一種羰基還原酶、基因和突變體及在不對稱還原羰基化合物中的應用的製作方法
2023-12-01 10:10:36
專利名稱:一種羰基還原酶、基因和突變體及在不對稱還原羰基化合物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域：
，具體涉及一種羰基還原酶及其基因和突變體，含 有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，其重組酶和該重組酶的製備方法，以及該羰基還原酶或其重組酶作為催化劑在不對稱還原手性羰基化合物以製備光學活性手性醇中的應用。
背景技術：
手性醇是許多暢銷藥物及手性化學品的重要中間體。例如，(R)-鄰氯扁桃酸甲酯(分子式為 O-Cl-C6H4CH(OH)COOCH3,分子量為 200. 62，CAS 號=32345-59-8)是合成血小板聚集抑制劑氯吡格雷的重要手性中間體。氯吡格雷是一種二磷酸腺苷(ADP)受體阻滯劑，可與血小板膜表面ADP受體結合，使纖維蛋白原無法與糖蛋白GP II b/III a受體結合，從而抑制血小板相互聚集，主要用於治療急性心肌梗死，在國內具有廣泛的市場。(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(分子式為C6H5 (CH2)2CH(OH) COOCH2CH3,分子量為208. 25，CAS號90315-82-5)是合成多種血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)普利藥物，如貝那普利、西拉普利等的重要手性砌塊。該類藥物主要用於治療高血壓、充血性心力衰竭等疾病。(R) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯(分子式為 ClCH2CH(OH) CH2C00CH2CH3，分子量為 166. 60，CAS號90866-33-4)是L-肉鹼的重要手性中間體。L-肉鹼是一種促使脂肪轉化為能量的類胺基酸，服用L-肉鹼能夠在減少身體脂肪、降低體重的同時，不減少水分和肌肉，在2003年被國際肥胖健康組織認定為最安全無副作用的減肥營養補充品。因此，研究上述光學純手性醇的手性合成製備具有廣闊的應用前景。
光學活性手性醇的合成有化學法和生物法兩種。與化學方法相比，生物法具有反應條件溫和、轉化率高、對映體選擇性高等多種優點，特別是生物催化的羰基不對稱還原反應在手性醇不對稱合成中的應用越來越受到重視。
(R)-鄰氯扁桃酸或其衍生物酯的生物不對稱合成方法主要有腈水解酶催化的鄰氯扁桃腈的不對稱水解以及羰基還原酶催化的鄰氯苯甲醯甲酸酯的不對稱還原。張志鈞等用糞產鹼桿菌(Alcaligenes sp. E⑶0401)來源的腈水解酶在水-甲苯兩相體系中催化消旋鄰氯扁桃腈的動態動力學水解拆分製備(R)-鄰氯扁桃酸，底物濃度為200mM，產物的對映體過量值(ee)為 90. 4%，產率為 76. 5% (J. Biotechnol. 2011，152，24-29)。Ema 等用麵包酵母來源的羰基還原酶Gre2p催化鄰氯苯甲醯甲酸甲酯不對稱還原製備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯，底物濃度為200g/L，產物的ee值高於99%以上，分離得率為89% (Adv. Synth.Catal. 2008，350，2039-2044)。為實現高的產率，該反應額外添加了 lg/L的NADP+輔酶，由於輔酶價格昂貴，使得該反應不盡如人意。(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的製備通常是採用野生菌或重組工程菌的細胞或游離酶催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不對稱還原的方法。在已報導的應用中，底物濃度的最高水平是400mM(82g/L)，所用催化劑為預處理的麵包酵母(Baker’s yeast),但是反應48h後僅有41. 9%的底物轉化成(R)-2-輕基-4-苯基丁酸乙酯，且對映體過量值(ee)只有 87. 5% (Biocatal. Biotransfor. 2009，27，211-218)。其他的一些報導中可以獲得高光學純度的產物，但是產物濃度一般都很低，不具備產業化的可行性。Zhang等用克魯氏假絲酵母(Candida krusei SW2026)催化製備(R)_2_輕基-4-苯基丁酸乙酯，底物濃度為2. 5g/L時，ee值達99. 7 %，分離得率為95.1%。但當底物濃度提高到 20g/L後，ee 值降低到 97. 4% (Process Biochemistry 2009,44,1270-1275)。Lavandera等用重組醇脫氫酶催化5g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯還原製備(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，產物的ee值高於99%，但是反應中需要外源添加ImM NADH，大幅度提高了其成本(ChemSusChem 2008,1,431-436)。林文清等用篩選的博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)等菌株，在水相和水/有機兩相兩相體系中，催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不對稱還原，產品ee值為84. 9% 98.9%，且報導的最高產物濃度僅為50g/L(中國專利，公開號CN101314784A)。揭色擲抱酵母(Sporobolomyces salmonicolor)來源的醒還原酶SSAR可以催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不對稱還原製備(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，底物濃度可以達到300g/L，但是ee值為91. 7%，並不盡如人意。因此針對以上敘述的三個底物，尋找一種羰基還原酶，能夠催化高底物濃度下的高立體選擇性不對稱還原，反應過程中無需額外加入輔酶或者添加極少量輔酶，無疑具有廣泛的應用前景
