降低細胞內蛋白質水平的方法

2023-12-02 04:17:46

專利名稱：降低細胞內蛋白質水平的方法
技術領域：
本發明涉及降低細胞內蛋白質水平的方法。本發明尤其涉及通過同時下調蛋白質的合成(例如，通過降低mRNA的水平或減少mRNA的翻譯)和增加蛋白質的降解來降低蛋白質水平的方法。
背景技術：
某些細胞內蛋白的不適當激活與多種人類疾病的發生有關，這些疾病包括癌症、心血管疾病、免疫疾病和神經系統疾病。R. J. Mayer, Protein Degradation:TheUbiquitin-Proteasome System and Disease, Volume 4, ffiley-VCH, 2007 例如，在很多癌症中，一種或多種癌基因的過表達在腫瘤的發生和發展過程中起到至關重要的作用。C. M. Croce, Oncogenes and Cancer. N. Engl. I. Med. 2008; 358:502-511。因此，使導致或促成疾病的靶蛋白有效下調的方法，將具有顯著的診斷和治療作用。另外，已使用了不同的工具用於降低靶蛋白的水平，以評估其生物學功能。RNA幹擾(RNAi)、基因敲除、核酶和反義寡核苷酸常用於不同的真核生物，以消除或降低細胞內蛋白質的水平。然而，在一些例子中，這些技術並不能有效地減少蛋白的表達。由於現有的基因產物僅以其自然的周轉速率清除，靶蛋白的立即清除時常無法實現。需要考慮的另一個因素是靶蛋白的穩定性，它表示蛋白清除的速率和效率。即使完全破壞初期產生的mRNA，殘留的長期存在的靶蛋白可能會混淆或掩蓋對蛋白質清除表型的評價。泛素依賴性蛋白水解是真核細胞用來降解細胞內蛋白質的一種主要的分解代謝途徑。有3類酶協同催化蛋白泛素化E1泛素活化酶、E2泛素偶合酶，以及E3泛素連接酶(見綜述 Hochstrasser (1996) Annu Rev. Genet30:40539)。El 和 E2 主要涉及泛素的活化和轉移，泛素途徑的底物特異性由E3泛素連接酶完成。最近，我們證實通過一種我們命名為"蛋白質敲除"(PKO)的技術，經改造的泛素連接酶可以被用來加速特定的細胞內蛋白質的水角軍° Zhou等 Harnessing the ubiquitination machinery to target the degradationof specific cellular proteins. Mol. Cell. 2000;6:751-6. Zhang 等 Exploring thefunctional complexity of cellular proteins by protein knockout. Proc Natl AcadSci USA 2003; 100:14127-32. Zhang 等 Ectopic targeting of substrates to theubiquitin pathway. Methods Enzymol 2005;399:823-33. Zhou P. Targeted proteindegradation. Curr Opin Chem Biol 2005;9:51-5.通過RNAi結合蛋白質敲除技術，申請人已進一步研究出迅速而有效地減少革巴蛋白數量的方法。RNAi通過特定mRNA的降解或者對其翻譯的抑制，在蛋白質的生物合成水平來控制蛋白質水平，而泛素連接酶介導的蛋白質敲除則在翻譯後的水平加速目標蛋白的降解。這種組合方法一般適用於任何靶蛋白，包括不能被RNAi充分清除的蛋白質和具有相對長半衰期的蛋白質。發明概述本發明旨在提供一種降低細胞內至少一種靶蛋白水平的方法，所述方法包括使所述細胞接觸第一試劑和第二試劑的步驟，其中所述第一試劑減少靶蛋白的合成，所述第二試劑增加靶蛋白的降解。第一試劑可以在第二試劑之前、之後或同時接觸細胞。第一試劑和第二試劑可以在分開的遞送載體中或在同一遞送載體中。
第一試劑可以降低靶蛋白mRNA的水平或者減少靶蛋白mRNA的翻譯。第一試劑可以是RNAi分子，例如小幹擾RNA (siRNA)，小髮夾RNA (shRNA),以及小分子核糖核酸(HiiRNA)0第一試劑也可以是雙鏈RNA (dsRNA)，反義寡核苷酸或者核酶。第二試劑可以是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。泛素連接酶多肽可以是E3泛素連接酶多肽，例如SCF多肽、HECT多肽和UBRl多肽。SCF 多肽包括，但是不限於，F-box 多肽，例如 Cdc4/FBW7、H0S、^ TrCP、FWDl、Poplp、Pop2p、Grrlp 和 Met30p。HECT 多肽包括，但不限於，E6AP、Nedd4、RSP5、Smurfl, TOMl 和 EDD。革巴蛋白相互作用結構域的非限制性例子包括乳頭瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。本發明的方法和組合物可以用於靶向任何蛋白質，包括細胞質蛋白、核內蛋白或者膜蛋白。例如,革巴蛋白可以是Rb、pl07、I K B、Siclp、Cln2p、E2、c-myc和P -連環蛋白(運-catenin)。祀蛋白可以在任何類型細胞裡,包括哺乳動物細胞,例如人類細胞或者小鼠細胞。本發明可以用於在對象中治療或預防疾病(如，癌症或心血管疾病)。本發明也可以用於在對象中診斷疾病或狀態。此外本發明還涉及一種表達載體，包括編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。第一試劑減少靶蛋白的合成；第二試劑增加靶蛋白的降解。本發明進一步提供一種細胞，其包括一種表達載體，其中所述表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。所述細胞可以是任何類型細胞，其包括哺乳動物細胞，如人類細胞或者小鼠細胞。本發明提供包含第一表達載體和第二表達載體的細胞，其中第一表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列，第二表達載體包括編碼第二試劑的第二核酸序列。本發明涉及一種包含表達載體的製品，其中所述表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。在另一個實施方式中，本發明提供包括第一表達載體和第二表達載體的製品，其中第一表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列，第二表達載體包含編碼第二試劑的第二核酸序列。在另一個實施方式中，本發明提供包括第一試劑和第二試劑的製品。附圖
