一種基於負電荷膜濃縮檢測食品中諾如病毒的方法與流程
2023-11-30 23:34:51
本發明涉及一種食品中諾如病毒檢測方法，具體涉及三種食品諾如病毒洗脫和吸附的方法，同時又採用實時螢光定量PCR檢測濃縮病毒量(PCRU/mL)，以提高檢測食品中病毒汙染的靈敏度。
(二)
背景技術：
近年來，全球食源性疾病和惡性食品汙染事件頻頻的發生，使食品安全已成為一個嚴重並不斷擴大的世界衛生問題，並日益成為全球關注的熱點。隨著當前國際貿易、國際旅遊業的快速增長，食品市場的全球化引發了食品的高風險性，並使食源性疾病有在全球蔓延的趨勢。作為食品安全的頭號問題，食源性疾病的發生中超過半數是由病毒引起的。諾如病毒(noroviruse,NoV)是世界範圍內引起人類急性胃腸炎的最常見食源性病毒之一，該病毒主
要傳播途徑為食用受汙染的食品、水及生活接觸,其中食用受汙染的食品是重要途徑之一。
隨著發達國家對諾如病毒的日益關注和研究的日趨深入，近年來國內對諾如病毒的研究已開始重視。諾如病毒(Norovirus,NoV)屬於杯狀病毒科(Caliciviruses)的諾瓦克病毒屬，是1972年由Kapikian等學者首次用電鏡的方法發現的。諾如病毒基因組分子大小為7.3-7.6Kb，通常根據NV病毒RNA聚合酶編碼區核苷酸或外殼蛋白區胺基酸序列的差異，可將NV分為5個不同的基因型(GGI、GGII、GGIII、GGIV和GGV)，其中GGI和GGII為常見的致病型。諾如病毒對外界的抵抗力較強，通常能引起自限性、輕中度的胃腸道感染症，其特點是高發病率、低致病劑量。諾如病毒目前被認為是世界範圍內流行性、非細菌胃腸炎暴發的主要原因。2006年11月，日本、新加坡、義大利等地相繼發生了與食品有關的諾如病毒集體感染事件，特別是日本，不到兩個月累計發生了35.76萬人感染了諾如病毒。中國自1995年報告首例諾如病毒感染病例後，國內許多地區多次暴發諾如病毒感染性急性胃腸炎(疫情主要集中在廣東和浙江省)。諾如病毒已日益成為重要的公共衛生問題。
日常生活中，在許多食物的表面或者內部都有各種各樣病毒的分布。長期以來，由於食品中病毒的含量低、檢測技術落後等因素，人們對於病毒汙染食物未能得到應有的重視。食源性諾如疾病的暴發大多與食用受汙染的水及食品有關。目前絕大多數有關食品中有毒有害物質的研究主要集中於重金屬、致病菌、農殘獸殘及其食品自身產生的神經毒素等，對以其為載體的食源性病毒尤其是諾如病毒檢測技術的研究還不多。我國及世界上大多數國家除貝類以外的食品中病毒的檢測均沒有較為成熟的技術標準可以執行。因此，迫切需要發展有效的貝類中病毒的快速檢測方法及溯源技術，以保障食品安全及民眾健康。
食品的病毒檢測過程主要包括樣品預處理、病毒洗脫、病毒濃縮、核酸提取、PCR檢測等。鑑於食品成分複雜，可能富含各種PCR抑制劑，同時在實際操作中，食品樣本量大而病毒含量低，因此病毒洗脫和濃縮是食品中諾如病毒檢測的關鍵步驟。病毒洗脫和濃縮就是通過適當的緩衝液將病毒顆粒從食物表面洗脫下來再進一步濃縮的一種方法。洗脫溶液的酸鹼度通常對病毒顆粒的洗脫效果影響非常大。在大多數情況下，用pH9至10.5的鹼性緩衝液來洗脫食品表面病毒。因為鹼性環境可以使病毒顆粒從食品基質中分離。然而，在酸性環境中，病毒粒子結合到食品表面的能力則會得到加強。所以酸性環境會影響病毒洗脫的效力，從而降低檢測的靈敏度。由於許多食物(尤其是果蔬類食品)中酸性成分含量較高，所以通常使用Tris-為基礎的鹼性緩衝液來進行洗脫。除此之外，其他類型的洗脫緩衝液的使用也有報導。如碳酸氫鈉緩衝液被用於漿果和涼拌菜中的脊髓灰質炎病毒的獲取。磷酸緩衝液(pH7.6)被用於生菜和新鮮的草莓中A肝病毒的洗脫等。病毒洗脫之後，在濃縮步驟中可採用的方法則非常多，它們包括聚乙二醇(PEG)沉澱，超離心，超濾，免疫濃縮和濾膜吸附等方法。聚乙二醇(PEG)沉澱法，超離心法，超濾法是目前食品中病毒濃縮採用的較多的方法，然而它們同樣存在著耗時、高成本和操作要求高等缺點。濾膜吸附以往常用於水體中病毒的濃縮，近年來也有文獻報導在對食品的洗脫和濃縮過程經過適當的處理之後，採用濾膜吸附的方法也能達到較好的濃縮效果，同時該方法還具有省時、高效和檢測靈敏度高等優點。
