血篩試劑中特異性核酸提取方法
2023-12-01 09:31:56 4
專利名稱：血篩試劑中特異性核酸提取方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及到特異性核酸序列的設計，納米磁珠 的包被方法，病毒的裂解c
背景技術：
基於磁性微粒(微納米磁珠)的核酸純化技術是利用親水性磁性微粒吸附 樣品溶液中的核酸分子，在外加磁場作用下將負載核酸的磁性微粒從樣品溶液 中分離出來，經適當清洗後，加入適當的溶液使得核酸從磁性微粒上脫附即得 到純化核酸。
磁性微粒(微納米磁珠)由YFe203和Fe304磁性材料合成的均一、超順磁、 單發散性多聚微球。每個微球體包被一層多聚材料，作為吸附和結合各種分子 的載體。微納米磁珠形狀和大小的均一性為其本身與靶物質之間提供最佳的反 應動力學，這就大大方便了它們之間快速、高效的結合。球形、確定的表面減 少了化學粘附和非特異性結合。均一的微球表面保證了目標探針的有效使用和 最佳結合。由於磁珠是超順磁的，它們能夠在磁場中表現出磁性而在無磁場時 無磁性，便於分離磁珠和液體樣本。目前，微納米磁珠在核酸純化過程中被廣 泛應用，使得核酸純化的基本步驟實現了自動化，無需進行乙醇沉澱、苯酚/氯 仿萃取、離心和柱層析處理，從而避免連續重複的手工抽提，不僅減少了樣品 損失與汙染，還極大地提高了樣品處理的通量。基於磁性微粒的核酸分離純化 試劑盒以其操作簡便快捷和省時省力的特點，成為目前分子生物學和臨床醫學 研究的理想的輔助工具。
由於普通的微納米磁珠表面包被了一層矽酸鹽材料，通過氫鍵、範德華力 等作用結合樣本中的核酸，在提取純化過程中能夠吸附所有的核酸，是一種非 特異性的提取，洗脫後得到的是多種核酸的混合物，會對後面的PCR擴增以及 其他樣本的處理造成很多幹擾，特別是在要求高靈敏度的血液篩查試劑中，會 因各類病毒核酸序列的同源性造成檢測結果的假陽性。
發明內容
本發明的目的是提供一種可廣泛用於血液篩査的特異性核酸提取方法。以 滿足血篩HBV、 HCV和HIV病毒提取的要求。
本發明的血篩試劑中特異性核酸提取方法，其特徵是包括以下步驟
1)在含有鏈親和素的1.5 100pm微納米磁珠上包被HBV、 HCV和fflV
3特異核酸序列；
2) 將包被有特異核酸序列的微納米磁珠和血液樣本中HBV、 HCV和HIV 病毒裂解出來的核酸雜交；
3) 使用核酸純化儀分離磁珠和血液樣本，洗滌磁珠，用洗脫液從磁珠上洗 脫HBV、 HCV和HIV病毒核酸；
4) 通過螢光定量PCR檢測病毒含量。
本發明中，所說的HBV、 HCV和HIV特異核酸序列如下
HBV特異核酸序列5' - TGCTGCTGCCTCATCCTTGTC[biotin] - 3' HCV特異核酸序列5' - AGTAGTTCCTCACAGGGGAGT [biotin]陽3' HIV特異核酸序列5'- TGGCTGCTTGATGTCCCCCCAC [biotin]-3' 上述的含有鏈親和素的1.5 100[mi微納米磁珠為商品化產品。 本發明使用的微納米磁珠是一種均一、超順磁的微球體，在其表面共價結 合純化的鏈親和素。鏈親和素是一種由四個相同的亞基組成的蛋白質，每個亞 基均有一個與生物素有高親和力的結合位點。這種鏈親和素與生物素的高親和 力(Kd二10-5)可以快速、高效地分離生物素標記的靶分子，而不會出現像抗生 物素蛋白那樣的非特異性結合。生物素一鏈親和素的相互作用的穩定性和結合 力可以對DNA分子進行諸如解鏈、洗脫、雜交等操作，而不影響DNA在納米 磁珠表面的穩定性。根據GeneBank中HBV、 HCV和HIV病毒序列資料庫設計 核酸序列探針，使其覆蓋HBV、 HCV和HIV的所有亞型。因此將經過生物素 標記的HBV、 HCV和HIV核酸序列探針結合到這種微納米磁珠上，得到特異 性提取HBV、 HCV和HIV的微納米磁珠。DNA病毒和RNA病毒經過裂解液 同時裂解，核酸游離在溶液中，加入特異性微納米磁珠分離純化病毒核酸。跟 非特異提取磁珠相比，採用本發明有利於提高核酸提取的特異性，避免因各類 病毒核酸序列的同源性造成檢測結果的假陽性，使得檢測結果更準確。 本發明的優點在於
