上述NF- k B亞基拮抗肽進行結構改造，意外發現NF- k B亞基拮抗肽AspLysProVal序列本身具有穿膜特性並表現出良好的抗炎作用，而改構後的短肽Lys(D-Pro)ValCit在保留其穿膜特性的基礎上，表現出更強的抗炎活性。實驗結果表明，該短肽不僅能夠拮抗核因子-k B p65亞基活性，還可能作用其他未知耙點發揮其抗炎作用。

發明內容
本發明的目的是提供以核因子-k B(NF-k B)p65亞基拮抗肽為母體的改構肽，該
改構肽具有穿膜作用且具有高效抗炎活性。 本發明的另一 目的是提供此抗炎短肽的藥物用途。 本發明的核因子-k B p65亞基拮抗肽胺基酸序列如下 Lys(D-Pro)ValCit 該多肽由四個胺基酸組成，其中第2個胺基酸為D-Pro。 本發明還包括本發明的多肽的製備方法，所述方法選自常規的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重組方法或化學合成方法。 本發明所述藥物用途是治療炎性免疫相關疾病的藥物用途。其中所述炎性相關疾 病是膿毒症、膿毒性休克、(類)風溼性關節炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統性紅斑狼 瘡等。 本發明還包括含有本發明的多肽的藥物組合物。本發明的藥物組合物，必要時可
以含有藥物可接受的載體。本發明的藥物組合物，可以以任何形式的藥物製劑形式存在。如
適合口服的製劑或適合注射的製劑，優選是注射劑。最優選是冷凍乾燥注射劑。 具有本發明胺基酸序列結構的多肽既可以以多肽形式單獨存在，也可與其它蛋白
和多肽融和，或被甲基化、乙醯化和氨基化等修飾，或進行個別胺基酸的突變或替代，或插
入蛋白質表面的特定部位，如凸環區，或與其它物質連接。無論以什麼形式存在，含此結構
多肽的物質可能表現出抗炎活性。 含此胺基酸序列的物質可有各種應用方式，主要包括在體外和體內的抗炎活性， 以各種給藥方式實現以抗炎活性為目的的疾病治療。 本發明的多肽比先前開發的幾種多肽更加優越，具體表現為本發明的多肽序列最 短，便於合成，且具有穿膜性能。


圖1為ELISA方法檢測多肽對核因子_ k B p65亞基與核因子_ k B順式作用元件 結合的競爭抑制實驗的結果曲線。 圖2為螢光素酶報告基因實驗檢測多肽對核因子-KB反應性螢光素酶報告 基因表達的抑制效應。A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H分別為RAW 264. 7、 RAW 264. 7+Zymosan、 RAW264. 7+Zymosan+p4_kB_Luc、 RAW 264. 7+Zymosan+p4_kB_Luc+9. 375 ii mol/L多 肽、RAW 264. 7+Zymosan+p4_kB_Luc+18. 75 ii mol/L多肽、RAW 264. 7+Zymosan+p4_ kB_Luc+37. 5iimol/L多肽、RAW 264. 7+Zymosan+p4_kB_Luc+75 ii mol/L多肽、RAW 264. 7+Zymosan+p4_kB_Luc+150 ii mol/L多肽。
圖3為完全弗式佐劑致小鼠足蹠部炎症及多肽治療效果。
圖4為抗炎多肽的穿膜實驗結果。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。
實施例1、 Lys(D-Pro)ValCit製備方法的操作歩驟 固相多肽合成的主要操作步驟如下1、樹脂溶漲將Wang-Resin樹脂放入反應管 中，加DMF(15ml/g) ，30min。 2、脫保護去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g) ， 5min，去 掉再加20X哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。 3、檢測抽掉哌啶溶液，取十幾粒樹脂，用乙 醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105t: ll(TC加熱5min，變深藍色為陽性反 應。4、洗滌DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次。5、縮合加入保 護胺基酸三倍過量，活化劑HBTU三倍過量，均用儘量少DMF溶解，加入反應管，立刻加入NMM 十倍過量，反應30min。 6、洗滌:DMF(10ml/g) 一次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次。 7、重複二至六操作依次連接胺基酸(從C端到N端順序Cit、 Val、 D-Pro、 Lys)，最後一次洗滌:DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次，DCM(10ml/g)兩次。9、裂
解配製裂解液(10ml/g)-TFA94. 5% ;水2. 5% ;EDT 2. 5% ;TIS l%，120min。 10、吹乾
