用於生成萜的方法和用於該方法的mep轉化後的微生物的製作方法

2023-11-30 20:42:11

專利名稱：：用於生成萜的方法和用於該方法的mep轉化後的微生物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有產生焦磷酸異戊烯酯和/或焦磷酸二曱基烯丙酯的外源途徑的微生物，並且涉及在細胞和/或培養基中積聚類闢的方法。
背景技術：
：類異戊二烯(也稱為類萜或碎)是一大類、多樣的具有可觀經濟效益的複雜天然產物。如今，大多從植物中提取或化學合成類異戊二烯作為藥物(例如紅豆杉醇、紅沒藥醇、番茄烯、青蒿素)、動物飼料添加劑和食品著色劑(各種類葫蘿蔔素)或調味料和香料(例如薄荷醇、廣藿香醇、香柏酮)。類異戊二烯是由異戊二烯單元(2-曱基-l,3-丁二烯)構成，並且所有天然的類異戊二烯的生物前體都是焦磷酸異戊烯酯(IPP)。類異戊二烯在活體細胞(在此僅涉及幾種例如在激素調節(固醇)、光合作用(類胡蘿蔔素和其它))中起重要的作用。在活體細il包中，通過兩條不同的途徑，即依賴曱羥戊酸(下文稱MEV)途徑或不依賴曱羥戊酸途徑或MEP途徑都能夠產生IPP。大多數生物體依賴專有的產生類異戊二烯化合物的途徑，但是植物和一些微生物同時具有兩條途徑。通過MEV途徑合成IPP的前體為在中心碳代謝中合成的乙醯輔酶A。通過MEP途徑合成IPP的前體為在中心碳代謝中合成的糖酵中間體甘油醛-3-磷酸酯(GAP)和丙酮酸酯(PYR)。依賴甲羥戊酸途徑和MEP途徑都產生了焦磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)和IPP,並且在IPP之後生成焦磷酸香葉酯(GPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)和焦磷酸香葉基香葉酯(GGPP)的反應步驟不管使用依賴曱羥戊酸途徑、MEP途徑或兩者在細胞中都是相同的。就是從這些中間體生成了各種天然的類異戊二烯化合物。通過傳統的化學方法產生有機分子的化學工業愈加傾向於應用微生物細胞工廠的生產方法。朝向綠色化學驅使這種發展的主要推動力為這種所謂的"生物技術方法"更加有利於環境，由微生物產生的許多化合物太複雜很難通過有機合成來獲得以及微生物細胞工廠代表著特定化合物的無限供給。目前，類異戊二烯是通過從植物中提取或化學合成來大規模地生產。兩種方法的主要缺點為產率較低以及成本高。第三種選擇為通過體外酶轉化來生產期望的類異戊二烯，但是該方法受限於可用的前體並且因此大多數情況下在經濟上不可行。用於產生類異戊二烯的微生物的代謝工程可以由廉價的碳源用發酵方法導致大量的類異戊二烯的產生，並且由此解決了許多工業類異戊二烯生產中目前存在的問題(Maury等，2005,Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.100:19),同時使得發現於天然化合物的類異戊二烯族中的巨大多樣性的生物技術開發成為可能。由基因工程微生物已經產生了大量的類異戊二烯產物，包括檸檬烯(Carter等，2003，Phytochem.64:425)、類胡蘿蔔素(Kajiwara等，1997，Biochem.J.324:421)、表雪松醇(Jackson等，2003，Org.lett5:1629)、紫杉二烯(Huang等，2001,Biorg.Med.Chem9:2237)和其它。為了增強大腸桿菌(五.co/y中類異戊二烯的生成，已經將t/xs基因(編碼DXP合酶)、基因(DXP還原異構酶)和基因(IPP異構酶)過量表達並獲得了上述幾種類異戊二烯產物的很好的結果(回顧於Maury等，2005)。已經由大腸桿菌通過表達大腸桿菌青蒿酸生成鏈中來自釀酒酵母(S.cwevh^e)的依賴甲羥戊酸途徑獲得了青蒿酸(amorphadiene)生成的額外增加(Martin等，2003,Nat.Biotechnol.21:796)。同樣在酵母中已經產生了一些類異戊二烯化合物，其包括釀酒酵母中的表雪松醇(Jackson等，2003,Org.Lett.5:1629)、西良酒酵母中的番痴烯和卩-胡蘿蔔素(Yamano等，1994,Biosci.Biotechnol.Biochem.58:1112)和產朊假絲酵母(Candidautilis)(Miura等，1998,Appl.Environ.Microbiol.64:1226)。在一些情況中，通過過量表達HMG1(編碼HMG-CoA還原酶)在酵母中已顯示出類異戊二烯生成的增強(回顧於Maury等，2005)。儘管有上述的背景，仍然需要生成闢和類萜的另外的方法，特別是相對於現有已知的方法以較高產率和較低成本和時間密集的方式在微生物中積聚闢的方法。由此本發明的目的是提供一種生成滿足這種需要的闢和類碎的方法。本發明的另一目的是解決生物體中足夠量的萜前體的供給從而增強生物體中碎的積聚的問題。本發明的特別的目的在於生產一種微生物，所述微生物能夠向周圍環境積聚和/或分泌大量的萜。這種微生物的萜的生成優選隨時間推移而穩定進行。本發明的又一目的在於提供用於產生萜的生物平臺，其能夠生成任何製造者選擇的萜。這種單一的系統大體上能夠在一段時間內生成一種特定的碎，但是能夠將其容易地改變來生成另一種路或碎的混合物。當然也可以使用相同的系統來獨立地生成不同的碎。此外，該平臺能夠允許對於調味料和香料業有用的萜衍生化合物的生成。作為本發明的非限定性的特殊實例為來自朱欒倍半薛的香柏酮的生成。此外，用於本發明萜的生物生成平臺優選具有高的生成能力並且不含內毒素以及所有與其相關的問題。本發明的又一目的是提供能高度積聚高水平的親脂化合物的生物生成平臺，甚至是在通常不溶解該化合物或它們的前體的含水培養基中時。
發明內容引人注目的是本發明人成功地並且穩定地轉化了具有外源MEP途徑的微生物。該微生物在其天然狀態不具有生成碎的MEP途徑並且被設計成獲得這樣的途徑。在合適的培養基上微生物的培養過程中該微生物顯示出對所選闢化合物的高生成。令人驚奇的是所述轉化微生物相對於轉化前生成所述萜的能力能夠生成增加量的任何所選闢。因此，第一方面，本發明提供了一種真核微生物，其具有將5-磷酸1-脫氧-D-木酮糖酯(DXP)轉化為焦磷酸異戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)的外源MEP途徑。術語"外源代謝途徑"在此定義為一種能夠引入到野生型微生物中生成重組微生物的代謝途徑，一種不存在於野生型微生物的天然基因組中的代謝，即對於天然的微生物來說所述代謝不是"天然的"。本發明優選的微生物是真菌，更具體地為酵母屬的酵母。現有技術對於本發明所要求的微生物的轉化沒有記載。存在於自然界的真菌和酵母缺乏生成萜的MEP途徑。它們通過依賴曱羥戊酸途徑來生成萜，該途徑不用5-磷酸l-脫氧-D-木酮糖酯(DXP)作為IPP和/或DMAPP的前體。K.Reiling等在WO2005/033287Al中已經描述了在細菌中引入依賴曱羥戊酸途徑，該細菌可以天然具有或不具有該途徑。這些作者同樣暗示了修改酵母細胞以在其中整合DXP途徑酶的一般可能性。然而，該文獻沒有給出關於可獲得這樣的轉化的方式並且因此未提供對於獲得本發明有用的任何教示。實際上，沒有獲得所述轉化方式具體教示時，是不可能預測到這樣嘗試的結果的。MEP途徑包括了大量的酶，每一種都特異對應於僅一種特定底物，並且以穩定的方式一起引入所有的酶以提供能夠產生增加量的IPP和/或DMAPP/人而產生增加量的期望闢的重紐J鼓生物是很難實現的。在此本發明人提供一種對於該問題令人驚訝的解決方案。在WO00/01649Al中，J.Millis等建議可能在釀酒酵母(&zcc/z"ra附7cescgreWWae)中引入大腸桿菌MEP途徑的兩種酵,i/xs基因和t/xr基因。再一次，可實現該步驟的方式沒有進行詳細的描述並且對於結果甚至有這樣令人不安的論述對於由這樣的轉化可能獲得的MEP前體仍然可在之後進一步被工程化後的微生物通過內源酶代謝掉。公知釀酒酵母不具有這樣的內源酶，並且沒有對於該效果的具體引導，很明顯是作者的主觀臆斷。然而很清楚的是沒有人實現這樣的轉化並且並不清楚以怎樣的暗示出的方式來實現是可能的。