的簡要說明圖I描述了 RNAi結合蛋白質敲除(PKO)能實現更有效和更快速地降低靶蛋白水平。RNAi減少初期靶蛋白的合成，而蛋白質敲除則加速靶蛋白的降解。圖2A和2B顯示RNAi結合蛋白質敲除時，比任一種方法單獨使用時，更有效地降低人骨肉瘤SA0S-2細胞內異位表達的Rb水平。圖2A顯示雜交E3連接酶P -TrCP-E7N,其包含融合至E7N肽的P -TrCP F-box基序。P -TrCP F-box基序有助於與SCF核E3泛素連接酶複合物的相互作用，以及E7N肽與Rb (以及口袋蛋白pl07和pl30)的結合。在圖2B中，用編碼抗-RBlshRNA、^ _TrCP_E7N的構建體或同時編碼抗-RBlshRNA和@-TrCP-E7N的構建體轉染SA0S-2細胞。所有樣品轉染24小時後經嘌呤黴素選擇，利用特異性抗體進行免疫印跡檢測分析。圖3A顯示RNAi結合蛋白質敲除在降低細胞內Rb水平方面的功能分析。E2F1連同其輔因子DP-I —同結合DHFR啟動子。Rb能夠抑制E2F1的轉錄活性。為研究降低Rb水平的效果，使用由E2F1敏感性DHFR啟動子(DHFR-Luc)驅動的螢光素酶報告基因構建體。圖3B顯示RNAi結合蛋白質敲除在降低細胞內Rb水平方面的雙螢光素酶檢測結果。用構建體與DHFR-Luc報告基因一同瞬時轉染SA0S-2細胞，所述構建體編碼shRb(SP， 針對Rb的shRNA)和/或P -TrCP-E7N。Firefly/Renilla (F/R)螢光素酶信號比率檢測重複三次。測量結果利用對照進行歸一化，圖表表示F/R比率的平均(三次實驗)倍數差異。*表示P-值〈O. 05。圖4顯示利用RNAi結合蛋白質敲除清除內源性pl07蛋白的動力學速率。利用抗-RBLl的siRNA寡核苷酸轉染C33A細胞，然後用攜帶Adl-P-TrCP-E7N構建體的腺病毒感染該細胞。「。」表示非特異性物種。在柱狀圖中，P107平均表達水平來自於三次獨立實驗，並用模擬轉染和感染的C33A細胞中的pl07水平進行歸一化。與任一單獨的方法相比，在所有時間點使用siRNA和Adl-P -TrCP-E7N處理細胞都顯示出更好的pl07敲除效果。發明詳述本發明利用翻譯前和翻譯後的兩種方法下調靶蛋白的水平。即分別通過減少蛋白合成和提高蛋白降解，從而有效而快速地降低靶蛋白的水平。本發明能用於不同程度地減少靶蛋白的數量，並將細胞內的靶蛋白清除。本發明的方法和組合物能用於靶向基本上任何蛋白質。重要的是，第一試劑和第二試劑的聯合使用能有效地產生協同效果，其比基於兩種單個試劑的預計的疊加效果更好。本發明提供了一種降低細胞內至少一種靶蛋白水平的方法。該方法包括使第一試劑和第二試劑與細胞接觸的步驟所述第一試劑減少靶蛋白的合成；而第二試劑降低靶蛋白的水平。例如，所述第一試劑能夠降低靶蛋白的mRNA水平(例如，通過誘導mRNA的降解，或者通過下調靶蛋白編碼基因的轉錄以降低靶蛋白mRNA水平)。第一試劑也可以降低或者抑制mRNA的翻譯。第二試劑可以加速靶蛋白的降解。第一試劑可以在第二試劑之前、之後或同時與細胞接觸。第一試劑和第二試劑可以在分開的遞送載體中，也可以存在於同一遞送載體中。第一試劑可以是RNAi (RNA幹擾)分子，例如小幹擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA(shRNA)或者小分子核糖核酸(miRNA)。所述第一試劑可以是雙鏈RNA (dsRNA)、反義寡核苷酸、核酶或者三螺旋DNA。第二試劑可以是包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域的嵌合多肽。所述包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域的嵌合多肽在本文中也被稱為經改造的泛素連接酶。所述泛素連接酶多肽可以是E3泛素連接酶，其包括但不限於，SCF多肽、HECT多肽和UBRl多肽。在一個實施方式中，SCF多肽是F-box多肽，其包括但不限於，哺乳動物細胞中已知的包含F-box底物識別亞單位的蛋白家族中的任何成員，例如低等真核生物中 Cdc4/FBW7、HOS、pTrCP 和 FWDl 或者 Pop Ip、Pop2p、Grrlp 和 Met30p 等(見綜述 Cardozo等 The SCF ubiquitin ligase: insights into a molecular machine. Nat Rev Mol CellBiol 2004 5(9) :739-51)。HECT 多肽包括，但不限於，E6AP、Nedd4、RSP5、Smurfl、TOMl 和EDD。泛素連接酶多肽可以與靶蛋白相互作用結構域共價或非共價連接。本文中使用第二試劑下調靶蛋白水平的技術被稱為「蛋白質敲除」(「PK0」)。本發明還包括表達載體，所述表達載體含有編碼上述第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。或者，本發明提供第一表達載體和第二表達載體，其中第一表達載體含有編碼第一試劑的第一核酸序列，第二表達載體含有編碼第二試劑的第二核酸序列。載體可以是病毒載體或質粒，特別地，表達載體適於在包括哺乳動物細胞在內的真核細胞中表達。本發明可以用於不同程度地降低細胞內靶蛋白的數量，同樣也可用於清除細胞內靶蛋白。本發明可以降低靶蛋白水平超過約10%、超過約20%、超過約30%、超過約40%、超過約50%、超過約60%、超過約70%、超過約80%、超過約90%或約100%。本發明可以用於靶向任意蛋白或多肽，這些蛋白或多肽的編碼基因已被克隆(或 部分克隆)，或者本領域技術人員已知或能闡明與這些蛋白或多肽相互作用的多肽(或結構域)。本文中使用的術語「蛋白水平」，「蛋白數量」，「蛋白的數量」和「蛋白的水平」可以互換使用。RNAi通過降解靶蛋白的mRNA或減少mRNA的翻譯，在生物合成水平起作用。然而，靶蛋白通常被內源蛋白清除機制以常規的速度被移除。蛋白質敲除系統則通過泛素蛋白酶通路促進靶蛋白的降解，在翻譯後水平起作用，但對於初期蛋白合成影響極小。在某些實施方式中，本發明同時使用RNAi和蛋白質敲除來降低細胞內目標蛋白的水平。這兩種技術的聯合應用比任何一種方法單獨使用時，能更加有效和迅速的清除靶蛋白。更重要的是，RNAi和蛋白質敲除的聯合應用產生的協同效果比基於兩種技術單獨應用時預計的疊加效果更好。第一試劑翻譯前調控第一試劑降低靶蛋白的mRNA水平或者減少mRNA的翻譯。所述第一試劑可以是RNA、DNA或者核酸類似物，包括化學修飾的核苷酸(例如，糖或者骨架修飾核苷酸)和非核苷酸。其它核酸類似物，例如肽核酸(PNA)或者鎖核酸(LNA)，也是合適的。美國專利號7，838，664。化學修飾可以通過在體內增加抗核酸酶降解的能力和/或通過改善細胞攝取，來改進天然核酸分子的多種屬性。而且，某些化學修飾能通過靶向特定細胞或者組織和/或改進核酸分子的細胞攝取，來改善核酸分子的生物利用度。美國專利號7，858，771。第一試劑可以是單鏈或者雙鏈形式。雙鏈核酸分子可以有兩個平端、一個懸突端一個平端，或者3』和5'都為懸突端。雙鏈核酸可以包括錯配、突出端、環或者擺動鹼基對。第一試劑可以是RNAi分子，例如小幹擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)或者小分子核糖核酸(miRNA)。第一試劑可以是雙鏈RNA (dsRNA)、反義寡核苷酸、核酶或者三螺旋 DNA。本發明的第一試劑可以包含一種或者一種以上核酸分子，所述核酸分子具有靶向蛋白的特異性。例如，僅一種siRNA可以用來下調靶蛋白的水平；兩種siRNA(例如，具有不同的序列)可以聯合用於調節靶蛋白的表達水平；反義寡核苷酸可以與siRNA聯合降低靶蛋白水平。本發明的第一試劑在不同水平下調靶蛋白，例如轉錄後水平，轉錄前水平，或者表觀遺傳水平。在非限制的例子中，通過本發明RNAi分子進行的基因表達的表觀遺傳調節，可源自RNAi介導的染色質結構的修飾，從而改變基因表達。(參見，例如，Verdel等，2004，Science, 303，672-676;Pal-Bhadra 等，2004，Science, 303，669-672;Allshire,2002，Science, 297, 1818-1819;Volpe 等,2002, Science, 297, 1833-1837;Jenuwein, 2002, Science, 297，2215-2218;以及 Hall 等，2002，Science, 297，2232-2237)。本發明的第一試劑可以被設計成靶向靶蛋白的DNA或多種RNA分子。這樣的RNA的非限制性的例子包括，信使RNA (mRNA)、靶基因的可變RNA剪接變體、轉錄後修飾的靶基因的RNA、靶基因的mRNA前體，和/或RNA模板。如果可變剪接產生一個轉錄子家族，其區別在於使用適當的外顯子，那麼本發明可以通過所述適當的外顯子來抑制或降低基因表達，從而特異性抑制或區別基因家族成員的功能。在另一個實施方式中，第一試劑用於靶向一個或多個基因家族中的保守序列。
RNAi介導的基因沉默是基因特異性的。RNAi是一個兩步的過程。首先，dsRNA在細胞中被剪切成具有5』磷酸末端和3』短懸突端的siRNA。然後，產生的siRNA特異性地靶向相應的mRNA 以進行破壞。Zamore P. D. Nature Structural Biology, 2001, 8 (9) 746-750。使用化學合成的siRNA雙鏈體也可以有效誘導RNAi。Zamore等，Ce 11 101, 25-33，(2000)。合成的siRNA雙鏈體已顯示出能特異性抑制較廣範圍的哺乳動物細胞系中內源和外源基因的表達。Elbashir 等 Nature, 411, 494-498，(2001). Fire (1999) Trends Genet. 15:358-363.Sharp(2001)Genes Dev. 15:485-490. Hammond 等(2001)Nature Rev. Genes 2:1110-1119.Tuschl (2001)Chem. Biochem. 2:239-245。本發明的RNAi分子可以是雙鏈或單鏈。當RNAi分子是雙鏈時，其中一條鏈是正義鏈，另一條鏈是反義鏈；其中反義鏈包含的核苷酸序列互補於靶蛋白或其部分的核苷酸序列，並且正義鏈包含的核苷酸序列對應於靶蛋白或其部分的核苷酸序列。或者，RNAi分子可以由單個的寡核苷酸組裝而成，其中RNAi分子中的自身互補的正義區和反義區可以通過核酸鹼基接頭或非核酸鹼基接頭連接。RNAi分子可以是具有雙鏈、非對稱雙鏈、髮夾或非對稱髮夾二級結構的多核苷酸。RNAi分子可以是環型單鏈多核苷酸，其具有兩個或更多的環狀結構，以及包含自身互補的正義區和反義區的莖狀結構。環型多核苷酸能夠在體內或體外被加工成活化的RNAi分子。小幹擾RNA(SiRNA)是雙鏈RNA分子，其能抑制或者降低其同源基因的表達。siRNA的每條鏈的長度可以是大約10個到大約50個核苷酸、大約12個到大約45個核苷酸、大約15個到大約40個核苷酸、大約20個到大約35個核苷酸、大約20個到大約30個核苷酸，或者大約20個到大約25個核苷酸。雙鏈的siRNA可以有大約10到大約50個鹼基對、大約12到大約45個鹼基對、大約15到大約40個鹼基對、大約20到大約35個鹼基對、大約20到大約30個鹼基對，或者大約20到大約25個鹼基對。已有多種方法用於將siRNA遞送至細胞。這些方法包括將合成的siRNA分子遞送進細胞和基於載體的方法遞送，其中基於載體的方法是利用載體在靶細胞中轉錄產生siRNA。某些基於載體的siRNA遞送系統可以穩定和有效地抑制基因表達。在很多基於載體的方法中，通過生產小髮夾RNA或者短髮夾RNA (shRNA)而產生siRNA。shRNA是包含莖和髮夾結構的單鏈RNA分子。在此系統中，RNA聚合酶III啟動子，如Hl啟動子和U6啟動子，用於啟動shRNA的轉錄。在細胞中，通過Dicer酶家族的作用將shRNA加工成siRNA。因此，轉錄產物與合成的siRNA雙鏈體相似，也可有效地抑制其相應基因的表達。U.S.專利號 7，772，203。McIntyre G, Fanning G (2006) "Design and cloning strategies forconstructing shRNA expression vectors'BMC Biotechnol. 6:1. Paddison P，CaudyA, Bernstein E, Hannon G, Conklin D(2002) 〃Short hairpin RNAs(shRNAs)inducesequence-specific silencing in mammalian c ells〃.Genes Dev. 16(8):948 - 58。