水稻高葉綠素含量突變基因det1及其重組植物超表達載體的製作方法

2023-12-02 01:00:06

專利名稱：水稻高葉綠素含量突變基因det1及其重組植物超表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因，特別涉及水稻高葉綠素含量突變基因DET1 ，還涉及該突變 基因的重組植物超表達載體。
背景技術：
水稻是C3植物，其光呼吸較強，有效光合速率較低，尤其是在高溫伏旱區水稻的灌 漿期，由於氣溫高，其光呼吸將浪費大量的光合產物，不但會影響產量，還會嚴重影響米質。 因此，提高有效光合速率是提高水稻產量和改善米質的一條有效途徑。提高有效光合速率 的途徑是降低光呼吸或提高光合速率，而C3植物的生理和解剖結構決定了其高光呼吸特 性，由於葉綠素是水稻光合作用必備的物質基礎，因此，通過提高葉綠素含量來提高光合速 率是提高水稻有效光合速率的一條有效途徑。發明人在前期研究工作中發現了一個由簡單遺傳的高葉綠素性狀的突變株系， 並對其遺傳行為和生理功能進行了研究，結果表明該性狀由顯性單基因控制；該基因的主 要生理功能是通過顯著提高葉綠素b的含量來實現總葉綠素含量的提高，從而通過提高 對光能的「捕捉」能力來提高光合速率，可提高生物產量和經濟產量16%以上，降低堊白 粒率17%左右；分子標記定位結果顯示該基因定位於水稻第1染色體短臂，與微衛星標記 RM 6464、RM6340和RM462之間的遺傳距離分別為0cM、0. 588cM和1. 18cM(李賢勇等.一 個水稻高葉綠素含量基因的發現.西南農業學報，2002，15 (4) :122-123;李賢勇等.一個 水稻高葉綠素基因的生物學特性研究.西南農業學報，2004，17 (3) 292-294 ；Wang FH et al. Heredity,physiology and mapping of a chlorophyll content gene of rice(Oryza sativa L.). Journal of Plant Physiology, 2008,165(3) :324_330)。因此，確定該基因的 核苷酸序列，將有利於高產優質水稻的育種研究，促進水稻生產上一個新的臺階。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供水稻高葉綠素含量突變基因的核苷酸序 列；目的之二在於提供所述水稻高葉綠素含量突變基因的重組植物超表達載體，從而為水 稻轉基因研究提供有力的工具，促進高產優質水稻的育種研究。為達到上述目的，首先，本發明提供了水稻高葉綠素含量突變基因DET1，具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發明在前期基因定位的基礎上，先通過基因預測、同源搜索及基因序列差異比 較，初步確定了水稻高葉綠素含量突變基因為DETl (DE-ETIOLATED 1)。隨後，本發明以水稻 高葉綠素突變體為材料，克隆了突變基因DETl的cDNA。測序結果顯示突變基因DETl全 長cDNA為1536bp，由11個外顯子組成，編碼512個胺基酸。與野生型珍汕97B相比，突變 基因DETl在第7個外顯子上有T-C的轉換，該改變引入了一個EcoR I酶切位點，並導致第 328位的亮氨酸(L)改變為絲氨酸(S)，且突變位點處於高度保守區域內。突變基因DETl的胺基酸序列與玉米等其它高等植物的胺基酸序列同源性高達62%以上。其次，本發明提供了含有所述水稻高葉綠素含量突變基因DETl的重組植物超表 達載體。進一步，所述重組植物超表達載體是在pCUPHN載體的多克隆位點中插入水稻高 葉綠素含量突變基因DETl而獲得；所述pCUPHN載體由pCAMBIA_1300載體改造而來，即在 pCAMBIA-1300載體的多克隆位點處通過限制性內切酶PstI引入玉米泛素啟動子基因，之 後通過Sac I和Spe I引入HA標籤基因，再通過Spe I及EcoR I引入終止子NOS基因。本發明的有益效果在於本發明提供了一個與水稻葉綠素含量提高相關的突變基 因DET1，並構建了其重組植物超表達載體，為水稻轉基因研究提供了有力的工具，可促進高 產優質水稻的育種研究。