其它的現有技術，以WO02/18617A2和WO02/083720A2為代表的文獻為例，雖然教示了怎樣轉化含有用於產生萜的天然的MEP途徑的微生物，但卻集中在天然MEP途徑的擴增或轉化上，為了增加萜或類胡蘿蔔素的生成，通過使所含的一些酶過量表達或通過其它方法使擴增天然途徑成為可能。因此就我們所知，現有技術中從未教示過如本發明要求的轉化的真核微生物。本發明還提供了一種在微生物的細胞和/或培養基中積聚類萜的方法，該方法包含工程化微生物使其包含產生IPP和/或DMAPP的外源途徑的步驟。再一方面，本發明提供了生成類碎的方法，該方法包含在有益於所述類萜生成的培養基中培養本發明的微生物，並且將類闢從培養基和/或微生物中分離的步驟。本發明還提供了製備能夠積聚和/或生成闢的微生物的方法，該方法包含用外源MEP途徑的基因和至少一種編碼碎合酶的基因轉化天然缺乏生成闢的MEP途徑的微生物的步驟。又一方面，本發明提供了一種增加微生物中類闢前體的量的方法，該方法包含用外源MEP途徑的基因轉化天然缺乏生成闢的MEP途徑的微生物的步驟。本發明還涉及一種質粒。因此，本發明提供了一種含有至少三種MEP途徑基因的質粒。本發明還提供了一種含有至少三種MEP途徑基因和闢合酶的質粒。根據本發明的優選實施方式，本發明提供了一種含有四種MEP途徑酶的質粒。在本發明另一具體的方面，有兩種質粒一種質粒含有四種MEP途徑基因(即來自大腸桿菌)，並且另一種質粒含有三種MEP途徑基因和薛合酶。本發明還涉及使用這樣的質粒轉化缺乏天然MEP途徑的真核微生物的方法。術語"天然"在此指的是存在於自然界發現的微生物中的MEP途徑。圖1示出了大腸桿菌的合成IPP和DMAPP的MEP途徑。1:3-磷酸D-甘油醛酯，2:丙酮酸酯，3:5-磷酸l-脫氧-D-木酮糖酯(DXP)，4:4-磷酸2-C-甲基-D-赤蘚糖醇酯(MEP),5:4-二磷酸胞苷醯基-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇(CDP-ME),6:2-磷-4-二磷酸胞普醯基-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇(CDP-ME2P),7:2-C-曱基-D-赤蘚糖醇2,4-環焦磷酸酯(cyclodiphosphate)(MECDP)，8:4-焦磷酸l隱羥基-2-甲基-2畫(E)陽丁烯酯(HMBPP),9:焦磷酸異戊烯酯(IPP),10:焦磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)。不同基因編碼的酶為^cy:DXP合酶，t/xr:DXP還原異構酶，/s;Z):MEP胞苷醯基轉移酶，/^五:CDP-ME激酶，/^F:MECDP合酶，gc;J5:MECDP還原酶，(yW:HMBPP還原酶，W/:IPP異構酶。圖2示出的是pIPOOl和pIP002兩種質粒，每種質粒都含有四種萜途徑的外源序列。特別地，pIPOO1含有大腸桿菌MEP途徑的四種基因(c/xs,c6cr,"pi),並且pIP002含有MEP途徑的三種基因gcp五，(yW)和碎合酶。圖3示出了通過在釀酒酵母中同源重組的MEP途徑基因的目標整合。不同的片段即片段AL由PCR擴增。隨後，在2次連續的融合PCR過程中將特定的片段融合在一起以最終獲得片段A/B/C,D/E/F,G/H/I和J/K/L。片段A和F提供了染色體組整合串(y^/gc;^/^;^所需的同源區域而片段G和L提供了染色體組整合串^^/c/xr/^/7/)/"/五必需的同源區域。將片段A/B/C和D/E/F—起整合到釀酒酵母中獲得目標插入串(yW/gc/^/^/F。由於體內同源重組，將片段G/H/I和J/K/L一起整合到釀酒酵母中以獲得目標整合串d:oA/xr/7^D/7s/五。圖4示出了MEP途徑基因的表達的評價。A:來自菌林YIP-DV-02的樣本，B:來自菌抹YIP-0V-02的樣本。在此將肌動蛋白基因用作內標。圖5示出了抑甲羥酶素(lovastatin)對含有MEP途徑和朱欒倍半碎合酶基因的酵母菌抹(YIP-DV-02)生長的效果，並且僅具有朱欒倍半闢合酶基因的菌抹(YIP-0V-01)作為對照。圖6示出了使用選擇性標記尺/[/7^3使得五7G〃缺失的策略。將兩側面連有直接重複序列的〖/用在末端具有接頭(Adaptamers)的引物從pWJ107在兩個單獨的片革殳(X旦是兩者有重疊)中擴增。通過PCR使用釀酒酵母基因組作為模板從插入位點上遊和下遊大約500bp片段分別進行擴增。融合PCR允許四種PCR片段組合成為兩種。後者被轉化到釀酒酵母中並且由於體內的同源重組f/7L43構造在五/G7J位點上進行整合。圖7示出了產生釀酒酵母菌抹的番茄烯的構建中使用的三種質粒，pIP033、pIP034和pIP035，每種質粒都含有來自於草生歐文氏菌(￡./2er6/co/a)的pCR4TOPO中的三種密碼子優化的cW基因的一種。圖8示出了產生釀酒酵母菌抹的番茄烯的構建中使用的四種質粒，pIP036(具有cW五的pESC-URA)、pIP037(具有cW/的pESC-HIS)、pIP038(具有cW/和cW5的pESC-HIS)和pIP039(具有cW五、cW5和cW/的pESC-URA),每種質粒含有來自於草生歐文氏菌OB./^A/co/a)的pESC-URA或pESC-HIS載體中的三種密碼子優化的cW基因的一種或多種。具體實施例方式本發明涉及並且使用具有外源途徑的真核微生物。根據本發明的優選實施方式，微生物是真核微生物，更優選酵母。合適微生物的非窮舉列表包括一類屬於酵母屬例如釀酒酵母cewv"/ae)、貝酵母6aj^""^、巴氏酵母f51.戸加n'aw—、奇異酵母戶racfox—、S.ex/gwoz^、&semzz/、葡萄汁酵母"wwm」、&W吵veW、5".caWe〃//,一類屬於克魯維酵母屬例如乳酸克魯維酵母(K/flcfc)、馬克斯克魯維酵母(Kmanc!'cm旭var.附arx/aww^、^zer附c^o/orew、AT.wa/m^T.cfe/p/zewsh、^C,wo"y^rmetow、《.w/cfeAflm//,—類屬於假絲酵母屬例如產朊布￡絲酵母t^7^)、熱帶布i絲酵母(C.fro/^ca//^、C.caste〃"、C./mmfto,—類屬於4妄合酵母屬例如Zrawx//、Z.67'/,/、Z,rme"她-、Z.6一o簡、ZyZore油Vzwj1,—類屬於畢赤酵母屬例如Ps印/(5fo、巴斯德畢赤酵母CRpayto&)、P■swM/zopMa、Pa"oma/a,或其它種類例如汗遜酵母Of/arae"w/a/o/拜w//zaf)、耶羅維亞酵母(Kjttcw/"/—/,'cflf)、Z)eZ>ram_yce"<myem7、粟酒裂歹直酵母(Sc/z/z(w"cc/2Gtraw少ces/ow6e)、有孑包圓酵母屬(7brw/as/ora！cfe/ZMecA:")、才帛阿舒嚢黴屬(^4s/z6yagosw)^'e)、黑麴黴(v4s/erg7'〃wsm'ger)、泡盛麴黴(/4s/erg/〃w5a而mo"〕、米麴黴(^，rg/〃us、構巢曲審(」s/erg〃/ws"WM/ara)、產黃青黴(屍ewec/〃z'wwc//^soge"Mm)、米才艮黴(i&zopwso，ae)、毛黴(Mwcor".rcewe/ZoZc/es)。更優選地，所述微生物是酵母，甚至更優選地，所述微生物是酉良酒酵母。例如2006年1月27日保藏於DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,德國)的釀酒酵母菌抹，保藏號DSM17卯0。用於本發明目的的外源途徑是這樣的一種途徑，其活性可以通過所定義的中間步驟並且由所定義的起始材料形成化合物，野生型微生物中不存在這樣的途徑。更優選地，所述外源途徑為來源於不同物種的途徑。所述外源途徑是MEP途徑(4-磷酸2-C-曱基-D-赤藻糖醇酯途徑)。在本發明的優選實施方式中該途徑能夠將5-磷酸l-脫氧-D-木酮糖酯(DXP)轉變為焦磷酸異戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)。