shRNA的長度可以是大約30到大約80 (例如，大約35、40、45、50或55)個核苷酸、大約35到大約70個核苷酸、大約35到大約65個核苷酸、大約35到大約60個核苷酸、大約35到大約55個核苷酸、大約35到大約50個核苷酸，或者大約38到大約44 (例如，38、39、40、41、42、43或者44)個核苷酸。ShRNA的雙鏈區可以有大約10到35個鹼基對、大約12到30個鹼基對、大約14到25個鹼基對，或者大約16到大約22(例如，大約16、17、18、19、20、21或者22)個鹼基對。第一試劑也可以是小分子核糖核酸(miRNA)分子、其類似物、miRNA前體，例如pre-mi RNA和初級miRNA(pri-miRNA)。第一試劑可以是編碼miRNA或者miRNA前體的DNA分子。Bartel, DP (2009) 〃MicroRNAs:target recognition and regulatory functions^Cell2004, 136 (2) :215 - 33. Bartel DP^MicroRNAs : genomics biogenesis, mechanism, andfunction". Cell. 116(2) :281 - 97。miRNA通常是單鏈分子，而miRNA的前體通常是至少部分自身互補的分子，其能形成雙鏈部分，例如莖狀和環狀結構。本發明也涉及編碼上述miRNA分子或miRNA前體分子的表達載體。所述載體可以是DNA載體，例如病毒載體或者質粒，特別是適於在真核細胞，尤其是哺乳動物細胞中表達核酸的載體。包含於上述載體中的重組核酸可以是導致miRNA分子，miRNA分子前體或初始轉錄物轉錄的序列，所述miRNA分子初始轉錄物可以進一步被加工為miRNA分子。反義寡核苷酸包括DNA、RNA,或其衍生物、類似物、片段、雜合體、模擬物(mimetic)和同源物(congener)。反義寡核苷酸可以通過結合特定的信使RNA從而抑制所述信使RNA蛋白質的翻譯。反義寡核苷酸的長度的範圍可以為從大約5到大約10個、大約10到大約20個、大約10到大約40個、大約15到大約25個、大約20到大約50個、大約50到大約75個，或者大約75到大約100個核苷酸。靶序列可以是RNA或者DNA，並且可以是單鏈或者雙鏈。靶分子包括，但不限於，mRNA前體、mRNA和DNA。核酶是能催化RNA特異剪切的具有酶活性的RNA分子。(綜述，參見Rossi, J. , 1994，Current BioloRY 4:469-471。)核酶的作用機制涉及核酶分子對與其互補的靶RNA的特異雜交，隨後對其實施核酸內切酶作用。核酶分子的組合物必須含有一個或多個與靶mRNA互補的序列，並且可以包括負責對mRNA進行剪切的已知催化序列。美國專利號5，093，246。本發明範圍還包括經改造的錘頭基序核酶分子，其能夠特異且有效地催化編碼靶蛋白的RNA序列發生核酸內切作用。美國專利號7，855，152。第一試劑可以是任何能降低靶蛋白mRNA水平或者減少所述mRNA翻譯的有機小分子。「有機小分子」指的是天然的或人工合成的有機分子，其分子量範圍為從大約50道爾頓到大約5000道爾頓、從大約100道爾頓到大約4000道爾頓、從大約150道爾頓到大約3000道爾頓、從大約200道爾頓到大約2500道爾頓、從大約100道爾頓到大約2000道爾頓、從大約200道爾頓到大約1000道爾頓，或者從大約100道爾頓到大約500道爾頓的範圍內。第二試劑翻譯後調控 本發明的第二試劑通過招募靶蛋白至泛素連接酶，來誘導或促進靶蛋白的降解。第二試劑允許靶蛋白被招募到E3泛素連接酶，所述E3泛素連接酶為，例如，SCF泛素連接酶、HECT泛素連接酶或者UBRl泛素連接酶。靶蛋白可以是上述泛素連接酶的天然底物，或者通常情況下不是通過泛素偶聯或者不是通過本發明的具體的E3型泛素蛋白連接酶進行靶向降解。美國專利號7，223，556提供了通過順式或反式連接於泛素蛋白連接酶，從而靶向水解多肽的方法。靶蛋白可以被招募到E3泛素連接酶複合物，所述招募可以通過將靶蛋白共價連接至E3泛素連接酶複合物的一部分(順式靶向)或通過將靶蛋白非共價連接到所述複合物一部分(反式靶向)。因此本發明提供任何細胞內蛋白質的可控降解，這些蛋白質的編碼基因已經被克隆，或與所述蛋白質相互作用的多肽是本領域技術人員已知或容易獲得的多肽。第二試劑可以是嵌合多肽(本文也稱為「經改造的泛素連接酶」)，其包含兩個功能亞單位。第一個功能亞單位稱為「泛素連接酶多肽」，其允許嵌合多肽靶向至泛素依賴性的蛋白水解途徑。第二個功能亞單位稱為「靶蛋白相互作用結構域」，其能結合靶蛋白。靶蛋白相互作用結構域招募靶蛋白，使之通過泛素依賴性蛋白水解途徑被降解。功能性亞單位可以是來自自然產生的多肽，或者是其非天然產生的同系物。本發明的一個方面提供了蛋白的順式靶向。在本發明的該方面，靶蛋白可以連接到SCF (Skp 1/Cull 1/F-box蛋白)的組分，該組分為SCF招募結構域。SCF招募結構域可以是F-box蛋白，並且使革巴蛋白形成F-box融合蛋白。在某些實施方式中，F-box多肽-革巴蛋白的融合蛋白包括WD-40多肽區域，例如其可由Cdc4p的WD重複序列提供，或來源於包含WD重複序列的蛋白大家族。(參見例如van der Voorn and Ploegh (1992) FEBS Lett307:1314)。第二試劑的泛素連接酶多肽在SCF (Skpl,包含cullin和F-box的蛋白)泛素連接酶複合物的亞單位中，Skpl和cullin形成穩定的核心複合物，其可以為不同的包含F-box的蛋白所共有。SCF複合物通過cullin亞單位與E2相互作用。多種F-box蛋白可用於將多種不同的革巴蛋白招募到核心SCF複合物來進行泛素化。不同的F-box蛋白可以具有相同的F-box結構域，用於結合Skpl，但為了結合不同類型的底物，其可利用其它模塊的蛋白-蛋白相互作用結構域，例如,WD40 或富含亮氨酸的重複序列(LRR)。Kamura 等(1999) Science 284:657-61; Skowyra(1999)Science 284:662-5;Ohta 等(1999)1^1 Cell 3:535-41;Tan 等(1999)Mol Cell3:527-33。HECT結構域泛素連接酶包括哺乳動物E6AP和Nedd4，以及酵母RSP5 (Huibegtse等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92:25637;Wang 等(1999)Mol Cell Biol 19:34252)，還有近來發現的ffiCT結構域泛素連接酶，例如哺乳動物Smurfl (Zhu,等(1999)Nature400:68793)，酵母 TOMl (saleh 等(1998) I Mol Biol 282:93346;Utsugi 等(1999)Gene234:28595)，以及人 EDD(Callaghan 等(1999)Oncogene 17:347991)。UBRl N末端規則泛素連接酶參與多肽的降解，所述多肽具有特殊的N末端胺基酸殘基。UBRl泛素連接酶結合至不穩定的祀蛋白N端殘基,並促進被結合的祀標的泛素化。(Kwon 等(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:7893 903;Varshavsky (1996)Proc NatlAcad Sci USA 93:121429)。在一個實施方式中，第二試劑的第一功能單位，即，泛素連接酶多肽，源自E3連接酶的多肽組分，所述E3連接酶作用於將被降解的靶蛋白。也即是，泛素連接酶多肽是E3泛素連接酶複合物的底物識別組分的結構域，該結構域足以將底物識別組分招募至E3泛素連接酶複合物。泛素連接酶多肽的非限制性例子包括0如4八^17、1103、01'1^ 、 101、？叩1 、Pop2p、Grrlp、Met30p及其同系物和片段。泛素連接酶多肽可以包含F-box或其片段，其足以與至少一種其它E3泛素連接酶組分相互作用。在一個示例性實施例中，泛素連接酶多肽至少包括來自人蛋白P-TrCP的F-box,或其同系物或部分。Margottin等(1998)Mol. Cell 1:565。泛素連接酶多肽也可以源自下述包含 F-box 的蛋白Cdc4p、Grrlp、Met30p、Cyclin F、 Skp2p、Popl、C02F5. 7、F48E8. 7、MD6、YJL149w、N0376、9934. 4,8039. 5、NI 161、SconB、Scon-2, fim、UFO、C02F5. 7、C14B1. 3、C17C3. 6、C26E6. 5、F43C9/1、F48E8. 7、K10B2. I、T01E8. 4、ZK328. 7、Ro3D7、MD6、pllOSIII 和 E3012. 9K(參見例如 Margottin 等，(1998)Mol. Cell 1:565;Bai ^ (1996)Cell86:263; Kominami 等(1997)，Genes Dev. 11:1548; Li 等(1997) EMBO T. 16:5629 )。本發明中還可以使用其他F-box蛋白的部分,這包括如上文所列的Bai等所描述的任何含有F_box的蛋白，或尚未被分離的含有F-box的蛋白。這樣的蛋白可以利用本領域公知的方法，基於F-box間的序列同源性進行分離。F-box序列間的比對提示了其保守殘基的位置(參見例如Bai等,見上文)。泛素連接酶多肽可以包含來自E3底物結合組分的一個或一個以上WD重複序列，或者其中的至少一部分，該部分足以與至少一種其它E3組分相互作用。可以依據Skowyra等(1997)￡^11 91:209中描述的方法，確定必須包括在本發明的雜交蛋白質中的WD重複序列的數量，以及必須包含該重複序列的哪一部分。WD重複序列可以來自P-TrCP、釀酒酵母Met30p、粗糖脈抱菌 Scon2p 和非洲爪蟾蛋白(Xenopus Ievi proteins)。Margollis 等，如上文所述。在某些實施方式中，泛素連接酶多肽包括F-box和至少一個WD重複序列或其部分，使得足以用於招募至E3泛素連接酶複合物。可以通過本領域已知的多種方法而無需額外的試驗，即可在E3泛素連接酶複合物的底物識別組分中，確認對於招募至E3泛素連接酶複合物是充分且必要的部分。美國專利號 7，223，556。已知的底物識別亞單位的同源物可以利用本領域已知的方法確認。例如，同源物可以在中嚴格度或高嚴格度下通過雜交被克隆。同源物也可以通過PCR克隆獲得，所述PCR利用引物在低溫退火下，允許引物與允許配錯的核酸雜交。
_5] 第二試劑的靶蛋白相互作用結構域本發明嵌合多肽的第二功能亞單位是靶蛋白相互作用結構域。「靶蛋白相互作用結構域」是指能夠結合靶蛋白的多肽或肽模擬物。嵌合多肽的第二功能亞單位是允許將靶蛋白招募至細胞中的E3複合物的結構域，然後通過泛素蛋白水解途徑降解靶蛋白。靶蛋白相互作用結構域可以是，例如，已知與靶蛋白相互作用的多肽的部分，或通過與靶蛋白相互作用而被識別出的天然多肽或合成多肽。
可以通過篩選天然存在的多肽序列文庫，例如通過酵母雙雜交或「相互捕獲」的方法，可以容易地獲得靶蛋白相互作用結構域(Fields and Song(1989)Nature340:2456:Gvuris等(1993)￡^11 75:791 803)。酵母雙雜交系統可以用於篩選哺乳動物(例如,人)cDNA表達文庫，其中cDNA融合至GAL4的DNA結合結構域或激活結構域，而編碼目的多肽(例如靶多肽)的核酸則融合至GAL4的激活結構域或DNA結合結構域。這樣的酵母雙雜交系統可以篩選cDNA，所述cDNA編碼能夠結合目的多肽的蛋白。例如，cDNA文庫可以產生自mRNA，所述mRNA來自表達靶蛋白的細胞系。在酵母雙雜交表達系統中克隆的這樣的 cDNA 文庫(Chien 等(1991)Proc. Natl Acad. Sci. (U. S. A)88:9578orCell 72:233)可以用於鑑別編碼蛋白的cDNA，所述蛋白與靶多肽相互作用，然後產生GAL4依賴性的報告基因表達。或者，合成的相互作用結構域可以通過多種肽展示選擇方法獲得，如現有技術中已知的噬菌體展示技術。其它技術包括哺乳動物雙雜交技術、Far印跡、蛋白誘捕加核酸「捕獲」(「snag」)方法、基於表面等離子體共振的生物分子相互作用分析方法和多肽矩陣展示技術。美國專利號7，223，556。與靶蛋白相互作用的多肽也可以通過靶蛋白與抗體的免疫共沉澱和共沉澱物種鑑定來鑑別。進一步的，通過在體內用雙功能交聯試劑進行交聯，並隨後分離包含靶蛋白的·交聯產物，可以識別結合靶蛋白的多肽。靶蛋白相互作用結構域也可以是抗靶蛋白的抗體或所述抗體的片段。抗體可以是完整的抗體，或抗體的片段(如，Fab，納米抗體)。抗體或其片段可以包含一個或多個多肽。抗體類型可以是IgA，、IgG、IgE、IgD或IgM (及其亞型)，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是K或X型。抗體的互補決定區(CDR)可以是人源或非人源的。抗體的框架可以是人的，人源化的或非人的，例如經修飾以降低人體內免疫原性的鼠框架，或合成的框架，例如保守序列。