由於病毒在汙染的食品含量往往較低，且病毒個體較小(直徑約為50-300nm)，難於直接檢測，常規核酸PCR和半數組織細胞感染量(TCID50)是食品中病毒的主要檢測方法。隨著分子生物學技術的發展，相對於常規核酸PCR而言，新出現的螢光定量PCR技術使得病毒的整個檢測過程具有了實時檢測、定量準確、靈敏度高和重複性好等優點。目前，由於諾如病毒還不能夠完全在實驗室條件下進行培養，螢光定量PCR技術已成為諾如病毒的主要檢測方法。發達國家應用該技術對諾如病毒檢測研究已從貝類食品發展到其他食品，而我國對諾如病毒檢測技術研究起步較晚，目前的零星報導也僅限於牡蠣等貝類中。螢光定量PCR技術的引入，將進一步增強食品中諾如病毒檢測的範圍、高效性和靈敏度。
綜上所述，儘管目前國際上關於不同食品中諾如病毒濃縮檢測的方法已有不少報導，但由於各種濃縮方法中材料和材質的理化性質、吸附-洗脫條件、操作流程不同，導致不同濃縮方法結果也相差懸殊，各國也不具可比性。因此，對於食品中諾如病毒的整個濃縮過程進行優化，提高病毒的濃縮效率，在我國建立一種對食品中諾如病毒高效、快速的濃縮和檢測方法對於保障食品安全，減少諾如病毒感染，保障人民生命健康，以及對諾如病毒的檢測和控制具有重要的理論和實踐意義。
(三)
技術實現要素：
本發明目的是提供一種高效、快捷的食品中諾如病毒的濃縮方法，它以即食性食品中汙染的諾如病毒(NoV GI和NoV GII)為對象，利用較簡便的濃縮方法，實現了即食性食品中諾如病毒的濃縮，為即食性食品中諾如病毒高效快速的檢測以及食源性腹瀉病例的溯源提供技術支持。
本發明採用的技術方案是：
本發明提供一種基於負電荷膜濃縮檢測食品中諾如病毒的方法，所述方法為：(1)病毒洗脫：將待測樣品用洗脫液浸泡，室溫振蕩洗脫(優選10-30min)，離心(優選8000-10000rpm離心15-30min)，獲得上清液；所述待測樣品為蔬菜、水果、沙拉或肉類熟食，若待測樣品為水果，則向洗脫液中加入果膠酶和纖維素酶；所述洗脫液為下列之一：洗脫液BE、洗脫液ALK、洗脫液SPE或洗脫液GE；所述洗脫液BE組成為：三羥甲基氨基甲烷12.11g/L，甘氨酸3.75g/L，牛肉浸膏10-30g/L，溶劑為ddH2O，pH＝9.5；所述洗脫液GE組成為：甘氨酸3.75g/L，NaCl 8.775g/L，溶劑為ddH2O，pH＝9.5；所述洗脫液ALK組成為：KH2PO46.8g/L，NaCl 58.5g/L，Trinton X-100 1mL/L，溶劑為ddH2O，pH＝9.2；所述洗脫液SPE組成為：NaHCO3 84g/L，大豆蛋白10-20g/L，溶劑為ddH2O，pH＝9.3；(2)病毒濃縮：取上清液調節pH值至2～4，採用孔徑為0.45μm負電荷濾膜抽濾(優選Milliflex PLUS真空泵S-Pak，0.45μm×47mm，Millipore，Germany)，獲得抽濾後的濾紙；(3)病毒濃度檢測：將抽濾後的濾紙剪碎，提取RNA進行實時螢光定量PCR反應，獲得待測樣品Ct值，根據諾如病毒NoV GI標準曲線和諾如病毒NoV GII標準曲線，最終獲得待測樣品中諾如病毒含量；所述諾如病毒NoV GI標準曲線以1.27～1.27×105PCRU/mL諾如病毒標準品濃度為縱坐標，以實時螢光定量PCR的Ct值為橫坐標製作而成，所述諾如病毒NoV GII標準曲線以0.86～0.86×108PCRU/mL諾如病毒NoV GII標準品濃度為縱坐標，以實時螢光定量PCR的Ct值為橫坐標製作而成。
進一步，步驟(1)所述待測樣品為新鮮蔬菜或水果時，所述洗脫液為洗脫液BE；所述洗脫液BE組成為：三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.11g/L，甘氨酸(Glycine)3.75g/L，牛肉浸膏(Beef extract)10g/L，溶劑為ddH2O，pH＝9.5；所述待測樣品為沙拉時，所述洗脫液為洗脫液GE，所述洗脫液GE組成為：甘氨酸3.75g，NaCl 8.775g，ddH2O 1L，pH＝9.5。
進一步，所述果膠酶添加量以洗脫液體積計為1-18U/mL，所述纖維素酶添加量以洗脫液體積計為1-5.6U/mL。
進一步，所述待測樣品為沙拉時，室溫振蕩洗脫獲得的上清液以體積比2：1添加試劑Vertrel XF，振蕩萃取(優選振蕩1-5min，靜置15min)，收集水相用於病毒濃縮。
進一步，步驟(1)所述待測樣品為肉類熟食，所述洗脫液為洗脫液ALK或洗脫液SPE；所述洗脫液SPE組成為：NaHCO3 84g/L，大豆蛋白10g/L，溶劑為ddH2O，pH＝9.3。
進一步，所述待測樣品為肉類熟食，洗脫液振蕩洗脫後的上清液若含有油脂狀漂浮物，則將上清液用體積比1:1的氯仿和正丁醇混合液(上清液與混合液體積比為3:1)萃取，收集水相用於病毒濃縮。