當然，該能力指的是體內條件，並且為途逕啟動所必需的任何輔助因素，礦物等都具備的條件。根據本發明的優選實施方式，外源MEP途徑能夠將甘油醛-3-磷酸酯(GAP)和丙酮酸轉變為焦磷酸異戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)。根據本發明的優選實施方式，本發明的孩i生物含有編碼選自5-磷酸l-脫氧-D-木酮糖酯(DXP)合酶，5-磷酸l-脫氧-D-木酮糖酯(DXP)還原異構酶，4-磷酸2-C-曱基-D-赤藻糖醇酯(MEP)胞苷醯基轉移酶，4-二磷酸胞苷醯基-2-C-曱基-D-赤藻糖醇(CDP-ME)激酶，2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環焦磷酸酯(MECDP)合酶，2-C-曱基-D-赤藻糖醇2,扣環焦磷酸酯(MECDP)還原酶和4-焦》壽酸l-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯酯(HMBPP)還原酶的組中的至少一種功能性酶的外源基因。為了方便和簡單的目的，將術語"基因"(例如在表述"外源基因"中)用於代表含有編碼具體蛋白的信息的任何核苷酸序列。因此術語"基因"也同樣用於指代除了細菌之外的生物體(例如植物、動物)的DNA,其通常含有非編碼部分例如內含子或者是非編碼部分已經移除。該術語也同樣用於指代例如cDNA。優選地，所述微生物顯示出在上述段落中列舉的一種、一些或全部的酶的酶活性。更優選地，其顯示出MEP途徑的所有酶的活性。對於本發明的目的而言，這些酶具有催化圖1所述反應的能力。例如DXP合酶是一種具有催化3-磷酸D-甘油醛酯和丙酮酸形成DXP能力的酶。對於本發明的目的而言術語"功能性的"指可以任何方式觀察到和/或推斷出酶的活性。例如，可以從與外源途徑相比缺乏生成IPP的其它途徑的微生物中存在IPP即可推斷出外源MEP途徑的功能。術語"功能性的"還指在此所提及的外源基因實際上通過微生物來表達。例如，所述孩i生物可以在其阻礙天然途徑不能生成IPP的野生型的途徑中具有缺失。在這種情況下，外源途徑的功能可以乂人微生物生成的IPP並由此存活的能力推導出來。例如，如果微生物是釀酒酵母菌^^,缺失可構造在MEV途徑的必要基因中，例如五WG/3基因。缺失盒可以如現有技術所公開的那樣使用含有突出物的引物來產生，用於同源重組以刪除必要MEV基因。通常可證明含有這種缺失的可成活的菌抹依賴於外源途徑。然而，在優選實施方式中，微生物具有功能性的主要為野生型的MEV途徑和功能性的主要為外源的MEP途徑。MEV途徑被定義為能夠將乙醯輔酶A和乙醯基乙醯輔酶A轉變為IPP和/或DMAPP的途徑。MEP途徑的酶的實例和優選實施方案為那些具有以下EC號的酶DXP合酶EC2.2.1.7;DXP還原異構酶EC1.1.1.267;MEP胞苷醯基轉移酶EC2.7.7.60;CDP-ME激酶EC2.7.1.148;MECDP合酶EC4.6.1.12;MECDP還原酶EC1.17.4.3和HMBPP還原酶EC1.17.1.2。編碼這些酶的外源基因公開於公用的資料庫中，由此可為本領域技術人員使用。這些MEP途徑的基因的實例是大腸桿菌的那些基因。這些樣本具有以下的序號例如cte:(AAC73523,GI:1786622，U00096.2);<ixr:(AAC73284，GI:1786369，U00096.2);^pD:(AAC75789，GI:1789104,U00096.2);/^五:(AAC74292,GI:1787459,U00096.2);/^F:(AAC75788，GI:1789103，U00096.2);gc;五:(AAC75568，GI:1788863,U00096.2);(y汲(AAC73140，GI:1786212，U00096.2)。在優選的實施方式中，所述微生物含有編碼功能性的DXP還原異構酶(t/x。、MEP胞苦醯基轉移酶O;Z))、CDP-ME激酶O戶五)、MECDP合酶OpF)、MECDP還原酶(gc/五)和HMBPP還原酶((y^)的外源基因。優選地，所述微生物還含有編碼DXP合酶((ix"的外源基因。優選地，所述微生物含有編碼IPP異構酶(圖1中zW/)的外源基因。優選地，所述糹敬生物含有編碼FPP合酶的外源基因。編碼IPP異構酶和FPP合酶的基因已經被公開了並且可為技術人員使用。這些基因的外源拷貝可對增加本發明的微生物的萜的生成是有用的。在優選實施方式中，所述微生物含有至少一種編碼功能性碎合酶的外源基因。本發明的微生物的重要的優點在於可生成任何技術人員所選的闢時的穩定性。因此可應用任何編碼序列的碎合酶在微生物中外源表達。本發明的特殊之處在於MEP途徑酶的功能性導致了IPP的外源生成，而碎合酶可以是能夠將以下給出的前體轉變成為任何碎的酶。術語闢合酶包括酶、複合體和/或能夠從一種或幾種前體合成萜的一組酶。具體地，對於本發明的目的而言，碎的前體為焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸香葉酯(GPP)、焦磷酸香葉基香葉酯(GGPP)和它們4壬意的兩種或更多種的組合。優選地，闢合酶是一種單一的、複雜的和/或能夠從GPP、FPP、GGPP或它們的至少兩種的組合合成闢的一組酶。萜是飽和的或不飽和的、非強制選擇的取代的烴，其基於異戊二烯單元(C5)或主要由其構成。闢可為無環或成環的。在此使用的萜包括萜、碎衍生物和被稱為類碎的化合物，其可以落入或不落入一種或兩種前述的化合物分類。碎的衍生物包括經過一步或多步官能化步驟例如羥基化、異構化、氧化還原或醯化作用的化合物。優選地，對於本發明的目的來說，碎是一種能夠滿足上述條件和/或其碳骨架(至少是部分但優選全部)來源於MEP和/或MEV途徑的化合物。因此，萜包括萜醇例如C15H260和C1H180化合物例如廣藿香醇、表雪松醇、蓽澄茄醇、裡哪醇、橙花叔醇；和二醇，例如香紫蘇醇。碎還包括焦磷酸酯化合物例如焦磷酸水片酉旨(單萜)和焦磷酸(玷圯)酯(copalyldiphosphate)(二萜)，在此僅提及大量萜的種類中的少數樣本。在此使用的"衍生物"是從已知或推定的化合物得到的並含有母體物質的必要元素的任何化合物。例如，萜是具有C,o、C15、C2Q、C3o、C4o、C"等等的碳骨架的化合物。因此，術語碎包含單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和/或聚碎。在本發明的優選實施方式中，萜合酶是單萜合酶、倍半萜合酶和/或二闢合酶。優選地，其為倍半碎合酶。根據優選實施方式，本發明的萜為倍半萜。例如，所述倍半萜為蓽澄茄醇、廣藿香醇、法呢烯、青蒿酸(amorphadiene)和/或朱欒倍半闢。編碼這些裕的合酶的基因在公共資料庫中是可得到的，例如序號為AY508730，CQ813505,AY566286,AY523409,DQ309034,AF024615,AF374462,AF138959,AY006482,CQ813508的基因。碎合酶和編碼它們的基因可為技術人員根據參數選擇廣泛使用和選擇。少數幾個非限定性實例是單萜合酶，例如檸檬烯合酶(L13459，D49368，AAM53944)、松薛合酶(AF543530,AF543528)、檜薛合酶(AF051901)、焦磷酸冰片酯合酶(AF051900)、1,8-桉樹腦合酶(AF051899)和裡哪醇合酶(AF154124,U58314)。具有可用序列的二碎合酶的實例為蓖麻烯合酶(P59287)、紫杉二烯合成酶(U48796)和松香二烯合酶(U50708)。這些實例僅是用於說明本發明的廣泛應用。編碼薛合酶的迄今有待分離的序列可同樣適用於本發明的原則。優選地，闢合酶是外源的。因此碎不是由天然的和/或野生型微生物生成的。然而，本發明還包含這樣的實例，其中的微生物已經含有編碼產生萜的合酶的天然的和/或野生型基因。在這種情況下，本發明的微生物含有相同基因的另外拷貝，或編碼能夠生成相同或不同闢的碎合酶的外源基因。那樣的話，可產生較高量的相同碎或該碎與不同碎的混合物。根據本發明的優選實施方式，本發明的微生物基於每g微生物的乾物質提供了至少30pg的碎，更優選至少100pg的萜的產率。微生物的闢產率優選根據實施例10的步驟來建立。優選地，外源基因在啟動子的控制之下。優選地，這些啟動子在外源基因的附近。甚至更優選，每種外源基因即MEP途徑的那些基因和闢合酶基因分別單獨在位於各自編碼序列的上遊的啟動子的控制之下。可以使用任何啟動子，例如強的和/或弱的組成型啟動子或誘導性啟動子。優選的啟動子的實例為可誘導半乳糖的釀酒酵母啟動子例如GAL1和GAL10,或強的組成型釀酒酵母啟動子例如TPI1和TEF1。優選地，每種上述外源基因都是與終止子序列相關聯的。優選地，終止子序列位於外源基因的下遊。對於啟動子序列來說，終止子序列可以選自巨大的已知或仍待描述的終止子序列池。實例為CYC1、ADH1、TPI1或FBP1的釀酒酵母終止子。微生物可含有或不含有另外的外源基因。典型地，另外的外源基因包括標記序列例如抗性或營養缺陷的標記，其表明在已選微生物中存在外源基因的選擇。本發明的潛在的一個問題在於在微生物的連續傳代過程中大量外源基因材料的穩定性。大的質粒很難構建並且不易被微生物吸收(takeup)和維持。此外維持質粒增加了細胞的能量的耗費，並且這將使生產能力降低。然而，如果使用很多小的質粒，其中的一些將在每次的複製循環中丟失。另外，不同質粒或者同一質粒中的同源區域可發生重組，導致外源基因材料的丟失。引人注目地，本發明人能夠通過穩定地引入外源途徑來轉化微生物，外源途徑的基因可存在於微生物的質粒中。因此本發明提供了如下文所述的關於微生物的一種質粒和/或一對質粒。這些質粒令人驚奇地通過外源MEP途徑穩定地轉化微生物。優選地，該微生物包含具有外源途徑的基因和非強制性選擇的編碼闢合酶的基因的至少兩種質粒。更優選其含有兩(2)種質粒。在優選實施方式中，微生物含有至少兩種質粒，一種質粒含有至少三(3)種外源途徑基因，另一種質粒含有其它三(3)種外源途徑基因。優選地，所有的基因是具有不同的酶活性的基因。因此本發明提供了一種含有3種外源途徑基因的質粒，非強制性選擇地還包含至少一種編碼功能性DXP合酶的外源基因。更優選所述質粒含有MEP途徑的4種基因。本發明還提供了含有3種外源途徑的基因和另外的至少一種編碼功能性碎合酶的外源基因。因此，所述微生物優選含有兩種質粒，一種含有外源途徑的四(4)種不同基因，其中包括編碼DXP合酶的基因；另一種質粒含有MEP途徑的三種基因和編碼闢合酶的基因。在本發明的優選實施方式中，所述微生物含有至少兩(2)種質4立,力口在一起其含有dxs、dxr、/s;Z)、/s/五、gc/五、(y5和編碼碎合酶的基因。換句話說，所述的至少兩種質粒(例如三種或四種質粒)含有這些基因從而每種基因存在於至少兩種質粒中的至少一種中。任何合適的載體和/或質粒都可用來包含外源基因。用於轉化微生物的合適的載體的實例為pESC載體(例如pESC-URA,Stratagene)、pYES載體(例如pYES2/CT,Invitrogen)和pRS載體(例如pRS426,Sikorski和Hieter,1989,Genetics122:19)。根據優選的備選實施例，編碼外源途徑的基因被整合到微生物的基因組中。與外源途徑基因位於質粒中的實施方式相比，該實施方式具有許多優點。首先，整合到基因組中增加了在連續傳代過程中外源基因的整合穩定性。其次，隨後的優化步驟(例如進化工程)更容易實現。再次，該系統對於編碼碎合酶的基因的定位更加靈活。於是後者可以存在於相對較小的質粒中和/或也整合到基因組中。因此，整合到基因組中的基本優點在於穩定性和至少靈活性。因此，在優選實施方式中，將外源途徑基因和/或DXS合酶基因整合到微生物的基因組中，並且編碼闢合酶的基因存在於質粒中和/或整合到基因組中。優選地，編碼闢合酶的基因存在於質粒或者，所述外源闢合酶基因可以被插入到微生物的基因組中，並且外源的MEP途徑基因和/或DXP合酶基因存在於例如上述的質粒中。涉及基因組和/或質粒中的外源基因的重新分配的另外改變將會由技術人員來確定並且在此不詳細討論。對於本發明的目的來說，微生物的基因組等同於全部的染色體DNA,但是排除質粒DNA和線粒體DNA。所有的外源DNA可以是密碼子優化的。因此，外源DNA的密碼子優選^皮^修改以相應於孩先生物的優選密碼子。還可以^修改密碼子以減小外源DNA的GC含量並且改變mRNA二級結構構成。這使得能獲得更高水平的外源表達於微生物中的MEP途徑酶和/或碎合酶。麥角甾醇是特定微生物例如真菌特別是酵母生長必需的化合物。但是，為了使碳朝著本發明所選擇闢的生成方向流動，優選減少本發明微生物中的麥角甾醇生成。優選通過僅使用弱組成型和/或抑制型啟動子來取代麥角甾醇生物合成的啟動子達到這一目的。優選地，用弱組成型或抑制型啟動子替代酵母中編碼基因ERG9鯊稀合酶的天然啟動子。例如在酵母中可用釀酒酵母的MET3啟動子代替天然啟動子。可通過融合PCR和雙重(bipartite)基因打耙(Edemiz等，1997,GenomeResearch7:1174)來取代啟動子。如果所述生物為真菌，並且優選為釀酒酵母屬菌抹，水解重要中間體用於碎積聚的磷酸酯例如FPP和/或GGPP優選全部或部分失活。在釀酒酵母中，基因LPP1(YDR284C)和DPP1(YDR284C)的產物顯示出具有這種活性(Faulkner等，1999,J.Biol.Chem.274:14831)。因而如果本發明的微生物中存在這些或相似的基因就最好將其缺失掉。本發明提供了一種在微生物細胞和/或培養基上積聚路，生成闢和增加微生物中碎前體的量的方法。所述萜可在細胞中積聚。例如，其可在細胞質、線粒體、細胞膜或其它細胞器中積聚。許多闢為脂溶性化合物，其在細胞的質體膜上積聚。對於本發明的目的，術語"在培養基上積聚"同樣包括在兩階段發酵過程中的溶劑中積聚。在該方法中使用的闢和微生物為如上所述的碎和微生物。微生物的培養基在25。C(室溫)下可以是液體或固體，但是優選為液體。所述培養基根據所選微生物的需要來選擇。因此所述培養基含有生長和/或闢的生成所需的所有成分和因子。通常，選擇與用於闢的生成不同的培養基用於微生物生長。通常微生物到達其存活循環的一個複製為最小化並且轉錄和/或蛋白合成最大化的階段來實現萜的生成。培養基通常需要含有至少短期內菌林存活所需的所有的因子。根據本發明的優選實施方式，培養微生物的步驟和/或從培養基中分離薛的步驟是通過兩階段發酵法來實現的。因此，向培養基中加入不互溶且生物適應的有機溶劑。這些溶劑形成第二個能夠積聚碎和/或避免其從蒸發或其它現象的損失的相，優選為疏水性的。這樣，可將所述有機溶劑用於發酵中代謝產物的原位分離(Frenz等，1989,EnzymeMicrob.Technol.11:717;Sim等，2001,Biotechnol.Lett.23:201)。對於本發明的目的來說，兩階段發酵是一種培養微生物的方法，其特徵在於在微生物的培養基中存在或向其中加入至少一種有機溶劑以形成至少一種兩相系統。優選地，有機溶劑不能明顯影響微生物的生長和/或存活。兩階段發酵所用的合適的溶劑例如為鄰苯二甲酸二異壬酯、鄰苯二曱酸二丁酯、油醇、二己醚和十二烷。從而兩階段發酵還包括從培養基中萜的至少部分分出和/或分離。用於積聚萜的方法包括將該微生物工程化使其包含用於產生IPP和/或DMAPP的外源MEP途徑的步驟。所述工程化可在上述材料的基礎上實施。因此，該工程化可為質粒的轉化和/或外源基因材料的基因組的整合。所述的基因工程化的步驟為技術人員公知並且對於任何特定的方法技術都無任何限制。根據優選實施方式，該方法包含工程化該微生物使其包含外源闢合酶的步驟。優選地，通過轉化所述微生物使其含有包含編碼外源途徑酶的基因的質粒來實施該工程化步驟。在另一實施方式中，該方法包含在有益於所述碎生成的條件下培養微生物的步驟。這些條件為技術人員公知。通常它們可通過選擇適當的培養基、發酵容器、溫度和pH來調節。如果實施兩階段發酵，生成碎的方法可包括從培養基、從細胞和/或從有機溶劑中分離闢的步驟。所述碎可通過任何現有技術使用的方法進行分離，例如色譜法，萃取和蒸餾，但不限於這些方法。因此，根據本發明的微生物和方法提供了改進和靈活的平臺，該平臺用於多種單獨的碎或它們的混合物的生成，並且該平臺可通過可能的進一步的微生物轉化來進一步完善，該轉化通過能將萜轉變為調味料和香料工業中特別有用的其它化合物的其它酶的整合或擴增來實現。一個明顯的這樣的應用是通過適合的酶整合到本發明的微生物中，通過質粒或基因組合併，將適合的萜轉變為類胡蘿蔔素。另一個例子為朱欒倍半萜轉變為香柏酮，其通過能夠影響這種轉變的細胞色素P450單加氧酶的微生物代謝中另外的插入來實現。因此本發明提供了生成闢和它們衍生物以及由此產生的前體的有用的和有利的工具。實施例用以下的實施例詳細說明本發明而非因此限定其範圍。除非另外指出，給出的百分比為基於重量的百分比。實施例1~4通過PCR使用表1中所列的引物將、dxr、^;Z)、^;F、和基因從大腸桿菌的基因組DNA中擴增出來。使用表4中所列的引物將編碼碎合酶的基因，特別是編碼廣藿香醇合酶的基因(PatTpsl77，GeneBank序號AY508730)、蓽澄茄醇合酶(GFTpsC,GenBank序號CQ813505)和朱欒倍半碎合酶(GFTpsD，GenBank序號CQ813508)從含有這些基因的pETlla或pET101質粒中擴增出來。這些萜合酶的序列，以及各自基因的分離和上述質粒的構建都公開於WO05/052163、WO05/056803(廣藿香醇合酶)和WO04/031376(朱欒倍半碎合酶和蓽澄茄醇合酶)中。PCR條件為Expand高保真(ExpandHighFidelity)標準條件(RocheAppliedScience)。通過凝膠電泳將DNA片段分開，然後使用高純度PCR產物純化試劑盒(RocheAppliedScience)對期望大小的片段進行純化。實施例1~4，(a)部分用在表1或表4中給出的限制性酶將Ar、^;D、";F、(yf5、朱欒倍半碎合酶基因和蓽澄茄醇合酶基因和質粒(pESC-TRP或pESC-URA)的純化後的PCR產物消化並用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。對於闢合酶基因來說，使用pESC-TRP，其餘見表1。在體外，消化後質粒與消化後PCR產物的連接在4'C下按照T4DNA連接酶(RocheAppliedScience)給出的標準步驟以插入物/載體為至少3:1進行16小時。將得到的連接混合物用於轉化化學感受態大腸桿菌細胞(DH5a)(Inoue等，1990,Gene96:23)，並且轉化物在添加有氨苄青黴素的LB培養基(1%胰蛋白腖，0.5%酵母提取物，l°/。NaCl，2%瓊脂，pH7,75mg/L氨節青黴素)上進行選擇。然後通過純化質粒和用合適的限制性酶消化來檢驗轉化物。如果轉化物含有正確大小的質粒，那麼將lpg的質粒DNA純化並且送檢進行測序。獲得的質粒如下血r到pESC-TRP中pIP020;到pESC-URA中pIP018;k;F到pESC-TRP中pIP016;(y必到pESC-URA中pIP009;朱欒倍半碎合酶到pESC-TRP中pIP027;蓽澄^5醇合酶到pESC-TRP中pIP013。表1用於克隆大腸桿菌途徑基因的PCR引物tableseeoriginaldocumentpage24"克隆技術"不僅包括通過列出的限制性酶對模板的消化，之後進行連接並將得到的產物轉化到大腸桿菌中，還包括在釀酒酵母中的缺口修復，在體內進行構建。實施1~4,(b)部分剩餘的基因血S、gC/7五和選擇的萜合酶基因，通過如下的傳統的克隆或缺口修複方法將其每一種插入前述的質粒(pIP020,pIP018，pIP009)中。gc;五、朱欒倍半薛合酶和蓽澄茄醇合酶的PCR產物按如下流程進行克隆表2tableseeoriginaldocumentpage25PCR產物和質粒分別用表1或表4中指出的限制性酶消化，純化，在體外連接，然後轉化到大腸桿菌中，選擇轉化抹並通過如確切的在上述實施例14(a)給出的期望質粒測序進行驗證。缺口修複方法用於將"w克隆到pIP020中，將"/7￡克隆到pIP018中，將廣藿香醇合酶克隆到pIP016中從而獲得每種包含兩種額外基因的質粒。克隆的方法使用了酵母中的同源重組從而加入到同源DNA序列中(DeMarini等，2001，BioTechniques30:520-52)。該技術在於生成末端同源於質粒上插入位點的PCR產物來構建。用於克隆As和的引物在表l中給出，克隆碎合酶的引物在表4中。根據如下流程對PCR產物(心s,薛合酶)和目標質粒進行消化表3tableseeoriginaldocumentpage26使用標準轉化步驟(Gietz和Woods,2002，MethodsinEnzymology350:87)將消化後的PCR產物和質粒兩者轉化到釀酒酵母YIP-00-02(MATatrplura3)中。轉化抹在SC-trp培養基(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少色氨酸脫出的混合液，2%葡萄糖，2%瓊脂)或SC-ura培養基(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少尿嘧啶脫出混合液，2%葡萄糖，2%瓊脂)上選擇。在30。C下培養2~3天，所有的轉化抹接種在含SC-trp(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少色氨酸脫出的混合液，2%葡萄糖)或SC-ura(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少尿嘧啶脫出混合液，2%葡萄糖)單獨的試管中並且在30°C下培養12小時。將來自這次培養中的全部DNA分離(Sambrook和Russell,2000,Molecularcloningalaboratorymanual3rded.6.31-6.32)並且隨後用於轉化化學感受態大腸桿菌細胞(DH5a)(Inoue等，1990)。轉化林在含有添加了氨節青黴素的LB培養基的平板上進行選擇。表4tableseeoriginaldocumentpage26"克隆技術"不僅包括通過列出的限制性酶對模板的消化，之後進行連接並將得到的產物轉化到大腸桿菌中，還包括在釀酒酵母中的缺口修復，在體內進行構建。實施例5:在釀酒酵母體內通過同源重組進行質粒重組(缺口修復)為了降低質粒的不穩定性和促進釀酒酵母基因組中基因的進一步整合，將4種質粒兩兩結合在一起最終獲得兩種主要的質粒一種具有血s、血r、z'^D、f^五(pIP001),另一種具有gc/五、/少/B、^;F和倍半碎合酶基因(在朱欒倍半闢的例子中，該質粒稱為pIP002)。不同質粒的組合通過釀酒酵母中的缺口修復來實現(DeMarini等,2001,BioTechniques30:520-52)。為了構建質粒pIP002,使用引物pfus_grf和pfus—grr(表l)通過PCR對含有";F、編碼朱欒倍半闢合酶的基因、GAL1和GAL10啟動子、以及CYC1和ADH1終止子(pIP015)的DNA段進行擴增。得到的PCR產物使用高純度PCR產物純化試劑盒(RocheAppliedScience)進行純化。將質粒pIP008(含有和(y^的pESC-URA」用Mfel消化，凝膠電泳後用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。將純化和消化後的質粒與PCR產物一起用於釀酒酵母YIP陽00誦03(MATa腸3)(Gietz和Woods,2002)的轉化。轉化林在含有SC-ura的培養基的平板上進行選擇。在30。C培養2~3天之後，將所有的轉化抹接種到含5mL的SC-ura的單獨的試管中在30。C下培養12小時。從這個培養物中分離出總DNA(Sambrook和Russell,2000)並隨後用於轉化化學感受態大腸桿菌細胞(DH5a)(Inoue等，1990)。轉化抹在含有添加了氨苄青黴素的LB培養基的平板上進行選擇。然後通過純化質粒和用合適的限制性酶消化進行酶的消化來檢驗轉化林。在轉化林含有期望的質粒的情況下，純化lpg的質粒DNA並送檢測序。將得到的含有gC/7￡、/yW、/^屍和朱欒倍半闢合酶的質粒pESC-URA命名為pIP002(圖2)。使用相同的流程來構建質粒pIPOO1,即使用引物pfus—grf和pfus—grr(表l)通過PCR對含有/s;Z)、GAL1和GAL10啟動子，以及CYC1和ADH1終止子的DNA段進行擴增。得到的PCR產物使用高純度PCR產物純化試劑盒(RocheAppliedScience)進行純化。將含有和Ar的pESC-TRP用Xcml消化，凝膠電泳後用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。將純化和消化後的質粒與PCR產物一起用於釀酒酵母YIP-00-02(MATatrplura3)(Gietz和Woods,2002)的轉化。轉化林在含有SC-trp的培養基的平板上進行選擇。在30。C培養2~3天之後，將所有的轉化抹接種到含5mL的SC-trp的單獨的試管中在30。C下培養12小時。/人這個培養物中分離出總DNA(Sambrook和Russell,2000)並隨後用於轉化化學感受態大腸桿菌細胞(DH5a)(Inoue等，1990)。轉化抹在含有添加了氨節青黴素的LB培養基的平板上進行選擇。然後通過純化質粒和用合適的限制性酶消化進行酶的消化來進行檢驗轉化抹。在轉化林含有期望的質粒的情況下，純化lpg的質粒DNA並送檢測序。將得到的含有血s、血r、/^D和/^五的質粒pESC-TRP命名為pIP001(圖2)。通過用pIP014和pIP012替代pIP015，重複上述用於生成質粒pIP002的流程來獲得分別含有蓽澄茄醇合酶基因和廣藿香醇合酶基因的質粒pIP003和pIP005。.實施例6:從質粒中表達MEP途徑用於生成類闢的釀酒酵母菌林的構建將純化的質粒pIPOOl和pIP002(圖2)相繼轉化(Gietz和Woods,2002)到釀酒酵母YIP-00-02(MATatrplura3)4朱中。用pIPOOl轉化後，轉化林在含有SC-trp培養基的平板上進行選擇。將轉化抹菌落純化並且用pIP002轉化。將轉化株在含有SC-trp-ura(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少色氨酸脫出混合液，2%葡萄糖，2%瓊脂)的平板上進行選擇。將一定量的轉化抹在一系列含有5mL的SC-trp-ura單獨的檢測試管中接種並且在30。C下培養12小時。從這些培養物中，從每個轉化抹中分離總DNA(Sambrook和Russell,2000)。通過PCR來檢驗MEP途徑基因的存在。選擇特徵在於MEP途徑基因的存在的三種克隆和朱欒倍半闢合酶基因來進行進一步的特徵化，並且命名為YIP-DV-01、YIP-DV-02和YIP-DV-03。YIP-DV-02保藏於DSMZ,保藏號為DSM17900。將編碼MEP途徑的7種酶的每一種基因通過PCR從菌抹YIP-DV-02擴增出來並且送檢測序(MWG-BiotechAGDNASequencingService)。得到的序列與存儲於Genbankt的大腸桿菌MEP途徑基因的原始基因序列進行比較以檢驗突變的缺失。如所述的釀酒酵母菌抹YIP-DV-01、YIP-DV-02和YIP-DV-03的構建來實現表達MEP途徑和編碼蓽澄茄醇合酶或編碼廣藿香醇合酶基因一起表達的釀酒酵母菌抹的構建。為了構建含有gc;^、(yW、/^F和倍半闢合酶的質粒，遵循如實施例5所述的相同的步驟，但將朱欒倍半薛合酶替換為合適的上述列舉的倍半碎合酶。所有這些表達MEP途徑和表達蓽澄茄醇合酶或廣藿香合酶的菌抹分別命名為YIP-DC-01和YIP-DP-Ol。實施例7:釀酒酵母基因組中MEP途徑基因的整合為了穩定MEP途徑基因的表達，將7種基因的表達盒整合到釀酒酵母的基因組中。在釀酒酵母中4吏用體內同源重組和雙重基因打輩巴方法(Edernizetal,1997,GenomeResearch7:1174)來實現這一目的。兩種基因串的整合在兩個特定位點實現。整合的步驟如下(圖3)。對於每個基因串(血s/血r/^D/Z^E或gc;^7/y^/w"來說，首先從質粒pIPOOl或pIP002生成6種PCR產物(圖3)。然後這些PCR產物在隨後的兩次融合PCR中融合到一起。例如片^爻A、B和C首先分別被擴增出來。然後將它們在兩次融合PCR中融合，得到長的直線型片段A/B/C(圖3)。所得到的融合的PCR片段的特徵在於選擇標記(乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)URA3或KanMX)水平的區域重疊和末端與基因組上兩個不同整合位點同源(圖3)。該整合位點為第一串的ura3位點和第二基因組的pDC6(編碼丙酮酸脫羧酶的同工酶)或基因組的非編碼區域。這些特點對於釀酒酵母的兩個基因串的目標插入是必需的。根據Expand高保真標準條件(RocheAppliedScience)進行PCR，在每一次PCR和PCR融合步驟後使用高純度PCR產物純化試劑盒(RocheAppliedScience)來純化PCR產物。通過標準流程(Gietz和Woods,2002)將最後的片段用於釀酒酵母YIP-00-03(MATaura3)的轉化。將轉化抹在含有SC-ura培養基的平板上對所述串(yW/gc;￡-《/WL43-^;^的插入進行選擇並且在含有添加了遺傳黴素(geneticin)的SC-ura培養基的平板對兩種插入進行選擇。在30。C下培養2~3天後，單獨的菌落在5mL的SC-ura+遺傳黴素培養基(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g丄"減少尿嘧啶脫出混合液，2%葡萄糖，200mg丄"遺傳黴素，2%瓊脂)中培養過夜。從該培養物中分離總DNA(Sambrook和Russell,2000)。在特定位點的基因串的整合通過PCR來檢驗。所選的最菌抹之一為YIP-D0-01。實施例8:釀酒酵母中大腸桿菌MEP途徑基因的表達的評估為了檢驗所有釀酒酵母中大腸桿菌MEP途徑的7種基因的表達，通過發酵使用RT-PCR(反轉錄PCR)來評估它們的表達曲線。為了具體地檢測每種MEP途徑基因的表達，針對它們中的每一種都設計了一套特定的引物(圖5)並優化了PCR的條件。在震蕩燒瓶中培養菌抹YIP-DV-02和YIP-0V-02，使用半乳糖(20g丄")作為碳源，保持培養溫度在30。C並且以150rpm速度攪拌，樣本進入不同的生長階段並根據FastRNAProRed試劑盒(Qbiogene)提取總RNA。為了除去所含的任何的DNA的痕跡，根據TurboDNase-freeTM試劑盒(Ambion,FosterCity,CA)所述的標準條件應用TurboDNase(Ambion)隨後處理RNA樣本。然後將所述RNA樣本存放在-80。C下。在檢驗濃度和RNA樣本的同一性後，隨後進行RT-PCR。根據反轉錄延伸標準條件(Roche)使用每種MEP途徑基因特定的引物(表6)實施反轉錄的第一單鏈DNA的合成。通過將試管置於冰上使得反應停止。然後使用T叫DNA聚合酶和每種基因的特定的引物來實現PCR反應。dxs、";f、"p屍和(yW的退火溫度為55°C,和的為57°C，肌動蛋白為53X:(用於內標)。延伸溫度為90秒並且擴增進行35個循環。為了確定所觀察到DNA片段是從mRNA中擴增出來而不是從質粒DNA中擴增出來的，以與RT-PCR相同的條件但不使用反轉錄步驟來進行對照PCR。這些對照PCR顯示沒有或*1少量的來自DNA的汙染擴增，其並不影響RT-PCR試驗。表5通過RT-PCR評估MEP途徑基因的表達所用的引物tableseeoriginaldocumentpage32對於每種MEP途徑基因來說，mRNA都是特定地在釀酒酵母YIP-DV-02的較晚的培養階段在半乳糖耗盡之後發現的。在未用MEP途徑基因轉化的對照菌抹YIP-OV-02中沒有觀察到條帶(圖4)。該實驗清楚地顯示了7種MEP途徑基因在YIP-DV-02中的表達。實施例9:抑曱羥酶素對于震蕩燒瓶中表達MEP途徑基因的釀酒酵母生長的效果為了檢測含有來自於大腸桿菌的MEP途徑的釀酒酵母中MEP途徑的功能性，將抑曱羥酶素(mevinolin)作為曱羥戊酸途徑的抑制劑。然而，抑甲羥酶素是一種無活性內酯，但是在水解後形式下其為HMG-CoA還原酶的極度有效的抑制劑。在60。