一種降低牛乳過敏蛋白免疫特性的方法

2023-12-02 03:01:56

一種降低牛乳過敏蛋白免疫特性的方法
【專利摘要】一種降低牛乳過敏蛋白免疫特性的方法，其特徵是按以下步驟：（1）用0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩衝液將β-乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的蛋白溶液；（2）將步驟（1）配製好的β-乳球蛋白溶液分裝於密閉的PE管內，浸沒於水浴超聲處理裝置，頻率設定為40KHz，功率300W，處理時間30min。本發明實現了降低牛乳β-乳球蛋白的潛在致敏性的目的，經過超聲波處理後β-乳球蛋白，通過競爭抑制性ELISA方法分析，其過敏原性顯著降低，IgE的結合能力降低83.8%。
【專利說明】一種降低牛乳過敏蛋白免疫特性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種通過非熱加工技術降低牛乳過敏原β-乳球蛋白潛在致敏性的方法。
【背景技術】
[0002]乳球蛋白是牛乳中主要的過敏原之一。由於乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，因此該蛋白經過人體胃腸道消化後，還會有部分完整的β_乳球蛋白或其肽段，容易導致過敏人群產生過敏反應。因此利用各種加工手段降低β_乳球蛋白的過敏原性，可保障過敏人群的安全食用。
食物過敏原不是通過完整的蛋白質分子產生過敏反應，這些引起食物過敏反應的免疫學物質基礎就是過敏原表位。而表位包括線性表位和構象性表位，是其過敏原性的結構基礎。
[0003]目前已有用於降低牛乳過敏原蛋白β_乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化學加工、物理加工等技術。其中，生物加工是利用基因工程技術改變過敏蛋白的基因序列；化學加工則通過酶改性和糖基化等方式改變過敏原蛋白的結構，從而達到降低其致敏性的目的。然而這些技術均存在一定的局限性:β_乳球蛋白主要是以構象性表位為主，難以通過序列變化大幅度改變構象性表位；而β_乳球蛋白具有耐酶解特性，導致酶改性的效果不佳，且糖基化過程中產生的中間產物，會引起人們對食物安全性的考慮。
[0004]物理加工又可分為熱加工和非熱加工。熱加工是牛乳及其乳製品生產過程中常用的滅菌技術，加熱過程中會導致牛乳過敏蛋白產生去摺疊或聚合等結構變化，從而誘導牛乳過敏蛋白的潛在致敏性的改變。但是，熱加工也會致使牛乳中部分營養物質的損失。而非熱加工技術不僅能實現熱加工預期的加工效果，並能降低食品中有害微生物菌群的數量，同時可維持食品原有的感官和營養品質，保留其中的熱敏性營養成分。在非熱加工處理中，同時改變牛乳的潛在致敏性。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種降低牛乳過敏蛋白免疫特性的方法。
[0006]本發明所要解決的技術問題通過以下步驟來實現。
[0007](I)製備蛋白溶液:用0.05Μ，ρΗ6.8的磷酸鹽緩衝液將乳球蛋白稀釋成
0.2mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0008](2)將步驟(1)配製好的β -乳球蛋白溶液分裝於密閉的PE管內，浸沒於水浴超聲處理裝置，頻率設定為40ΚΗζ，功率為300W，樣品處理時間分別為30min。
[0009]水浴超聲處理裝置內部盛滿樣品，超聲傳感器附著於液體容器外側，並且釋放出超聲波福射樣品。
[0010]本發明建立了一種非熱加工方法，即超聲波技術，實現降低牛乳β-乳球蛋白的潛在致敏性。超聲加工 技術應用於蛋白改性主要是依據蛋白質具有聲空穴現象，當液體蛋白受到超聲波衝擊時，一系列的擠壓和折射波引起液體介質中蛋白分子的變化。超聲波處理的蛋白，其分子性能發生了很大的變化，這是由於超聲處理是將電負性基團引入蛋白分子中的過程，增大蛋白分子的靜電斥力，使其趨於分散，且構象發生變化，且蛋白與水分子之間的相互作用增強，因此溶解性和聚穩定性提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]附圖1為本發明超聲處理對β-乳球蛋白IgE結合能力的影響。