進一步，步驟(2)所述上清液調節pH值至3-3.5。
進一步，步驟(2)所述抽濾後，再加入0.1mol/L、pH＝3.5的PBS緩衝液二次抽濾(該步驟可有效減少濾膜中吸附的RNA抑制劑)，獲得抽濾後的濾紙。
進一步，步驟(3)所述濾紙剪碎後加入AVL裂解液(Qiagen，Germany)(該步驟省去了常規膜濃縮病毒後的二次洗脫和濃縮過程)，渦旋振蕩器上劇烈振蕩5-8min或高速擊打2-3min後，提取RNA。
本發明濃縮裝置包括Milliflex PLUS真空泵、無菌過濾漏鬥和濾膜，其中濾膜放置於Milliflex PLUS真空泵的過濾支架處(濾膜下方可墊上同樣大小的濾紙片)，固定好過濾支架與漏鬥後，啟動開關即可進行過濾。
本發明各洗脫液經高溫高壓滅菌處理(115℃,15min)，無需進行離心去除雜質，可存放於4℃一周以內，如需長期(3-6個月)保存也可凍存於-20℃。
本發明所述諾如病毒標準曲線製作方法為：取1份NoV GI標準品，按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取RNA，以一步法RT-PCR技術為基礎(引物及探針見表1)，將標準樣本的RNA進行1:10梯度稀釋後作為檢測模板，通過判斷以最低檢測稀釋度作為病毒的PCRU，並根據病毒原液不同稀釋度(即病毒濃度1.27～1.27×105PCRU/mL)與其對應的PCRU(即Ct值)之間的關係建立NoV GI標準曲線；同樣方法製作NoV GII標準品的標準曲線。
本發明中的所有步驟所用的食品採集容器、病毒濃縮容器進行消毒滅菌處理。
與現有的技術相比，本發明有益效果主要體現在：
(1)採用了鹼性洗脫液和負電荷膜濃縮食品中病毒的技術，鹼性洗脫液洗脫病毒可有效減少病毒對食品基質的吸附，負電荷膜濃縮可減少病毒提取時的PCR抑制劑，突出操作簡、分離速度快、可重複性好、成本低和不需要大型昂貴儀器適合現場作業等優點。
(2)本發明果蔬食品(即食性)洗脫處理中加入果膠酶和纖維素酶大大提高了病毒洗脫效率；肉類熟食(即食性)洗脫液上清中按一定比例(上清：混合液＝3：1)加入氯仿-正丁醇(氯仿：正丁醇＝1:1)混合液，能夠有效減少脂類和蛋白等成份，提高了病毒的檢測靈敏度。沙拉食品(即食性)洗脫處理中加入果膠酶和纖維素酶，洗脫後濾液中按一定比例(濾液：Vertrel XF＝2：1)加入清潔劑Vertrel XF，使病毒洗脫率和檢測率都有所提高。
(3)本發明使用濃縮病毒的微孔濾膜為孔徑0.45μm負電荷S-PAK濾膜，膜表面與病毒結合率高，便於病毒的濃縮吸附，體積濃縮大大增強。同時孔徑適中，可以過濾食品中的PCR抑制成份，便於核酸提取，提高檢測的靈敏度。
(4)本次發明採用的負電荷濾膜吸附病毒，直接加入AVL裂解液在濾膜上提取病毒核酸，省去了加入洗脫劑洗脫病毒二次洗脫和加入絮凝劑沉澱病毒的二次濃縮。
(5)本發明基於以上洗脫液和濃縮方法的優勢，諾如病毒NoV GII分別在生菜、藍莓、沙拉和火腿中的檢出限為6.5、65、650和650PCRU/15g，平均濃縮效率可達69.54、22.43、13.64和7.76％；而諾如病毒NoV GI分別在生菜、藍莓、沙拉和肉類即時性食品中的檢出限為7.8、78、780和780PCRU/15g，平均濃縮效率可達57.23、28.35、11.87％和4.56％。本發明與現有地方標準(DBS13/001-2015)相比不僅省時、高效；而且病毒濃縮率也可提高5-10％。
(四)附圖說明
圖1諾如病毒(NoV GI和GII)濃度與Ct值的標準曲線，A為諾如病毒GII型；B為諾如病毒GI型。
圖2即食性食品中病毒提取流程圖。
(五)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：
實施例1：生菜樣品中諾如病毒濃縮和檢測方法的建立
在濃縮生菜樣品中病毒之前，先對病毒濃縮容器等進行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。
1.利用BE洗脫液洗脫生菜樣品中的諾如病毒
新鮮蔬菜(生菜)每份15g分裝。每份蔬菜中加入140μL諾如病毒陽性糞便上清，點狀塗布於菜葉上(5μl每點)，置於二級生物安全櫃中30min。待風乾後，剪碎菜葉，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液BE(tris 12.11g，glycine 3.75g，beef extract 10g，ddH2O 1L，pH＝9.5)，室溫下漩渦振蕩30min，10000rpm離心15min，上清轉移至另一個50ml離心管中。