洗滌將裂解液用氮氣儘量吹乾，用乙醚洗六次，然後常溫揮幹。11、HPLC純化以水和乙腈
做流動相，在流動相中加入0. 1%的TFA，梯度從5% —85%，使用C18反相柱。 實施例2、ELISA方法柃測多肽對核因子-k B D65亞某與核因子-k B順式作用元
#齢白勺絲翻輔 多肽序列的合成由上海強耀生物科技有限公司合成，純度> 95%。於包被了核因 子-kB順式作用元件的96孔酶聯板(購自美國Clontech公司的Mercury Transfactor p65kits)中加入150iU/孔轉錄因子封閉液，室溫孵育15min ;棄轉錄因子封閉液後加入 50ia/孔用轉錄因子封閉液稀釋的檢測樣品，樣品分別為含10ng/ia的p65標準蛋白作為 陽性對照、含10ng/ ii 1的p65標準蛋白同時加入系列濃度多肽、含10ng/ y 1的p65標準蛋 白同時加入相同系列濃度陰性肽，室溫孵育lh，空白對照為加入50iU轉錄因子封閉液；加 入轉錄因子封閉液150 ii 1/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉錄因子封閉液以 1 : 500稀釋的p65抗體100 ii 1/孔，室溫孵育lh ;加入轉錄因子封閉液150 ii 1/孔洗滌3 次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉錄因子封閉液以l : lOOO稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗 100 ii 1/孔，室溫孵育30min ;加入轉錄因子緩衝液250 y 1/孔洗滌4次，每次4min，去除洗 滌液；加入TMB底物，室溫孵育10min，待液體變藍後，用100 iU/孔的終止液終止反應；於 450nm和630nm雙波長檢測OD值。p65結合肽對p65與其順式作用元件結合的抑制百分數 計算公式為(p65標準蛋白陽性對照孔OD-多肽孔0D)/p65標準蛋白陽性對照孔0D。
結果表明，本發明的多肽(陽性肽1)可抑制p65與其順式作用元件的結合，而這 種抑制效應具有量效關係，即抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，該作用與陽性肽2(序列 為AspLysProVal)的作用強度相當；而陰性肽則不影響p65與其順式作用元件的結合，如圖 l所示。 實施例3、多肽對核因子-k B反應性報告基因表達的抑制實驗。
1640培養基培養RAW 264. 7細胞，轉染前一天將細胞密度調整為0. 5 2. 5 X 105 個/mL，過夜培養；取lmL過夜培養細胞或以0. 5X 105個細胞/孔細胞量加入24孔培養 板；取3 ii LGeneJuice轉染試劑加入100 y L無血清1640培養基中，旋渦混勻，室溫放置 5min ;取1 ii gp4kB-Luc質粒加入Genejuice/1640培養基混合物中，輕輕吹打混勻，室溫放 置5-15min ;將上述混合物逐滴加入完全培養基中，輕輕震蕩，使混合物和細胞充分混勻； 37°C， 5% C02培養箱培養；轉染5h後，用完全培養基進行換液培養lh後用PBS洗細胞3 次，最後將細胞重懸於100 ii L的無血清1640培養基中；用PBS將多肽稀釋成6個不同濃 度(加入培養基後的終濃度分別為0、9. 375、 18. 75、37. 5、75、 150 y mol/L)，體積為50 y L的 多肽液，同時用PBS將2 ii L Chariot轉染試劑稀釋成50 y L，將不同濃度的多肽與Chariot 轉染試劑混合，輕輕吹打混勻，室溫放置30min。將100 y L多肽/Chariot轉染試劑混合液 逐滴加入上述100 ii L無血清1640培養基重懸的RAW 264. 7細胞培養液中，輕輕震蕩，使混 合物和細胞充分混勻；37°C，5% C02培養箱培養lh;除去轉染液，將培養基換成完全培養 基，同時加入終濃度為1 P g/mL的Zymosan進行剌激，培養2h後吸取細胞500g離心5min， PBS洗滌細胞一次，除盡PBS上清；以100 ii 1/孔加入1 X CCLR細胞裂解緩衝液；渦旋EP管 10-15s，4。C， 12000rpm離心2min，取上清，_70"保存或直接檢測螢光素酶的活性；於96孔檢測板中加入100 L/孔螢光素酶檢測試劑後，再加入100 L/孔細胞裂解液後立刻讀數，並列印或記錄數據。 結果表明，本發明的多肽(陽性肽l)對核因子-KB反應性螢光素酶報告基因的表達具有抑制作用，且這種抑制作用具有量效關係，即抑制作用隨著蛋白濃度的升高而增加，該作用強度高於陽性肽2 (序列為AspLysProVal);而陰性多肽則不具有這種抑制作用。如圖2所示。 實施例4、多肽對小鼠巨噬細胞系RAW 264. 7經內毒素刺激的炎症因子分泌的抑先'瞧 1640培養基培養RAW 264. 