【具體實施方式】
[0012]本發明將通過以下實施例作進一步說明。
[0013]實施例1。
[0014]1、材料。
[0015]I)配製緩衝液:稱取8.775g磷酸氫二鈉，3.975g磷酸二氫鈉，超純水溶解並定容至1L，配製成0.05M, pH6.8的磷酸鹽緩衝液。
[0016]2)製備蛋白溶液:用0.05M，ρΗ6.8的磷酸鹽緩衝液將β-乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0017]2、方法。
[0018]I)超聲波技術處理β -乳球蛋白
超聲波處理:將配製好的乳球蛋白溶液分裝於密閉的PE管內，浸沒於水浴超聲處理裝置(40KHz，300W)，樣品處理時間分別為10、20、30、40、50、60min。
[0019]2) 乳球蛋白致敏性變化的定量分析。
[0020]超聲波處理後的β_乳球蛋白溶液作為被分析的蛋白樣品，通過競爭抑制性ELISA檢測其潛在致敏性的變化。對照未處理蛋白，可以判斷出該過敏蛋白潛在致敏性的降低程度。
[0021]3)檢測超聲處理後的乳球蛋白的致敏性變化
⑴構建牛乳過敏患者血清池:選定11位符合既定條件的牛乳過敏患者的血清混合製備而成。這些患者的血清符合以下條件:對牛乳過敏呈陽性；總的IgE水平均>100 IU/mL ；特異性IgE水平均>1 IU/mL。
[0022]⑵抗原包被:將不同超聲波處理時間後的各個乳球蛋白溶液稀釋至2.5yg /mL，在一塊酶標板上分別包被上100 μ L，以未處理的β-乳球蛋白溶液為對照。4°C過夜後PBST洗板三次，每次5min。
[0023]⑶明膠封阻:每孔加入250 μ L 3%明膠，37°C封阻lh。洗板三次。
[0024]⑷一抗反應:另準備一塊酶標板以同樣的方式進行封阻，洗滌之後，每孔加入1:20稀釋度的人血清100 μ L，37°C反應lh。反應時間結束後，每孔吸取100 μ L轉移至第一塊板內，37 °C孵育Ih，PBST洗板三次。
[0025](5)二抗反應:每孔加入1:5000稀釋度的生物素標記羊抗人IgE 二抗100 μ L, 37°C反應lh。PBST洗板。
[0026](6)親和素反應:每孔加入1:60稀釋的HRP-鏈黴素標記的親和素100 μ L,37°C反應，洗板。(7) OPD顯色和檢測:每孔加入100 μ L現配製的OPD顯色液，37°C避光反應15min，反應結束後每孔50 μ L加入2Μ H2SO4終止液，在490nm處用酶標儀測定OD值
(8)結果的計算,IgE結合能力(%) = (1-B/B。)X 100%, B0:無競爭蛋白時的OD值；B:各加工條件下競爭蛋白對應的OD值。
[0027]3、結果。[0028]經過超聲波處理後β -乳球蛋白，通過競爭抑制性ELISA方法分析其IgE結合能力的變化即潛在致敏性變化，如附圖1所示。經過20min、40min、50min及60min的超聲處理的β -乳球蛋白，過敏原性幾乎無變化。但經過IOmin和30min的超聲處理的β -乳球蛋白樣品，其過敏原性均有顯著降低，其中30min的超聲處理可使其IgE的結合能力降低最明顯。
【權利要求】
1.一種降低牛乳過敏蛋白免疫特性的方法，其特徵是按以下步驟:(1)用0.05M, pH6.8的磷酸鹽緩衝液將β -乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的蛋白溶液； (2)將步驟(1)配製好的β-乳球蛋白溶液分裝於密閉的PE管內，浸沒於水浴超聲處理裝置，頻 率設定為40ΚΗζ，功率300W，處理時間30min。
【文檔編號】C07K1/113GK103910792SQ201410148144
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】陳紅兵, 李欣, 白雨鑫, 高金燕, 龍偉, 吳志華, 楊安樹, 佟平 申請人:南昌大學