2.利用負電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒
用1mol/L的鹽酸調節上清使pH＝3.5，將調整後的上清移入超濾杯中，採用0.45μm負電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵(S-Pak，0.45μm×47mm，Millipore，Germany，購於德國MILLIPORE公司)負壓抽濾，再次往超濾杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩衝液使之通過濾膜(該步驟可達到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎後，放入1.5ml的EP管中，待下一步核酸提取。
3.諾如病毒拷貝數的檢測
3.1.RNA提取
採用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液(Qiagen，Germany)，混勻後放入振蕩器中劇烈振蕩30min，8000×g離心後取上清至另一個EP管中，餘下步驟按照其說明書進行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA於－20℃保存備用。
3.2.一步法螢光定量PCR
NoV GI(JJV1F/JJV1R，JJV1P)和NoV GII(JJV2F/JJV2R，JJV2P)引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板採用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)進行逆轉錄擴增(RT-PCR)，反應在螢光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進行，並對結果螢光檢測。擴增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下遊引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。擴增條件：42℃逆轉錄反應30min；95℃預變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個循環。
3.3.製作標準曲線
繪製標準曲線：分別取1份NoV GI標準品和NoV GII標準品，按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取RNA，以一步法RT-PCR技術為基礎(引物及探針見表1)，將標準樣本的RNA進行1:10梯度稀釋後作為檢測模板，通過判斷以最低檢測稀釋度作為病毒的PCRU，並根據病毒原液不同稀釋度(即NoV GI病毒濃度1.27～1.27×105PCRU/mL，NoV GII病毒濃度0.86～0.86×108PCRU/mL)與其對應的PCRU(即Ct值)之間的關係建立標準曲線(圖1)，NoV GI標準曲線Y＝-0.44X+14.46，NoV GII標準曲線Y＝-0.35X+14.47。
3.4.螢光定量PCR檢測濃縮病毒的量(PCRU/mL)
以上實驗重複三份，樣品檢測時，每份樣品同時檢測起始病毒原液、洗脫液和濃縮液。每份樣品檢測時均包含1份陰性對照(核酸提取時不加樣品，只加洗脫緩衝液)、1份空白對照(實時螢光RT-PCR體系中以ddH2O代替RNA)。Ct值<40則判定為檢出NoV GI和NoV GII。
檢出限的計算：分別取1份NoV GI和NoV GII標準品，按1:10進行梯度系列稀釋(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5…….)後，各取140μl塗抹於15g生菜葉上，以上每個稀釋度樣品重複六份，每份按照上述方法洗脫、濃縮和檢測病毒，以每個稀釋度中的六份檢測樣品首次出現全為陰性時，上一個稀釋度所對應的病毒含量為本方法在生菜中的檢出限。
4.諾如病毒洗脫和濃縮效率的計算
公式如下：
5.結論