本發明採用特異性核酸提取方法，有利於提高核酸提取的特異性，避免因 各類病毒核酸序列的同源性造成檢測結果的假陽性，使得檢測結果更準確。本 發明方法可廣泛用於血液篩查。
具體實施例方式
以下結合實施例進一步說明本發明。
1)購買含有鏈親和素的1.5 100pm微納米磁珠，合成HBV、 HCV和HIV
特異核酸序列如下
4HBV特異核酸序列5' - TGCTGCTGCCTCATCCTTGTC[biotin]畫3' HCV特異核酸序列5' - AGTAGTTCCTCACAGGGGAGT [biotin] - 3' HIV特異核酸序列5'- TGGCTGCTTGATGTCCCCCCAC [biotin]-3'
按照商品磁珠提供的說明書在微納米磁珠上包被HBV、 HCV和HIV特異 核酸序列；
2) 用移液器在2ml以上容量的管中加入0.9ml混合血液樣本和0.9ml的LH 裂解液，用振蕩器混合均勻後75"加熱12min ，再室溫冷卻10min。
在裂解後的血液樣本中加入50lU的步驟l的磁珠，再室溫混勻10min，使 樣本中的核酸充分結合到磁珠上。
3) 使用核酸純化儀分離磁珠和血液樣本，然後用500ul洗滌液洗滌磁珠1 次，再用50ul洗滌液洗滌第二次，最後用65ul洗脫液洗脫結合在磁珠上的HBV、 HCV和fflV病毒核酸；
4) 取上清用於HBV， HCV， fflVPCR擴增，通過螢光定量PCR檢測病毒SEQUENCE LISTING
杭州博日科技有限公司
血篩試劑中特異性核酸提取方法
3
Patentln version 3.1
1
21
DNA 人工設計
1
tgctgctgcc tcatccttgt c 21
2
21
DNA 人工設計
2
agtagttcct cacaggggag t 21
3
22
DNA 人工設計
3
tggctgcttg atgtcccccc ac 2權利要求
1. 血篩試劑中特異性核酸提取方法，其特徵是包括以下步驟1)在含有鏈親和素的1.5～100μm微納米磁珠上包被HBV、HCV和HIV特異核酸序列；2)將包被有特異核酸序列的微納米磁珠和血液樣本中HBV、HCV和HIV病毒裂解出來的核酸雜交；3)使用核酸純化儀分離磁珠和血液樣本，洗滌磁珠，用洗脫液從磁珠上洗脫HBV、HCV和HIV病毒核酸；4)通過螢光定量PCR檢測病毒含量。
2. 根據權利要求1所述的血篩試劑中特異性核酸提取方法，其特徵是所說 的HBV、 HCV和HIV特異核酸序列如下HBV特異核酸序列5' - TGCTGCTGCCTCATCCTTGTC[biotin] - 3' HCV特異核酸序列5' - AGTAGTTCCTCACAGGGGAGT [biotin] - 3' HIV特異核酸序列5'- TGGCTGCTTGATGTCCCCCCAC [biotin]-3'。
全文摘要
本發明公開的血篩試劑中特異性核酸提取方法，其步驟包括在含有鏈親和素的1.5～100μm微納米磁珠上包被HBV、HCV和HIV特異核酸序列；將包被有特異核酸序列的微納米磁珠和血液樣本中HBV、HCV和HIV病毒裂解出來的核酸雜交；使用核酸純化儀分離磁珠和血液樣本，洗滌磁珠，用洗脫液從磁珠上洗脫HBV、HCV和HIV病毒核酸；通過螢光定量PCR檢測病毒含量。採用本發明有利於提高核酸提取的特異性，避免因各類病毒核酸序列的同源性造成檢測結果的假陽性，使得檢測結果更準確。本發明可廣泛用於血液篩查。
文檔編號C07H21/00GK101497927SQ20081016420
公開日2009年8月5日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者厲永綱, 君 楊 申請人:杭州博日科技有限公司