7細胞，以5 X 105個細胞/孔細胞量加入24孔培養板，分別加入內毒素(LPS)lii g/ml作用24小時，同時加入不同組別不同濃度的多肽，收集上清，以ELISA試劑盒測定炎症因子如前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子(TNF-a )、白細胞介素IP (IL-IP)和IL-6水平。 結果表明，本發明的多肽(陽性肽l)可抑制RAW 264.7經內毒素剌激的炎症因子的分泌，且該抑制效應具有量效關係，該作用強度明顯高於陽性肽2組(序列為AspLysProVal);而陰性肽則無明顯作用。結合實施例1、2的結果，推測本發明的多肽(陽性肽l)不僅能夠拮抗核因子-KB p65亞基活性，還可能作用於其他未知靶點，以發揮更強的抗炎活性。如表1所示。 表l.小鼠巨噬細胞系RAW 264. 7經LPS或LPS+多肽處理24小時後細胞培養上
清中炎症因子的變化(x士s)
組別LPS處理 (1問/ml)多肽濃度 (,指標
PGE2 (pg/ml)TNF-a (ng/ml)(ng/ml)IL-6 (ng/ml)
對照組—0285±468±12±11±1
LPS組+02584±78a48±4a28±5a37±3a
陽性肽l組+1360±49b41±118±lb26±2b
陽性肽l組+10678±27b23±2bll±lb14±2b
陽性肽l組+20378±21b14±lb8±lb6±2b
陽性肽2組+1580±20b40±2b22±2b30±2b
陽性肽2組+10980±28be26±lb18±2b22±3bc
陽性肽2組+20670±19bc18±lb16±lbc13±2bc
陰性肽組+202645±55a54±5a31±5a39±2a aP < 0. 05vs對照組；bP < 0. 05vs LPS組；eP < 0. 05vs陽性肽1組(對應濃度)
輔你15、^航,致/I、鼠,m滿赫縫驗效果 取20克左右雌性C57BL/6小鼠，隨機分為對照組、致炎組與不同治療組，每組5隻。以完全弗式佐劑注入致炎組、治療組雙後肢足蹠部及尾根部皮下各50ia，對照組於相
應部位注入等劑量的生理鹽水。注射當天定為0天，於第8、11、14、17天對治療組分別應用 地塞米松注射液(750 ii mol/L)、多肽注射液(75 y mol/L) —次，50 y 1/足，觀察期內動態測 定小鼠足蹠容積。 結果表明，致炎組發生足蹠炎症腫脹，於第28天尚未恢復正常，本發明的多肽(陽 性肽l)可有效減輕其炎症腫脹程度，其效能優於陽性肽2(序列為AspLysProVal)和地塞 米松；而陰性多肽則不具有這種治療作用。如圖3所示。
輔亂憾縫白憤月草輔 螢光素FITC標記的多肽序列(FITC-Lys(D-Pro)ValCit)由上海強耀生物科技有 限公司合成，純度> 95%。 1640培養基培養RAW 264. 7細胞，以5 X 105個細胞/孔細胞量 加入至放有蓋玻片的24孔培養板，加入FITC標記的多肽10iiM分別作用0. 5、1、2小時，之
後取蓋玻片在雷射共聚焦顯微鏡下觀察並照相。 結果顯示，本發明的多肽在0.5小時即可穿膜進入細胞內，1、2小時經過多肽穿膜 的細胞幾乎達到100%。如圖4所示經過多肽穿膜1小時的細胞。
權利要求
一種具有穿膜作用的抗炎短肽，其特徵在於，其胺基酸序列如下Lys(D-Pro)ValCit。
2. 權利要求1的抗炎短肽的製備方法，其特徵在於，選自常規的固相合成方法、溶液中 合成方法，基因重組方法或化學合成方法。
3. 含有權利要求1的抗炎短肽的藥物組合物。
4. 權利要求3的藥物組合物，其特徵在於，以任何形式的藥物製劑形式存在。
5. 權利要求3的藥物組合物，其特徵在於，是注射劑。
6. 權利要求3的藥物組合物，其特徵在於，是冷凍乾燥注射劑。
7. 權利要求l的抗炎短肽在製備治療炎性免疫相關疾病的藥物用途。
8. 權利要求7的用途，其特徵在於，其中所述炎性相關疾病是膿毒症、膿毒性休克、類 風溼性關節炎、風溼性關節炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎或系統性紅斑狼瘡。
9. 權利要求7的用途，其特徵在於，在使用時以多肽形式單獨使用，或與其它蛋白和多 肽融和，或被甲基化、乙醯化、氨基化，或進行個別胺基酸的突變或替代，或插入蛋白質表面 的特定部位，如凸環區，或與其它物質連接使用。
10. 權利要求l的抗炎短肽，其特徵在於，具有穿膜性能。
全文摘要
本發明涉及一種具有穿膜作用的抗炎短肽，特別是涉及一種治療用的以核因子-κB(NF-κB)p65亞基拮抗肽為母體的改構肽，該改構肽具有穿膜作用，更具體而言，涉及一種不僅能夠拮抗核因子-κB p65亞基活性，還可作用於其他未知靶點的小分子肽Lys(D-Pro)ValCit，本發明還涉及這種抗炎短肽的製備和應用。
文檔編號A61P11/06GK101735306SQ20101011192
公開日2010年6月16日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者楊雪, 梁華平, 王希, 範霞, 魏強 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院