根據螢光定量PCR的結果，陽性對照即初始加入生菜樣品中諾如病毒NoV GII和NoV GI的量分別是6.5×1010PCRU/15g和7.8×108PCRU/15g，生菜樣品洗脫和濃縮後諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計算結果如表2和表3所示，使用該方法濃縮生菜樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為74.75％、69.54％和6.5 PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為73.32％、57.23％和7.8 PCRU/15g。
實施例2：藍莓樣品中諾如病毒濃縮和檢測方法的建立
在濃縮藍莓樣品中病毒之前，先對病毒濃縮容器等進行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。
1、利用BE洗脫液洗脫藍莓樣品中的諾如病毒
水果(藍莓)每份15g分裝。每份藍莓中加入140μl諾如病毒NoV GI和NoV GII陽性糞便上清，點狀塗布於藍莓表面(5μl每點)，置於二級生物安全櫃中30-60min。待風乾後，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液BE(Tris 12.11g，Glycine 3.75g，Beef extract 20g，ddH2O 1L，pH＝9.5)，加入果膠酶(30000U/g，0.02g/mL)和纖維素酶(10000U/g，0.01g/mL)各150μl，室溫下漩渦振蕩30min，10000rpm離心15min，上清轉移至另一個50ml離心管中。
2、利用負電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒
用1mol/L的鹽酸調節上清使pH＝3.5，將調整後的上清移入超濾杯中，採用孔徑為0.45μm負電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵負壓抽濾，再次往超濾杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩衝液使之通過濾膜(該步驟可達到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎後，放入1.5ml的EP管中，待下一步核酸提取。
3、諾如病毒拷貝數的檢測
3.1.RNA提取
採用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μl AVL裂解液，混勻後放入振蕩器中劇烈振蕩30min，8000×g離心後取上清至另一個EP管中，餘下步驟按照其說明書進行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA於－20℃保存備用。
3.2.一步法螢光定量PCR
NoV GI和NoV GII引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板採用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)進行逆轉錄擴增(RT-PCR)，反應在螢光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進行，並對結果螢光檢測。擴增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下遊引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。擴增條件：42℃逆轉錄反應30min；95℃預變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個循環。
3.3.製作標準曲線
同實施例1。
3.4.螢光定量PCR檢測濃縮病毒的量(PCRU/mL)
同實施例1。
6.諾如病毒洗脫和濃縮效率的計算
同實施例1。
7.結論
根據螢光定量PCR的結果，陽性對照即初始加入藍莓樣品中諾如病毒NoV GII和NoV GI的量分別是6.5×1010PCRU/15g和7.8×108PCRU/15g，藍莓樣品洗脫和濃縮後諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計算結果如表2和表3所示，使用該方法濃縮藍莓樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為55.23％、22.43％和65 PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為43.65％、18.35％和78 PCRU/15g。