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖1為基因DETl的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑑定，1泳道為DL2，000DNA Marker，2泳道為空白對照，3泳道為DETl (高葉綠素突變體)的RT-PCR產物， 4泳道為DETl (野生型)的RT-PCR產物；圖2為重組載體pMD19T-DETl的酶切鑑定，1泳道為DNA Marker III，2泳道為Spe I酶切pMD19T-DETl (高葉綠素突變體)，3泳道為Spe I/BamH I酶切pMD19T_DETl (高葉 綠素突變體)，4泳道為Spe I酶切pMD19T-DETl(野生型)，5泳道為Spe I/BamH I酶切 PMD19T-DET1 (野生型)；圖3為基因DETl包含突變位點的部分核苷酸序列對比結果，下劃線部分為突變引 入的EcoR I酶切位點；圖4為基因DETl編碼蛋白的胺基酸同源性對比結果，箭頭所指處為基因DETl的 突變位點，下劃線所示區域為基因DETl的高度保守區域；圖5為基因DETl的系統進化樹；圖6為基因DETl編碼蛋白的親水性和疏水性分析；圖7為突變基因DETl重組植物超表達載體pCUPHN-DETl的構建示意圖；圖8為突變基因DETl重組植物超表達載體pCUPHN-DETl的PCR鑑定，1泳道為 DNAMarker III，2泳道為空白對照，3泳道為pCUPHN-DETl的PCR產物，4泳道為pCUPHN的 PCR產物(陰性對照)，5泳道為pMD19T-DETl的PCR產物(陽性對照)；圖9為突變基因DETl重組植物超表達載體pCUPHN-DETl的酶切鑑定，1泳道為 λ -Hind III DNA Marker，2 泳道為 Spe I 酶切 pCUPHN-DETl，3 泳道為 Spe I/BamH I 酶切 pCUPHN-DETl，4 泳道為 Spe I 酶切 pCUPHN，5 泳道為 Spe I/BamH I 酶切 pCUPHN，6 泳道為 DNA Marker III。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。優選實施例中使用的材料野生型水稻材料珍汕97B(Wt.)和高葉綠素突變體(Mut.)由重慶市農業科學研究院提供；M-MLV逆轉錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、PMD19-T載體、Trizo 1試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、 質粒提取試劑盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL2, 000DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青黴素(Ampicillin，Amp)和卡拉 黴素(Kanamycin，Kan)為Sigma公司產品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有 限公司完成；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；大腸桿菌JM109、農桿菌 GV3101由本實驗室保存。本發明在前期基因精細定位的基礎上，首先通過在線基因預測(http://mendel. cs. rhul. ac. uk)及 BLAST 在線比對(http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/)，初步確定了水稻 高葉綠素含量突變基因為DET1。基因DETl在番茄、擬南芥、玉米、高粱中有報導。在番茄 中，基因DETl使總葉綠素含量提高，整個植株均表現為深綠色。在擬南芥中，基因DETl調 控一光調控啟動子的啟動能力，當喜光植物擬南芥處於黑暗環境中時，基因DETl通過時空 調節光調控啟動子的啟動能力；此外，基因DETl還可以通過調節蛋白酶體的降解來調控擬 南芥的晝夜紀律鍾。隨後，本發明以水稻高葉綠素突變體為材料，克隆了突變基因DETl的cDNA，利用 生物信息學手段對突變基因DETl的核苷酸序列、進化樹、編碼蛋白的理化性質及親疏水性 等進行了分析，並構建了突變基因DETl重組植物超表達載體用於水稻的轉基因研究。一、突變基因DETl的克隆與測序根據GenBank已登錄的水稻日本晴基因DETl序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0 軟體設計特異引物上遊引物 DETlF :5，-cggatccggtgatggcgaccttcttc-3，(SEQID No. 2)， 下劃線部分為 BamH I 酶切位點；下遊引物 DETlR :5'-ggactagtccg-ctcacaactgttacaaatac -3』 (SEQ ID No. 3)，下劃線部分為Spe I酶切位點。分別取水稻野生型和高葉綠素突變體光照培養兩周的幼葉2g，迅速放入液氮中研 磨成粉末，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA。所得水稻野生型和高葉綠素突變體總RNA 的電泳結果顯示主帶清晰完整，28S和18S的條帶亮度比約為2 1，說明RNA的濃度和純 度符合實驗要求，可以用於合成雙鏈cDNA。分別以所得水稻野生型和高葉綠素突變體總RNA為模板，按照M-MLV逆轉錄酶說 明書，使用Oligo(dT)引物進行逆轉錄獲得cDNA ；再以逆轉錄合成的cDNA為模板，採用特 異引物DET1F/DET1R及高保真DNA聚合酶PFU進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性 4分鐘；然後94°C變性30秒，60°C復性30秒，72°C延伸2分鐘，共32個循環；最後72°C延 伸10分鐘。將RT-PCR產物進行1. 0% (g/mL)瓊脂糖凝膠電泳檢測，再按照DNA凝膠回收 試劑盒說明書進行切膠回收純化；純化的DNA片段與pMD19-T載體在T4DNA連接酶的作用 下於16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平 板篩選陽性克隆，提取質粒，酶切鑑定片段大小後測序，得重組載體PMD19T-DET1。基因DETl的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑑定如圖1所示，可見DETl (野生型) 和DETl (高葉綠素突變體)的RT-PCR產物均在約1600bp處呈單一特異性條帶，與GenBank 報導的基因DETl大小相符。
重組載體pMD19T-DETl的酶切鑑定結果如圖2所示，可見pMD19T_DETl (野生型) 和pMD19T-DETl (高葉綠素突變體)用Spe I/BamH I雙酶切均可得到約1600bp的目的片 段，與預期結果相符，證實目的片段已連入PMD19-T載體且為正向連接。測序結果顯示，水稻野生型和高葉綠素突變體的DETl全長cDNA均為1536bp，編 碼512個胺基酸。其中，高葉綠素突變體的DETl全長cDNA序列如SEQ ID No. 1所示。基 因DETl包含突變位點的部分核苷酸序列對比結果如圖3所示，與野生型相比，高葉綠素突 變體的基因DETl由11個外顯子組成，在第7個外顯子上發生了 1個鹼基突變，即第983位 的T突變為C，該突變引入了一個EcoR I酶切位點，並導致了編碼蛋白第328位胺基酸的差 異，野生型為亮氨酸(Leu)，高葉綠素突變體為絲氨酸(Ser)。二、突變基因DETl的生物信息學分析禾IjM NCBI ψ 白勺 ORF Finder (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html) it 開放賣框i只另ll ；^1Jffl CDD(conserved domain database) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)進行蛋白質保守結構域分析；利用Clustalx和DNA Man軟 件進行胺基酸序列的比對及進化樹的生成；利用ExPASy (http ://Cn. expasy. org/)在線分 析蛋白質結構及其理化特性。ORF Finder軟體分析顯示突變基因DETl由一個完整且連續的開放閱讀框組成。⑶D分析顯示基因DETl有兩個高度保守區域，分別為從第282到336位胺基酸和 第400到442位胺基酸，突變基因DETl的突變位點發生在第一個高度保守區域內。突變基因DETl編碼蛋白的胺基酸序列比對結果如圖4所示，突變基因DETl (圖中 表示為 OsDETl)與擬南芥 AtDETl (GenBank 登錄號為 NP_192756)、番茄 SlDETl (GenBank 登 錄號為 Q9ZNU6)、高粱 SbDETl (GenBank 登錄號為 XP_002443935)、玉米 ZmDETl (GenBank 登 錄號為NP_001147932)及蓖麻RcDETl (GenBank登錄號為XP_002519399)編碼蛋白的同源 性高達62%以上，且突變位點發生在高度保守區域內。突變基因DETl的系統進化樹如圖5所示，突變基因DETl (圖中表示為OsDETl)與 高粱SbDETl的親緣性較近，與玉米ZmDETl的親緣性次之。突變基因DETl編碼蛋白的組成及理化性質分析表明其編碼蛋白由512個胺基酸 組成，相對分子質量為59126. 8，分子式為C2683H4mciN716O768S16，等電點(pi)為7. 65，絲氨酸含 量高達10. 6%。通過在線軟體ExPASy中的ProtParam工具對突變基因DETl編碼蛋白進行親疏 水性分析，結果如圖6所示，統計結果顯示GRAVY (Grand average ofhydropathicity)值 為-0. 098，說明突變基因DETl編碼的蛋白質為親水性蛋白質，這可能與基因的功能相關， 因為葉綠素的合成是一個需要水參與的過程，該基因產物的親水性增加，有利於水分的運 輸，從而加快葉綠素的生物合成。三、突變基因DETl重組植物超表達載體的構建pCUPHN載體由pCAMBIA-1300載體改造而來，即在pCAMBIA_1300載體的多克隆位 點處通過限制性內切酶Pst I引入玉米泛素啟動子(Ubi Promter)基因，之後通過Sac I 及SpeI引入HA標籤(tag)基因，再通過Spe I及EcoR I引入了終止子NOS基因。玉米泛 素啟動子具有較強的啟動能力，特別適合於在禾本科植物中應用。HA tag儘管不是雙元表 達載體中所必須的，但它的引入為將來分離純化基因的表達產物提供了很大便利。PCUPHN載體適用於所有植物基因的表達。將含有突變基因DETl的重組載體PMD19T-DET1用BamH I/Spe I雙酶切，回收突變基因DETl片段，再與同樣經BamH I/Spe I雙酶切的pCUPHN載體在T4DNA連接酶的 作用下於16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，用含有卡拉黴素的LB 平板篩選陽性克隆，提取質粒，PCR和酶切鑑定，即得突變基因DETl重組植物超表達載體 pCUPHN-DETl，其構建過程如圖7所示。隨後將pCUPHN_DETl轉化農桿菌GV3103，-80°C保 存備用。突變基因DETl重組植物超表達載體pCUPHN-DETl的PCR鑑定和酶切鑑定結果分 別如圖8和圖9所示，目的片段突變基因DETl已經連入pCUPHN載體中。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和範圍。
權利要求
水稻高葉綠素含量突變基因DET1，其特徵在於具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述水稻高葉綠素含量突變基因DET1的重組植物超表達載體。
3.根據權利要求2所述的重組植物超表達載體，其特徵在於所述重組植物超表達載 體是在PCUPHN載體的多克隆位點中插入水稻高葉綠素含量突變基因DET1而獲得；所述 pCUPHN載體由pCAMBIA-1300載體改造而來，即在pCAMBIA_1300載體的多克隆位點處通過 限制性內切酶Pst I引入玉米泛素啟動子基因，之後通過Sac I和Spe I引入HA標籤基因， 再通過Spe I及EcoR I引入終止子N0S基因。
全文摘要
本發明公開了水稻高葉綠素含量突變基因DET1，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，還公開了含有該突變基因的重組植物超表達載體，為水稻轉基因研究提供了有力的工具，可促進高產優質水稻的育種研究。
文檔編號C12N15/29GK101831439SQ201010177039
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月19日 優先權日2010年5月19日
發明者嶽彩黎, 王貴學, 秦峰, 胡鋒, 黃俊麗 申請人:重慶大學