發明內容
因此，本發明所要解決的技術問題是，針對已報導的生物催化不對稱還原製備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯、(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯和(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的反應中需要不同來源的酶、酶催化活性偏低、產物濃度低、光學純度不高，而且需要額外添加昂貴輔酶等問題，提供了一種催化活性高、對映選擇性強、底物耐受性好的羰基還原酶，該羰基還原酶的基因，含有該基因的重組表達載體、重組表達轉化體及其高效製備方法，以及該羰基還原酶在催化羰基底物不對稱還原中的用途。
本發明通過下述技術方案以解決上述技術問題
本發明採取的技術方案之一是一種分離的蛋白質，其是如下(a)或(b)的蛋白質
(a)由序列表中SEQ ID No. 2所示胺基酸序列組成的蛋白質；
(b)在(a)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有羰基還原酶活性的由(a)衍生的並和(a)的胺基酸序列至少62%相同的蛋白質。
SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列組成的蛋白質來源於光滑假絲酵母(Candidaglabrata) CGMCC 2. 234,具有羰基還原酶的功能,是一種新的羰基還原酶。
所述的SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列組成的蛋白質可以從光滑假絲酵母(Candida glabrata) CGMCC 2. 234中分離獲得,也可以從重組表達該蛋白質的表達轉化體中分離獲得，也可以人工合成獲得。
SEQ ID No. 2所示的羰基還原酶和其他已知羰基還原酶的同源性(即胺基酸序列相似性)見表I。本發明中胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示的羰基還原酶與已知羰基還原酶的胺基酸序列的同源性低於62%，具有顯著差異性。
表I.本發明的新羰基還原酶和其他已知羰基還原酶的同源性
權利要求
1.一種分離的蛋白質，其特徵在於其是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中SEQID No. 2所不氣基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有羰基還原酶活性的由(a)衍生的並和(a)的胺基酸序列至少62%相同的蛋白質。
2.如權利要求
I所述的的蛋白質，其特徵在於，所述的(b)蛋白質是在(a)的胺基酸序列的第85位、第92位、第94位、第99位和第174位胺基酸中的一位或多位經過取代一個胺基酸且具有羰基還原酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
3.一種分離的核酸，其特徵在於其是如下(I)或(2)的核酸 序列表中SEQID No. I所示核苷酸序列組成的核酸；(2)編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因(a)由序列表中SEQID No. 2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有羰基還原酶活性的由(a)衍生的並和(a)的胺基酸序列至少62%相同的蛋白質。
4.一種包含如權利要求
3所述的核酸的重組表達載體。
5.一種包含如權利要求
4所述的重組表達載體的重組表達轉化體。
6.一種重組羰基還原酶的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟培養如權利要求
5所述的重組表達轉化體，從培養物中獲得重組羰基還原酶。
7.—種如權利要求
I 2任一項所述的蛋白質在催化前手性羰基化合物進行不對稱還原反應形成手性醇中的應用。
8. 如權利要求
7所述的應用，其特徵在於，所述的應用包括下述方法在pH5.5 7.0的水溶液中，在葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在如權利要求
I 2任一項所述的蛋白質的催化下，前手性羰基化合物進行不對稱還原反應，形成光學活性手性醇。
9.如權利要求
8所述的應用，其特徵在於，所述蛋白質用量為5 60kU/L，葡萄糖脫氫酶的用量為5 60kU/L，葡萄糖的用量為5 600g/L，NADP+的用量為O O. 5mmol/L，所述前手性羰基化合物的濃度為lOmmol/L 2. Omol/L，所述pH 5. 5 7. O的水溶液為磷酸鹽緩衝液，反應溫度為20 35°C。
10.如權利要求
7 8任一項所述的應用，其特徵在於，所述的前手性羰基化合物為如式I、2或3所示的化合物
專利摘要
本發明公開了一種新的羰基還原酶、基因及其突變體，含有該基因及突變體的重組表達載體和重組表達轉化體，該重組酶製備方法，以及該羰基還原酶和重組酶在不對稱還原前手性羰基化合物製備活性手性醇中的應用。本發明的羰基還原酶來源於光滑假絲酵母，應用於(R)-鄰氯扁桃酸甲酯、(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯、(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯等多種光學活性手性醇的製備。與其他製備方法相比，本方法催化製備的產物濃度高，不需要額外添加或少量添加昂貴的輔酶，產物光學純度高，具有反應條件溫和，操作簡便，易於放大等優勢，因此在氯吡格雷、L-肉鹼以及普利類降壓藥物中間體的生產中具有很好的工業應用前景。
文檔編號C12R1/72GKCN102618513SQ201210136823
公開日2012年8月1日 申請日期2012年5月4日
發明者李春秀, 潘江, 許建和, 鬱惠蕾, 鄭高偉, 馬宏敏 申請人:華東理工大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan