一種測定富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法

2023-12-02 03:13:06 2

一種測定富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法，該方法用胰蛋白酶溶液酶解法除蛋白質，消除了生物基質樣品中蛋白質對測定四環素的幹擾，避免了採用沉澱法除蛋白帶來的損失，前處理步驟簡單、快速，選用固相萃取技術對樣品進行濃縮和淨化，所用有機溶劑用量少，可有效防止樣品間的交叉汙染，具有回收率高，精密度好等特點，可適用於雞飼料、動物組織的富含蛋白質的生物質樣品中四環素類抗生素的檢測，克服現了現有檢測四環素類抗生素方法回收率嚴重偏低，不能滿足分析要求的不足。
【專利說明】—種測定富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分析化學領域，具體為準確測定雞肉、豬肉及其飼料中四環素類抗生素殘留的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，四環素類抗生素作為一類廣譜抗生素，因其價格低、抗菌譜廣、飼料報酬高等優點而在養殖業上被廣泛地應用。其中土黴素、四環素、金黴素及強力黴素應用最多。四環素類抗生素進入機體後，一部分經過代謝反應生成無活性的產物，一部分則以原形及活性代謝物排到體外進入環境。人若長期攝入四環素殘留超標的食品或長期生活在含有這些殘留抗生素的環境中，會導致耐藥菌的滋生，危害人體健康。因此，食品及環境中四環素等典型獸藥殘留的準確測定受到越來越多的關注。
[0003]針對含有四環素類抗生素的實際樣品，人們提出了多種樣品前處理方法和檢測方法。馬麗麗等採用液相色譜串聯質譜測定了土壤中的土黴素、四環素、金黴素，其回收率在62.2%-85.4%之間(分析化學，2010,38(1):21-26);孫剛等也採用類似方法，測定了畜禽糞便中的土黴素、四環素、金黴素，三種抗生素的加標回收率介於51.3% -93.7%之間(環境化學，2010，29 (4):739-743)。由於生物樣品基質成分複雜，幹擾物質多，且通常四環素類抗生素在樣品中的殘留濃度很低，因此需採用適當的前處理方法來淨化樣品和消除幹擾。邱彬等採用PH3.5的Mcllvaine-Na2EDTA緩衝液，振蕩離心提取、C18固相萃取柱淨化除雜等前處理方法，再結合液質聯用技術測定了鰻魚中的土黴素、四環素、金黴素、強力黴素，其測定下限為10.0mg kg_H中國發明專利，CN102998159A);伍鈞等利用高效液相色譜測定了土壤中四環素類抗生素殘留量，試樣經PH4.0Mcllvaine-Na2EDTA緩衝液提取，後用HLB固相小柱淨化和富集，其加標回收率為81.7% (中國發明專利，CN102401818A)。
[0004]然而，對於富含蛋白質的動物組織及動物飼料樣品，由於四環素類抗生素與蛋白質之間存在明顯的相互作用，採用緩衝溶液直接提取的前處理方法，無法將樣品中與蛋白質強烈結合的四環素類抗生素提取完全，需要再利用三氯乙酸等有機酸沉澱去除蛋白質。儘管三氯乙酸能高效沉澱蛋白，但在沉澱過程中與蛋白質結合緊密的四環素類抗生素，會與蛋白質一同被沉澱，無法被提取，造成測定結果仍然偏低。例如，Fedeniuk等人採用高效液相色譜法測定不同樣品基質中土黴素含量時發現，對水樣中土黴素的回收率可高達90% ;而在豬肉組織中的土黴素時，回收率卻很低，不到70%。他們認為是豬肉組織中的蛋白質等成分影響了四環素的測定(J.Chromatogr.B, 1996,677,291-297)。Cherlet等人用三氯乙酸除蛋白、採用液質聯用技術測定豬組織中的四環素類抗生素時，發現這些抗生素的回收率都很低，均小於25%，其中強力黴素的回收率最低，只有7% (Anal.Chim.Acta,2003,492,199-213)。因此，針對富含蛋白質的動物組織及雞飼料樣品，必需開發一種有效去除蛋白質且能準確測定其中四環素類抗生素含量的新方法。

【發明內容】
[0005]本發明的任務是提供一種檢測富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法，即結合液相色譜技術，建立一種高效、準確的測定富含蛋白質樣品中四環素類抗生素的方法，使其具有簡便、快速、回收率高的除蛋白方法，以克服現有檢測四環素類抗生素方法回收率嚴重偏低，不能滿足分析要求的不足。
[0006]實現本發明的技術方案是:
[0007]本發明提供的檢測富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法，包括以下步驟:
[0008](I)繪製四環素類抗生素液相色譜串聯質譜法標準曲線，濃度範圍為
0.4mgL L1.5mg L 1 ；
[0009]1、一種測定富含蛋白質的樣品中四環素類抗生素的方法，包括以下步驟:
[0010](I)繪製相應的四環素類抗生素液相色譜串聯質譜法標準曲線。
[0011](2)取待測的含蛋白質的液體樣品或含水分的含蛋白質的固體樣品或乾燥的含蛋白質的固體樣品用1wery法測定樣品中蛋白質的含量。
[0012](3)酶解法除蛋白:稱取經步驟(2)測得蛋白質含量的待測的含蛋白質的樣品，按所稱取樣品中蛋白質摩爾量五十分之一的比例加入胰蛋白酶溶液，80W超聲8min或100W超聲酶解6min或120W超聲4min，得到酶解液；
[0013](4)四環素類抗生素提取:向步驟(3)得到的酶解液中加入提取劑，用以提取樣品中四環素類抗生素，再用鹽酸調pH為2至3，然後離心收集上清液，所述的提取劑是檸檬酸-乙二胺二鈉(Mcllvaine-Na2EDTA)緩衝液；
[0014](5)淨化上清液:將步驟⑷得到的上清液通過親水親油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分離，萃取富集收集洗脫液，過濾後得濾液；
[0015](6)利用高效液相色譜測定步驟(5)得到的濾液中的四環素抗生素濃度，將液相色譜儀中得到的峰面積代入步驟(I)所作標準曲線中，求得抗生素濃度。
[0016]上述方法中，所述的含蛋白質的液體樣品是蛋白質溶液或血漿；所述的含水分的含蛋白質的固體樣品是動物組織或內臟；如所述的固體樣品具體可以是雞飼料、雞肉及豬肉等樣品。將從養雞場或超市採集或購買的樣品，置於清潔的塑料樣品袋中，經凍幹後磨細，50目過篩。採用Lowery法測定其中蛋白質含量；所述的液體樣品可以是已知蛋白質濃度的蛋白質溶液。所述的乾燥的含蛋白質固體樣品是飼料。
[0017]所述的四環素類抗生素是土黴素、四環素、金黴素、強力黴素或去甲基金黴素。
[0018]步驟(2)中所述的用1wery法測定樣品中蛋白質含量的具體方法是:含蛋白質的液體樣品直接測定；含水分的含蛋白質的固體樣品冷凍乾燥後研磨過50目篩取篩下部分測定；乾燥的含蛋白質的固體樣品研磨過50目篩取篩下部分測定。
[0019]步驟(5)中所述的將步驟(4)得到的上清液通過親水親油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分離，萃取富集收集洗脫液，過濾後得濾液的具體方法是；將步驟(4)收集的上清液採用HLB固相萃取柱分離，先用甲醇和水活化小柱，上樣後用5mL5%甲醇水溶液淋洗，再用8mL30%甲醇-乙酸乙酯洗脫，萃取富集收集洗脫液在40°C下氮吹至近幹，用ImL甲醇復溶，之後溶液過0.22 μ m濾膜得濾液。
[0020]步驟(6)中所述的利用高效液相色譜測定步驟(5)得到的濾液中的四環素類抗生素濃度的具體方法是:流動相由甲醇、乙腈和0.1%甲酸組成，三者的體積比為1: 2: 7，柱溫為30°C，進樣量為20 μ L，紫外檢測器波長設定為355nm，質譜檢測器設置參數為毛細管電壓:2.5kV ;錐孔電壓:17V ;離子源溫度:120°C ;脫溶劑氣溫度:350°C ;脫溶劑氣流速:550L h'
[0021]上述方法中，所述的提取液為pH為4.0的檸檬酸-乙二胺四乙酸鈉(Mcllvaine-Na2EDTA)緩衝液，配製方法為:稱取13.8g磷酸氫二鈉溶液，6.45g檸檬酸，
4.65g乙二胺四乙酸二鈉用蒸懼水溶解並定容至250mL。
[0022]所述液質聯用方法的測定條件為:儀器:Waters2695配有Waters Acquity TQD質譜檢測器；色譜柱:Z0RBAX SB-C18 柱(4.6mmX 150mm，5 μ m)，柱溫:30°C，進樣量:20 μ L ;流動相:甲醇、乙腈和0.1 %甲酸水溶液，按10: 20: 70之比例均勻混合而成，流速為0.2ml HiirT1 ;毛細管電壓:2.5kV ;錐孔電壓:17V ;離子源溫度:120°C ;脫溶劑氣溫度:3500C ;脫溶劑氣流速:550L h-1。
[0023]本發明的優點:消除了生物基質樣品中蛋白質對測定四環素的幹擾，避免了採用沉澱法除蛋白帶來的損失；前處理步驟簡單、快速，選用固相萃取技術對樣品進行濃縮和淨化，所用有機溶劑用量少，防止了樣品間的交叉汙染。本發明方法的回收率高，精密度好，可適用於雞飼料、動物組織的富含蛋白質的生物質樣品中四環素類抗生素的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1牛血清蛋白 溶液中四環素類抗生素回收率，由圖可見，四種四環素類抗生素的回收率可達100%，說明本方法的準確性好；
[0025]圖2 土黴素、四環素、金黴素、強力黴素、去甲基金黴素總離子流圖及提取離子流圖，在該條件下，26min可完成樣品分析過程，且沒有其他雜質幹擾。
【具體實施方式】
[0026]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細闡述，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於下述實施例。
[0027]按照本發明的
【發明內容】
實施本發明，所需試劑溶液的配製方法如下:檸檬酸-乙二胺四乙酸鈉(Mcllvaine-Na2EDTA)緩衝液(ρΗ4.0):稱取13.8g磷酸氫二鈉溶液，6.45g檸檬酸，4.65g乙二胺四乙酸二鈉用蒸餾水溶解並定容至250mL ;四環素類抗生素標準儲備液(IOOmg L-1):分別稱取土黴素、四環素、金黴素、強力黴素、去甲基金黴素各10mg，用蒸餾水定容至IOOmL ;胰蛋白酶儲備液(300mg ?Λ?2.5μΜ):稱取30mg胰蛋白酶，用用蒸餾水定容至IOOmL ;牛血清白蛋白儲備液(100g L^a.SmM):稱取2.5g胰蛋白酶，用蒸餾水定容至 25mL。
[0028]實施例1溶液樣品中四環素類抗生素測定
[0029]以牛血清蛋白溶液為供試樣品，考察在不同濃度牛血清蛋白溶液中，四環素類抗生素加標回收率情況。
[0030](I)繪製標準曲線:線性範圍為0.5mg L_1-8mg L_S結果見表1。如表中所示,該法測定所得標曲線性良好，滿足定量分析標準。
[0031]表1四環素類抗生素高效液相色譜標準曲線
[0032]
【權利要求】
1.一種測定富含蛋白質的樣品中四環素類抗生素的方法，包括以下步驟: (1)繪製相應的四環素類抗生素液相色譜串聯質譜法標準曲線。 (2)取待測的含蛋白質的液體樣品或含水分的含蛋白質的固體樣品或乾燥的含蛋白質的固體樣品用1wery法測定樣品中蛋白質的含量。 (3)酶解法除蛋白:稱取經步驟(2)測得蛋白質含量的待測的含蛋白質的樣品，按所稱取樣品中蛋白質摩爾量五十分之一的比例加入胰蛋白酶溶液，80W超聲8min或IOOW超聲酶解6min或120W超聲4min，得到酶解液； (4)四環素類抗生素提取:向步驟(3)得到的酶解液中加入提取劑，用以提取樣品中四環素類抗生素，再用鹽酸調PH為2至3，然後離心收集上清液，所述的提取劑是檸檬酸-乙二胺二鈉(Mcllvaine-Na2EDTA)緩衝液； (5)淨化上清液:將步驟(4)得到的上清液通過親水親油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分離，萃取富集收集洗脫液，過濾後得濾液； (6)利用高效液相色譜測定步驟(5)得到的濾液中的四環素抗生素濃度:將液相色譜儀中得到的峰面積代入步驟(1)所作標準曲線中，求得抗生素濃度。
2.根據利要求I所述的方法，其特徵在於:所述的含蛋白質的液體樣品是蛋白質溶液或血漿；所述的含水分的含蛋白質的固體樣品是動物組織或內臟；所述的乾燥的含蛋白質固體樣品是飼料。
3.根據利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的用1wery法測定樣品中蛋白質含量的具體方法是:含蛋白質的液體樣品直接測定；含水分的含蛋白質的固體樣品冷凍乾燥後研磨過50目篩取篩下部分測定；乾燥的含蛋白質的固體樣品研磨過50目篩取篩下部分測定。
4.按權利要求1所述的的方法，其特徵在於，步驟(5)所述的將步驟(4)得到的上清液通過親水親油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分離，萃取富集收集洗脫液，過濾後得濾液的具體方法是；將步驟⑷收集的上清液採用HLB固相萃取柱分離，先用甲醇和水活化小柱，上樣後用5mL5%甲醇水溶液淋洗，再用8mL30%甲醇-乙酸乙酯洗脫，萃取富集收集洗脫液在40°C下氮吹至近幹，用ImL甲醇復溶，之後溶液過0.22 μ m濾膜得濾液。
5.按權利要求1所述的的方法，其特徵在於，步驟(6)所述的利用高效液相色譜測定步驟(5)得到的濾液中的四環素類抗生素濃度的具體方法是:流動相由甲醇、乙腈和0.1%甲酸組成，三者的體積比為1: 2: 7，柱溫為30°C，進樣量為20 μ L，紫外檢測器波長設定為355nm，質譜檢測器設置參數為毛細管電壓:2.5kV ;錐孔電壓:17V ;離子源溫度:120°C ；脫溶劑氣溫度:350°C ;脫溶劑氣流速:550L IT1。
6.按權利要求1所述的的方法，其特徵在於，所述的四環素類抗生素是土黴素、四環素、金黴素、強力黴素或去甲基金黴素。
7.按權利要求1所述的的方法，其特徵在於，所述的相應的四環素類抗生素液相色譜串聯質譜法標準曲線的濃度範圍為0.4mg L^1-L 5mg L'
【文檔編號】G01N30/02GK103543218SQ201310334436
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】朱麗華, 周茜, 王楠, 張英英, 唐和清 申請人:華中科技大學