實施例3：火腿樣品中諾如病毒濃縮和檢測方法的建立
在濃縮火腿樣品中病毒之前，先對病毒濃縮容器等進行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。
1、利用BE洗脫液洗脫火腿樣品中的諾如病毒
肉類等即時性熟食(火腿)每份15g分裝。每份火腿中加入140μL諾如病毒NoV GI和NoV GII陽性糞便上清，點狀塗布於火腿表面(5μl每點)，置於二級生物安全櫃中30-60min。待風乾後，剪碎火腿，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液ALK(KH2PO4 6.8g，NaCl 58.5g，Trinton X-100 1mL，ddH2O 1L，pH＝9.2)，調節洗脫液pH值在9.2-9.5之間，室溫下漩渦振蕩30min，10000rpm離心15min，上清轉移至另一個50ml離心管中，如發現油脂狀物質漂浮於上清，可按特定比例(上清：混合液＝3:1，v/v)加入氯仿-正丁醇混合液(體積比1:1)，振蕩離心後取水相備用。
2、利用負電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒
用1mol/L的鹽酸調節上清或水相使pH＝3.5，將調整後的上清移入超濾杯中，採用孔徑為0.45μm負電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵負壓抽濾，再次往超濾杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩衝液使之通過濾膜(該步驟可達到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎後，放入1.5mL的EP管中，待下一步核酸提取。
3、諾如病毒拷貝數的檢測
3.1.RNA提取
採用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液，混勻後放入振蕩器中劇烈振蕩30min，8000g離心後取上清至另一個EP管中，餘下步驟按照其說明書進行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA於－20℃保存備用。
3.2.一步法螢光定量PCR
NoV GI和NoV GII引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板採用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)進行逆轉錄擴增(RT-PCR)，反應在螢光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進行，並對結果螢光檢測。擴增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下遊引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。擴增條件：42℃逆轉錄反應30min；95℃預變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個循環。
3.3.製作標準曲線
同實施例1。
3.4.螢光定量PCR檢測濃縮病毒的拷貝數
同實施例1。
4、諾如病毒洗脫和濃縮效率的計算
同實施例1。
5、結論
根據螢光定量PCR的結果，陽性對照即初始加入火腿樣品中諾如病毒NoV GII和NoV GI的量分別是6.5×1010PCRU/15g和7.8×108PCRU/15g，火腿樣品洗脫和濃縮後諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計算結果如表2和表3所示，使用該方法濃縮火腿樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為34.61％、13.64％和650 PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為39.77％、11.88％和780 PCRU/15g。