C下水浴1小時在乙醇的NaOH[15。/。(v/v)乙醇，0.25%(w/v)NaOH]中水解抑曱羥酶素。冷卻後，將20mg/ml的抑曱羥酶素的貝i備液過濾滅菌並且儲存在-20。C隨後使用。在含有定義的最少量的培養基(Verduyn等，1992,Yeast8:501),不同水平的抑曱羥酶素和作為碳源的20g/L的半乳糖的檢測試管中進行接種使其從預培養物到具有600nm下0.01的光學密度(OD)，並且在30°C和150rpm下培養，通過測量OD來跟蹤生長(圖5)。可以觀察到在抑曱羥酶素的存在下含有MEP途徑和朱欒倍半闢合酶的菌林(釀酒酵母YIP-DV-02)相對於僅具有天然甲羥戊酸途徑和朱欒倍半碎合酶(YIP-0V-01)的對照菌抹來說顯示出較好的生長。對照菌抹在20小時後在OD為大約12時完全停止生長，而表達MEP途徑的菌抹繼續生長了超過60小時並且到達了約30的OD(圖5)。這清楚地顯示了大腸桿菌MEP途徑在釀酒酵母YIP-DV-01菌抹中功能性表達。實施例10:用於類闢的原位分離的兩階段發酵為了有效積聚疏水和高揮發性的闢，可使用以互不溶的和生物適應的有機溶劑作為第二階段的兩階段發酵。兩階段發酵已經用於發酵過程中一些代謝物的原位分離(Frenz等，1989,EnzymeMicrob.Technol.11:717;Sim等，2001，Biotechnol.Lett.23:201)。在該實例中，將十二烷用於朱欒倍半碎的原位分離。檢測由表達MEP途徑和朱欒倍半闢合酶的釀酒酵母(YIP-DV-02)生成的朱欒倍半碎。作為參考，同樣培養僅表達朱欒倍半萜合酶的菌林(YIP-OV-Ol)。在第一個菌抹中，朱欒倍半闢合酶從半乳糖誘導啟動子進行表達，而在後一種菌抹中，朱欒倍半萜合酶從組成型TPI1啟動子開始表達。這意味著在菌抹之間在朱欒倍半碎生成水平中觀察到的差異是MEP途徑和同樣潛在的朱欒倍半碎合酶的啟動子的效果。為了確定每份微生物乾物質的碎的產率(生物量)，應用如下的步驟用菌抹YIP-0V-01或YIP-DV-02的過夜培養物在含有100ml的定義的最少量的培養基(Verduyn等，1992,Yeast8:501)和15g/L的半乳糖的長頸的用棉花封口的500ml的錐形燒瓶中進行接種，直到在600nm的光密度(OD)為0.05，並在30。C和150rpm下培養。當在600nm的OD到達1.0時，向每個震蕩燒瓶中添加10ml的十二烷(相當於10%的成熟培養基)。對於生長來說十二烷不顯示任何明顯的效果(數據未顯示)。在對數生長階段的末尾，一旦半乳糖被耗盡，將所述培養基離心通過GC-MS分析上層有機相的朱欒倍半萜(見下文)。添加十二烷之後的每小時檢測一次0D。當OD測量第一次顯示指數生長結束時即為半乳糖耗盡的時間。結果在表6中給出。該試驗證明了使用兩階段發酵用於原位分離揮發性類萜的朱欒倍半碎的可能性。表5顯示了含有MEP途徑的菌林與僅表達外源曱羥戊酸(MEV)途徑的菌林相比積聚了多大約IO倍的朱欒倍半萜。表6用於評估由具有15g/L的半乳糖的震蕩燒瓶中同一批生長的YIP-0V-01和YIP-DV-02菌抹生成的朱欒倍半碎的兩階段發酵tableseeoriginaldocumentpage35為了闢的分析和定量，按如下使用質譜儀和氣相色譜的組合:將裝有FinniganFocusDSQ質譜儀和ZB-5ms毛細柱(30mx250pmIDx0,25pm膜厚，Phenomenex)的FimiiganFocus的氣相色譜用於樣本的分析。使用GC柱溫程序80。C持續1min,10。C/min坡升至130°C,隨後3。C/min坡升至160°C，最後10。C/min坡升至270°C並在27(TC保持5min來進行GC-MS分析。1ml/min的氦氣作為載氣。在分流模式下運轉GC-MS0.8min並且之後打開分流閥以50ml/min進4亍分流。通過使用具有0.45nm孑L徑的硝化纖維過濾器(GelmanSciences,AnnArbor,MI)以細胞乾重確定生物量。首先，將過濾器在180W的微波爐中預乾燥10min,並稱重。過濾已知體積的細胞培養物，然後殘留物用蒸餾水洗滌。最後將過濾器在180W的微波爐中乾燥15min並稱重。按如下方法計算每生物量闢的濃度表3中100ml的生長培養基中相應的濃度以C=0.01*CV/0.1=CV/10來計算，Cv為如上所述的GC-MS建立起來的十二烷相中朱欒倍半闢的濃度。闢(朱欒倍半闢)生物量上的產率為積聚的朱欒倍半萜濃度除以積聚的生物量濃度(從十二烷添加的時刻到半乳糖的耗盡的時刻)。產率=(Cv/10)/(Xt-XQ),其中X為半乳糖的耗盡的時刻的生物量濃度(和朱欒倍半碎的量)，和Xo為十二烷添加的時刻的生物量濃度。生產力以積聚的朱欒倍半碎濃度除以積聚時間來計算。生產力=(Cv/10)/(Tt-To),其中Tt為半乳糖的耗盡的時刻(和朱欒倍半萜的量)，並且To為十二烷添加的時刻。試驗顯示出指數生長期在半乳糖上同一批的需氧生長過程中，朱欒倍半萜由YIP-DV-02以每g生成的生物量乾重為39.9pg的朱欒倍半萜的產率生成。這符合8.3pg每L培養基每小時的體積測定生產力(表6)。實施例11:表達來自於大腸桿菌的MEP途徑和具有曱羥戊酸途徑中的必要基因的缺失的釀酒酵母菌抹的構建通過用缺失盒進行轉化，將釀酒酵母YIP-00-02(MATa^T/)用於構建具有曱羥戊酸途徑中的必要基因的缺失的菌抹。用含為隨後的融合PCR連接到釀酒酵母基因組的的上遊和下遊區域的突出部分的引物，通過從質粒pWJ1077中PCR擴增[/iJ3標記來產生釀酒酵母基因的缺失盒(Reid等，2002，MethodsEnzymol.350，258-277)。使用釀酒酵母作為模板通過PCR獲得這些區域(圖6和表7)。獲得的4種片段通過融合PCR結合得到搭接部分《./.C/iL43標記的2種片段。根據Expand高保真的標準條件(RocheAppliedScience)實施PCR。在每個PCR和融合PCR步驟後將PCR產物用高純度PCR產物純化試劑盒(RocheAppliedScience)進行純化。表7用於的缺失的引物引物序列GACGAACTGGATGAGATGGgatccccgggaattgccatgGAGAGTTTCATGCTGCACCPr-b-KLcatggcaattcccggggatcGTGATTCTGGGTAGAAGATCG5'intCTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGCdK13'gtcagcggccgcatccctgcCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTG3'intGAGCAATGAACCCAATAACGAAATC￡/(7"dw_dKB，gcagggatgcggccgctgacCGATTGCATCTTGCTGAACCC五及G/3一dw一rCCAGAGGTCAAATTCCCTC^接頭(Adaptamers)用小寫字母顯示。使用標準方法(Gietz和Woods,2002)將得到的DNA片段用於轉化釀酒酵母YIP-00-02,並且由於體內同源重組，五及G/3被缺失。轉化抹在添加有曱羥戊酸(50mg/L),麥角甾醇(IOmg/L)和Tween80(0,5。/。)的SC-ura培養基上進行選擇。從每種轉化抹中分離出總DNA後通過診斷PCR(Sambrook和Russell,2000)和通過在存在/缺失甲幾戊酸，麥角甾醇或Tween80下的生長表現型來檢驗的正確缺失。獲得釀酒酵母菌抹MATaAerg^並命名為YIP-M0-06。通過在添加有5-氟乳清酸(5-FOA)(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少尿嘧啶脫出混合液，50mg/L尿嘧啶，1g/L5-FOA，2%葡萄糖，2%瓊脂)的合成培養基上培養已環出/.C/i^3標記之後，釀酒酵母YIP-M0-06(MATa&/7/Aerg/3)的代謝物需求可通過引入來自於大腸桿菌的MEP途徑來克服。通過用質粒pIPOOl和pIP002,pIPOOl和pIP003,pIPOOl和pIP004，pIPOOl和pIP005,或者質粒pIPOOl和pIP006轉化該菌抹，分別獲得菌抹YIP-DV-04(Aerg73MEP途徑和朱欒倍半碎合酶)，YIP-DC-03(Aerg/J,MEP途徑和蓽澄茄醇合酶)，YIP-DC-04(Aerg/3,MEP途徑和密碼子優化的蓽澄茄醇合酶)，YIP-DP-03(Aerg/3,MEP途徑和廣藿香醇合酶)和YIP-DP-04(Aerg73,MEP途徑和密碼子優化的廣藿香醇合酶)。實施例12:表達來自大腸桿菌的MEP途徑生成番茄烯的釀酒酵母菌林的構建通過將該菌林通過在添加有5-氟乳清酸(5-FOA)(6.7g/L無胺基酸的酵母氮基料，2g/L減少尿嘧啶脫出混合液，50mg/L尿嘧啶，1g/L5-FOA,2%葡萄糖，2%瓊脂)的合成培養基上劃板首先選擇釀酒酵母YIP-D0-01的wra3變異體。選4奪後的YIP-D0-01(MATawra3MEP)菌抹用於番茄烯生成基因的表達。番茄烯生物合成基因來源於草生歐文氏菌CEnWw/a/zerWco/a)的分別編碼焦磷酸香葉基香葉酯合酶，八氬番茄紅素合酶和八氬番茄紅素去飽和酶的基因(Genebank序號AAA21260)、c"5基因(Genebank序號AAA21264)和基因(Genebank序號AAA21263)。表達。改變密碼子而不改變胺基酸序列。合成三種cW密碼子優化的基因使其具有添加在基因末端的合適的限制性位點並且其最初克隆於pCR4TOPO質粒(Invitrogen)中，含有c"￡、和c"/基因的質粒分別命名為pIP033、pIP034和pIP035(圖7)。使用限制性酶消化pCR4TOPO質粒上的c"基因並將其亞克隆到酵母表達載體pESC-URA和pESC-HIS(Stratagene)中。pIP033和pESC-URA質粒DNA用Sacl和Notl限制性酶消化，並且進行瓊脂糖凝膠電泳。使用GFX凝膠條帶純化試劑盒(AmershamBiosciences)對得到的條帶進行凝膠純化，在體內連接，隨後轉化到大腸桿菌中，選擇轉化林並通過限制性分布分析和測序來檢驗轉化抹。將來自於顯示出cW五基因的正確連接的轉化抹轉入到pESC-URA載體中，將質粒pIP036純化並儲存。隨後將pIP035和pESC-HIS質粒DNA用Sacl和Spel限制性酶消化。得到的片段進行凝膠純化，體內連接，隨後轉化到大腸桿菌中，選擇轉化抹並且通過限制性分布和測序來檢驗轉化抹。將具有正確的cW/基因的轉化林轉化到pESC-HIS載體中，純化質粒(pIP037)。之後將pIP034和pIP037質粒DNA用Sail和Xhol限制性酶消化。以如上所述相同的方式獲得、純化和儲存質粒pIP038(將c^5基因轉入pIP037載體)。為了降低質粒的不穩定性和利於在釀酒酵母基因組中基因的進一步整合，將兩種質粒(pIP036和pIP38)結合在一起獲得質粒pIP039。兩種質粒的組合通過在釀酒酵母中使用缺口》爹複方法(DeMarini等，2001,BioTechniques30:520-52)實現。為了構建質粒pIP039，使用引物pfus—grf和pfus—grr(表l)通過PCR擴增含有cW/、cWS、G爿ZJ和G爿U0促進子，CrC7和v4Z)//7終止子(pIP038)的DNA片段。得到的PCR產物用高純度PCR產物純化試劑盒(RocheAppliedScience)進行純化。質粒pIP036(含有c〃￡的pESC-URA)用Mfel消化，凝膠電泳後使用QIAEXII凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。純化和消化後的質粒與PCR產物一起用於釀酒酵母YIP-00-03(MATawfl"的轉化。在含有SC-ura培養基的平板上選擇轉化抹。30。C下培養23天後，將所有的轉化抹在單獨的含有5mL的SC-ura的測試試管中接種並且在30。C下培養12小時。從該培養物中分離總DNA並將其用於隨後的化學感受態大腸桿菌DH5a細胞。轉化抹在添加了氨千青黴素的LB培養基的平板上進行選擇。然後通過純化質粒和用合適的限制性酶進行酶的消化來檢驗轉化抹。在轉化抹含有期望的質粒的情況下，純化l^g的質粒DNA並將其送檢測序。獲得含有、c^5和c^/基因的所得質粒pESC-URA並命名為pIP039。圖8顯示了不同的所構建的含有cW基因的pESC載體。用構建好的含有c〃/和的質粒pIP039轉化釀酒酵母YIP-D0-01(MATawr"3MEP)來構建表達大腸桿菌的MEP途徑生成番茄烯的釀酒酵母菌抹。所得的菌抹為YIP-DK-Ol。工業應用本發明的微生物用於複雜的闢化合物、它們的前體和它們的書f生物的生成。權利要求1.重組微生物，其含有將5-磷酸1-脫氧-D-木糖酮酯(DXP)轉變為焦磷酸異戊烯酯(IPP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)的外源途徑，而所述微生物的天然代謝缺乏該途徑。2.權利要求1所述的微生物，其進一步包含生成DXP的外源基因。3.權利要求1或2所述的微生物，其包含4-磷酸2-曱基赤藻糖醇酯(MEP)途徑的外源基因。4.權利要求2或3所述的微生物，其為真菌，優選為酵母屬。5.前述權利要求任一項所述的微生物，其含有編碼功能性的DXP還原異構酶、MEP胞苷醯基轉移酶、CDP-ME激酶、MECDP合酶、MECDP還原酶和HMBPP還原酶的外源基因。6.權利要求2所述的微生物，其含有編碼功能性的DXP合酶、DXP還原異構酶、MEP胞苷醯基轉移酶、CDP-ME激酶、MECDP合酶、MECDP還原酶和HMBPP還原酶的外源基因。7.前述權利要求任一項所述的微生物，其還包含編碼功能性闢合酶的至少一種外源基因。8.權利要求7所述的微生物，當在合適的微生物培養基上合成萜時，基於每g微生物乾重獲得至少lOOpg萜的產率。9.前述權利要求任一項所述的微生物，其進一步包含編碼功能性單闢合酶、倍半薛合酶和/或二碎合酶的至少一種外源基因。10.前述權利要求任一項所述的微生物，其中外源途徑的基因存在於微生物的質粒中。11.權利要求IO所述的微生物，其含有兩種質粒，每種質粒包含至少3種外源途徑的基因。12.權利要求10所述的微生物，其含有至少兩種(2)質粒，這些質粒共同包含dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、gcpE、lytB基因和編碼路合酶的基因。13.權利要求12所述的微生物，其中所述基因承載於兩種質粒上。14.權利要求1~9任一項所述的微生物，其中編碼外源途徑的基因被整合到微生物的基因組中。15.根據權利要求4所述的微生物，該微生物為保藏號DSM17900的釀酒酵母菌抹YIP-DV-02。16.—種在微生物細胞和/或培養基中積聚闢的方法，其中所述微生物為根據權利要求1~15任一項所述的重組微生物。17.權利要求16所述的方法，包含在適合的培養基中培養所述微生物的步驟。18.生成闢的方法，該方法包含在適合所述碎生成的培養基上培養權利要求1~15任一項所述的微生物的步驟和非強制性選擇的從所述培養基和/或所述微生物中分離該萜的步驟。19.權利要求17或18所述的方法，其中培養微生物的步驟至少部分通過兩階段發酵來實施。20.製備能夠積聚和/或生成碎的重組微生物的方法，該方法包括轉化這樣的微生物的步驟，該微生物缺乏天然MEP途徑並具有外源MEP途徑基因和至少一種編碼闢合酶的基因。21.增加缺乏天然MEP途徑的微生物中薛前體含量的方法，該方法包括轉化具有外源MEP途徑基因和非強制性選擇的編碼碎合酶的至少一種基因的微生物的步驟。全文摘要本發明涉及一種用於生成萜的方法和用於該方法的MEP轉化後的微生物。公開了一種能夠生成選擇的萜的微生物，所述微生物表達外源途徑，該途徑用於類萜單元並且優選外源萜合酶的形成。用這種方法，可從微生物的培養基中分離出高含量的萜。文檔編號C12N15/52GK101384719SQ200780005285公開日2009年3月11日申請日期2007年2月13日優先權日2006年2月14日發明者卡斯珀·默勒,安東尼·克拉克,延斯·尼爾森,熱羅姆·莫裡,穆罕默德·阿里·阿薩多拉希,米歇爾·沙爾克申請人:弗門尼舍有限公司