實施例4：沙拉樣品中諾如病毒濃縮和檢測方法的建立
在濃縮沙拉樣品中病毒之前，先對病毒濃縮容器等進行消毒處理(高溫高壓滅菌處理)。
1、利用BE洗脫液洗脫沙拉樣品中的諾如病毒
沙拉由黃瓜、西紅柿、胡蘿蔔和沙拉醬按一定比例製備(西紅柿：黃瓜：胡蘿蔔：沙拉醬＝1：1：1：2，w/w)。每份15g分裝。每份沙拉中加入140μL諾如病毒NoV GI和NoV GII陽性糞便上清，點狀塗布於沙拉表面(5μl每點)，置於二級生物安全櫃中30-60min。待風乾後，剪碎混勻，裝入50ml離心管中，加入30ml洗脫液GE(Glycine 3.75g，NaCl 8.775g，ddH2O 1L，pH＝9.5)，室溫下漩渦振蕩15min，10000rpm離心5min，上清轉移至另一個50ml離心管中，按一定比例(濾液：Vertrel XF＝2：1，體積比)加入試劑Vertrel XF(HFC,Dupont Chemical，購於深圳市優寶惠新材料科技有限公司)，振蕩1-5min後，靜置15min取水相備用。
2、利用負電荷膜濃縮洗脫液中諾如病毒
用1mol/L的鹽酸調節水相使pH＝3.5，將調整後的上清移入超濾杯中，採用孔徑為0.45μm負電荷濾膜的Milliflex PLUS真空泵負壓抽濾，再次往過濾漏鬥中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)緩衝液使之通過濾膜(該步驟可達到去除部分食品中RNA抑制劑的目的)，取出濾膜，剪碎後，放入1.5mL的EP管中，待下一步核酸提取。
3.諾如病毒拷貝數的檢測
3.1.RNA提取
採用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取負電荷濾膜上的諾如病毒RNA，首先向裝有濾膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液，混勻後放入振蕩器中劇烈振蕩10min，8000×g離心30s後取上清至另一個EP管中，餘下步驟按照其說明書進行RNA的提取，提取完畢的病毒RNA於－20℃保存備用。
3.2.一步法螢光定量PCR
NoV GI和NoV GII引物和探針由上海生工生物公司合成(表1)。病毒RNA模板採用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)進行逆轉錄擴增(RT-PCR)，反應在螢光定量PCR儀(ABI 7500Real Time，美國ABI)上進行，並對結果螢光檢測。擴增體系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆轉錄酶和Taq酶各0.5μL，上、下遊引物(20μmol/L)各0.6μL，探針(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。擴增條件：42℃逆轉錄反應30min；95℃預變性2min；95℃變性5s，55℃退火、延伸35s，39個循環。
3.3.製作標準曲線
同實施例1。
3.4.螢光定量PCR檢測濃縮病毒的拷貝數
同實施例1。
4、諾如病毒洗脫和濃縮效率的計算
同實施例1。
5、結論
根據螢光定量PCR的結果，陽性對照即初始加入生菜樣品中諾如病毒NoVGII和NoV GI的量分別是6.5×1010和7.8×108PCRU/15g，生菜樣品洗脫和濃縮後諾如病毒的洗脫率、濃縮率和檢出限的計算結果如表2和表3所示，使用該方法濃縮生菜樣品中諾如病毒NoV GII的洗脫率、濃縮率和檢出限分別為28.64％、7.76％和650PCRU/15g；NoV GI洗脫率、濃縮率和檢出限分別為18.94％、4.56％和780PCRU/15g。
表1諾如病毒(NoV GI和GII)特異性引物與探針
R＝A or G；Y＝C or T.
表2四種洗脫緩衝液配方
表3四種即食性食品中諾如病毒(NoV GI和GII)的洗脫率和回收率
表4負電荷膜吸附法對四種即食性食品中諾如病毒(NoV GI和GII)檢出限
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所做的進一步說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，其構架形式能夠靈活多變，可以派生系列產品。只是做出簡單的推演活替換，都應當視為屬於本發明由所提交的權利要求書確定的專利保護範圍。