靶蛋白相互作用結構域包括，但不限於，乳頭瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。第一試劑和第二試劑的遞送本發明的第一試劑可以以DNA或RNA分子的形式導入細胞，所述DNA或RNA分子能夠減少靶蛋白mRNA的翻譯或降低靶蛋白mRNA的水平。第一試劑也可以被導入細胞的DNA或RNA表達載體所表達。本發明第二試劑可以以蛋白或多肽的形式直接導入細胞。第二試劑也可以以編碼第二試劑的核酸的形式導入細胞。例如，第二試劑可以被導入到細胞中的DNA或RNA表達載體表達。為了將第一試劑和第二試劑導入細胞，這兩個試劑可以同時遞送，例如兩個試劑在同一遞送載體中。本發明的一個實施方式提供了表達載體，其包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。例如，單個表達載體用於將蛋白質敲除試劑的編碼序列(如，在Pol II啟動子控制下的經改造泛素連接酶表達盒)和shRNA編碼序列(由Pol III啟動子控制)同時導入細胞中以表達所述兩種試劑。或者，兩種試劑也可以分開遞送，例如用兩個分開的遞送載體。例如，可以將RNAi和蛋白質敲除試劑導入相同的靶細胞，可以在兩個獨立的表達載體中分別單獨導入，或在相同的表達載體中同時導入。第一試劑可以以shRNA的形式導入細胞，而第二試劑可以以多肽的形式導入所述相同細胞。第一試劑可以在第二試劑之前、之後或同時與所述細胞接觸。在一個實施方式中，RNAi試劑和蛋白質敲除試劑被分別單獨地導入細胞。被遞送的RNAi試劑可以是合成的siRNA或者是載體中由Pol III啟動子(U6或Hl啟動子)啟動表達得到的shRNA。可以用可購得的標準轉染試劑，將合成的siRNA轉染到靶細胞中，所述標準轉染試劑包括Lipofectamine RNAiMAXCInvitrogen)或DharmaFECT(Thermo ScientificDharmacon)。shRNA可以用標準質粒載體(例如，pSUPER)或病毒載體(例如，腺病毒、逆轉錄病毒或慢病毒載體)遞送。蛋白質敲除試劑可以以表達質粒的形式轉染到細胞中，或由病毒(例如，腺病毒、逆轉錄病毒或慢病毒)載體通過感染的方式引入細胞。另外，蛋白質敲除試劑也可以以蛋白的形式導入細胞。在這種情況下，蛋白質敲除試劑(例如，包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域的嵌合多肽)可以從細菌或昆蟲(例如，杆狀病毒)系統中以蛋白質的形式表達和純化。為了遞送到細胞，第二試劑可以融合至膜轉導肽，例如，衍生自HIV1TAT或脊椎動物轉錄因子的同源結構域。純化的蛋白形式的第二試劑也能夠利用多種遞送試劑直接遞 送至祀細胞中，所述遞送試劑包括但不限於，PR0FECT蛋白遞送試劑(Targeting Systems)或 Proteojuice 蛋白轉染試劑(Novagen)。在一個實施方式中，第一試劑，如siRNA或shRNA載體，轉染到細胞中後，再用編碼第二試劑(例如，含有泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域的嵌合多肽)的病毒載體轉染所述相同的細胞，或直接遞送純化的第二試劑蛋白。表達載體可以是DNA質粒或病毒載體。載體可以是真核表達載體。載體可以包含啟動子、增強子或其它調控元件。啟動子可以有或沒有細胞類型特異性。啟動子可以是組成型或可誘導型的。可誘導型啟動子可用於靶蛋白以可控的方式降解的實施方式中。病毒載體的構建可以基於，但不限於，腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、慢病毒或甲病毒。適宜的表達載體包括源自pBR322的質粒、源自pEMBL的質粒、源自pEX的質粒、源自pBTac的質粒和源自pUC的質粒，上述質粒用於在原核細胞如大腸桿菌中的表達。表達載體的非限制性例子為如 Paul 等，2002，Nature BiotechnoloRY, 19, 505;Miyagishiand Taira, 2002,Nature BiotechnoIory，19,497;Lee 等,2002,NatureBiotechnoloRY,19，500;以及 Novina 等，2002，Nature Medicine,advance onlinepublication doi : 10. 1038/nm725中所描述的。其它適於原核和真核細胞的表達系統參見Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. sup. nd Ed. , ed. by Sambrook, Fritsch andManiatis (冷泉港實驗室出版1989)第16章和第17章。第一試劑和/或第二試劑可以通過化學合成的方法獲得。第一試劑和第二試劑可以靶向相同的蛋白群或相同蛋白的不同亞群。例如，蛋白質敲除可以僅誘導翻譯後修飾蛋白的亞群的降解，或是定位於特定亞細胞結構中的靶蛋白亞群的降解，而RNAi —般抑制或減少靶蛋白mRNA的翻譯。蛋白質敲除也能夠降低具有多餘功能的整個靶蛋白家族的水平，不同真核物種間進化保守的蛋白的水平。本發明的另一實施方式提供了一種包含表達載體的細胞，所述表達載體具有編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。本發明還提供了一種細胞，其包含編碼第一試劑的第一表達載體和編碼第二試劑的第二表達載體。第一試劑和第二試劑可以在細胞中有條件地表達(例如，通過可誘導系統)或組成型表達。編碼第一試劑和/或第二試劑的核酸序列可以穩定或可以不穩定整合於細胞基因組。細胞可以是任何真核細胞，包括但不限於，哺乳動物細胞。細胞可以是人、小鼠、大鼠、犬、貓、牛、羊、豬、山羊、馬、靈長類動物或者酵母細胞。細胞可以是分化細胞或未分化細胞，例如，幹細胞，胚胎幹細胞，卵母細胞或胚細胞。本發明還提供了轉基因生物，其包括但不限於，轉基因植物和轉基因動物。轉基因生物可以包括表達載體，其具有編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。轉基因生物可以包含編碼第一試劑的第一表達載體和編碼第二試劑的第二表達載體。轉基因生物可以用於多種目的，例如，用於研究靶蛋白的功能，確定靶蛋白的缺失是否會導致特定的表型，例如特定疾病的發生。 本發明的組合物可以通過多種本領域技術人員已知的方法導入細胞，包括但不限於，包封於脂質體中、離子電滲法、和其它載體合併導入，其它載體例如生物可降解聚合物、水凝膠、環糊精(參見例如 Gonzalez 等,1999, Bioconjugate Chem. , 10, 1068-1074;W003/47518和WO 03/46185)、聚(乳酸-羥基乙酸)(PLGA)和PLCA微球(參見例如美國專利號6，447，796和美國專利公開號US 2002130430)、生物可降解納米膠囊，和生物粘附微球，或通過類蛋白質載體(W0 00/53722)。在另一個實施方式中，本發明的核酸分子也可以用聚乙烯亞胺及其衍生物製劑或複合，聚乙烯亞胺衍生物例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙醯氨基半乳糖(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙醯氨基半乳糖(PEI-PEG-triGAL)衍生物。或者，通過直接注射或使用輸液泵局部遞送核酸/載體的組合。本發明還提供了通過表面修飾的脂質體遞送所述組合物，所述表面修飾的脂質體包括聚(己二酸乙二醇)脂(PEG修飾或長循環脂質體或隱形脂質體)。Lasic等ChemRev. 1995. 95. 2601-2627;Ishiwata 等 Chem. Pharm.Bull. 1995. 43,1005-1011.Lasic等，Science 1995，267，1275-1276; Oku 等，1995，Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90)。在一個實施方式中，可以將核酸包封於表面帶正電荷的脂質體(例如，Iipofectins)中，並且(可選地)脂質體表面可以用針對靶組織細胞表面抗原的抗體標記(Mizuno 等，(1992)No Shinkei Geka 20:547551 ;W091/06309;日本專利申請 1047381;和歐洲專利公開號EP-A-43075)。例如，神經膠質瘤細胞可以用脂質體進行脂質轉染，所述脂質體用針對神經膠質瘤相關抗原的單克隆抗體標記(Mizuno等，(1992)Neurol. Med.Chir. 32:873876)。在另一個例證性的實施方式中，遞送系統包含一種抗體或與核酸結合試劑(如多聚賴氨酸)交聯的細胞表面配體(參見，例如W093/04701，W092/22635, W092/20316,W092/19749和W092/06180)。例如，任何核酸都可以用於在體內通過可溶性多核苷酸載體轉染特異性細胞，所述載體包含偶聯至多聚陽離子(如，多聚賴氨酸)的抗體(參見，美國專利號 5，166，320)。可以通過脂質體衍生系統、聚賴氨酸複合物、內化肽、人工病毒包膜、已知的穿膜蛋白載體，將第二試劑導入細胞。靶蛋白使用本發明的方法或者組合物可以靶向很多種蛋白質或者多肽。靶蛋白可以是膜蛋白、核內蛋白或者細胞質蛋白。靶蛋白可能參與增殖、免疫應答、炎性反應、歸巢、細胞毒性、血塊的凝固或者溶解、激素調節等。蛋白質可以是天然產生的蛋白，或者是天然蛋白的突變體。膜蛋白，包括受體(如生長因子受體、細胞因子受體、白細胞介素受體、G蛋白偶聯受體)、通道蛋白、載體蛋白、介導凋亡的蛋白(例如，Fas受體)、歸巢受體、血液相關蛋白等。細胞內蛋白包括代謝途徑相關蛋白、調節蛋白、激素受體、轉錄因子等，這取決於宿主細胞的性質。上述的一些蛋白也能作為細胞內蛋白。在一個實施方式中，靶蛋白參與細胞生長和/或分化和/或死亡的調節。例如，靶蛋白可以是癌蛋白，其存在導致細胞的無限增殖。因此，本發明為癌症和其它增殖紊亂疾病的治療提供了方法和組合物。在另一個實施方式中，靶蛋白是一種微生物，例如病毒、細菌和真菌。靶蛋白可以是胞內寄生物或者其它胞內病原體的蛋白質或者多肽。靶蛋白或者多肽可以是微生物生存 和/或繁殖所必需的蛋白或者多肽。因此，涉及這些多肽降解的方法能夠用於治療和/或預防微生物引起的感染。革巴蛋白非限制性的例子包括Rb、pl07、IK B、Siclp、Cln2p、E2、c-myc和3 _連環蛋白(P -catenin)。其它可選的靶蛋白參見PCT/US93/01617。引入本發明組合物的細胞可以是培養細胞，也可以是組織或者器官的一部分。所述細胞可以是未分化的細胞，例如胚細胞，或者是分化的或部分分化的細胞。所述細胞可以是體細胞或者生殖細胞。所述細胞可以是正常細胞或來自腫瘤，例如惡性或者良性腫瘤的細胞。所述細胞可以是血細胞，如淋巴細胞、粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、紅細胞。在其它實施方式中，所述細胞可以是肌細胞、腎細胞、肝細胞、上皮細胞、骨細胞(例如，成骨細胞或者骨細胞)、軟骨細胞、間質細胞、內皮細胞、腦細胞或者任意其它類型的細胞，只要細胞中包含泛素蛋白水解途徑的必要元件，或者可以經修飾後包含這些成分。靶細胞可以是存在於對象內或者對象外的任何類型的真核細胞。例如，細胞內將被降解的靶蛋白可以是在對象中，向對象給予第一試劑和第二試劑。或者，細胞可以來自對象。將第一試劑和第二試劑引入細胞，將細胞可選地給予同一個或其它對象。所述細胞可以是來自所有已經建立的細胞系中的細胞，其可以從例如美國模式培養物保藏中心(12301Parklawn Drive, Rockville, Md.)獲得。祀細胞可以是任何真核細胞,其包括但不限於哺乳動物細胞。所述細胞可以是人、小鼠、大鼠，犬、貓，牛、羊、豬、山羊、馬、靈長類或者酵母細胞。 本發明的方法和組合物也可以用於無細胞體系。藥物組合物第一試劑和第二試劑可以包含在藥物組合物中。第一試劑和第二試劑的表達載體，或者攜帶編碼第一試劑和第二試劑的核酸序列的細胞，可以包含在藥物組合物中。為了製備這樣的藥物組合物，可以採用常規的藥物製劑技術，將本發明的分子/化合物與藥學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑混合。在本發明的組合物中可以使用的藥學上可接受的載體包含所有標準藥用載體，如磷酸鹽緩衝鹽溶液、水、和乳劑例如油/水或者油/水乳劑，以及各種類型的溼潤劑。組合物中還可以包含固體藥用賦形劑例如澱粉、纖維素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、脫脂奶粉等。液體和半固體的賦形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括石油、動物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。液體載體，特別是注射用溶液，包括水、生理鹽水、液體葡萄糖和乙二醇。載體、穩定劑和佐劑的例子參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences, edited by E. ff. Martin (MackPublishing Company, 18th ed. , 1990)。組合物中也可以包括穩定劑和防腐劑。本發明的藥物組合物可以製成全身給藥、外用或局部給藥製劑。全身給藥包括肌內注射、靜脈注射、腹腔注射以及皮下注射。對於注射而言，本發明的藥物組合物可以製成液體溶液，例如在生理條件緩衝液如Hank’s溶液或者Ringer’s溶液中。此外，該藥物組合物可以製備成固體形式，在使用前進行再溶解或者重懸。也可以包括凍幹製劑。本發明的藥物組合物可以通過本領域任何一種已知的方法給藥，包括但不限於，鼻內、口服、眼用、腹腔內、吸入、靜脈、腦室內注射(ICV)、腦池內注射或輸注、皮下、植入、陰道、舌下、尿道(例如尿道栓劑)、皮下、肌內、靜脈、經皮、直腸、舌下、黏膜、眼、脊柱、鞘內、關節內、動脈內、蛛網膜下、支氣管和淋巴給藥。局部給藥製劑可以製成凝膠、油膏、乳膏、氣霧劑等；鼻內製劑可以通過噴霧或者滴劑方式遞送；經皮給藥製劑可以通過透皮貼劑或者離子電滲入療法給藥；吸入製劑可以通過噴霧器或者類似裝置給藥。組合物也可以採用片 劑、丸劑、膠囊、半固體製劑、粉劑、緩釋製劑、溶液劑，混懸液，酏劑、氣霧劑或者任何其它合適的形式給藥。試劑盒本發明還提供了一種包含表達載體的製品，所述表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列。第一試劑降低靶蛋白mRNA的水平，或者減少靶蛋白mRNA的翻譯；第二試劑降低靶蛋白的水平。本製品也包含說明表達載體用於減少細胞內靶蛋白水平的印刷品。在另一個實施方式中，本發明提供一種製品，其包含編碼第一試劑的第一表達載體和編碼第二試劑的第二表達載體。第一試劑降低靶蛋白mRNA的水平，或者減少靶蛋白mRNA的翻譯；第二試劑降低靶蛋白的水平。本製品也包含說明表達載體用於減少細胞內靶蛋白水平的印刷品。在又一個實施方式中，本發明提供一種製品，其包含第一試劑和第二試劑。第一試劑降低靶蛋白mRNA的水平，或者減少靶蛋白mRNA的翻譯；第二試劑降低靶蛋白的水平。本製品也包含說明第一試劑和第二試劑用於減少細胞內靶蛋白水平的印刷品。製品可以是試劑盒。該試劑盒用於下調靶蛋白在生物系統，包括例如，在細胞內、組織或生物體中的表達水平。本發明可以單獨使用或者作為試劑盒的一種組分來使用，該試劑盒至少包含一種必需的試劑，其能夠在體內或者體外將本發明的組合物引入待測樣品和/或對象。例如，試劑盒的成分可以包括本發明的表達載體，和能夠促進表達載體進入本文所述的目的細胞的載體(例如，使用脂質和其它的本領域的已知的其它轉染方法，參見，例如美國專利號6，395,713)。組合物可以儲存於包裝或者分裝器中。包裝可以例如包含金屬或者塑料片，如泡罩包裝。包裝或者分裝器可以配有使用或者給藥的說明書。試劑盒可以進一步包含其它核酸如特異性載體，其包含至少一個目的基因插入的克隆位點。本發明為多種治療、診斷、靶標確認、基因組發現、遺傳工程和藥物基因組學應用提供了有用的組合物和方法。例如，當特定蛋白的量異常而導致或引起對象出現疾病或狀況時，可以單獨使用本發明的方法和組合物，或者與一種或多種其它的治療性化合物聯用，用於治療或者預防該疾病或狀況。例如，本發明能夠提供用於治療癌症或者心血管疾病的有效組合物和方法。在另一個實施方式中，本發明特別提供了一種診斷對象疾病或者狀況的診斷方法，其包含向對象給予本發明的組合物，所述給予是在適宜診斷對象的疾病或者狀況的條件下。本發明的方法和組合物可以與一種或者多種已知的治療劑聯用，來治療疾病或者狀況。可與本發明的方法和組合物聯用的其它治療劑的非限制性舉例為，化合物、酶、抗體如單克隆抗體、小分子，以及其它有機和/或無機化合物包括金屬、鹽和離子。本發明為採用基因敲除技術來消除組織培養或者動物體內任意細胞內蛋白，提供了一種快速、簡便、和經濟的方法。例如，不僅第一試劑和第二試劑或者其編碼核酸可以被弓I入胚胎幹細胞或者胚泡(用於製備轉基因動物)，而且其可以用於胚胎或者動物發育的任意後續階段，甚至用於成年動物中。這樣，靶蛋白可以從早期發育階段降解，或者只在發育的特殊階段或者成年動物中降解。這使得可以通過特異性地消除目標細胞或者動物所有細胞內的多肽，來研究特異性靶蛋白的功能。 以下實施例僅用於說明，而非對本發明權利要求的限制。實施例I在哺乳動物細胞內靶向降解視網膜母細胞瘤(Rb)抑制蛋白此前，我們已證實，通過直接促進泛素介導的蛋白質水解反應，能夠在翻譯後水平實現Rb的敲除，所述Rb是一種半衰期長達9小時的蛋白。Gonzalez等Degradationof the retinoblastoma tumor suppressor by the human papillomavirus type 16E7 oncoprotein is important for functional inactivation and is separablefrom proteasomal degradation of E7.J. Virol. 2001;75:7583-91. Zhou 等 Harnessingthe ubiquitination machinery to target the degradation of specificcellular proteins. Mol. Cell. 2000;6:751-6. Zhang 等 Exploring the functionalcomplexity of cellular proteins by protein knockout. Proc Natl Acad Sci USA2003:100:14127-32。簡要地說，我們構建了一個雜合的E3連接酶，其能招暮Rb至基於CULl的包含Skpl、Cull和F-box的底物受體(SCF)泛素連接酶複合物，並促進Rb的聚泛素化及其後續的水解(圖2A)。在此過程中我們證明，可以改造RING家族泛素連接酶(例如SCF複合物)，使之能夠通過被稱為「蛋白質敲除」(PKO)的技術來對特定的細胞內蛋白進行招募、泛素化和誘導水角軍° Zhang 等 Ectopic targeting of substrates to the ubiquitinpathway. Methods Enzymol 2005;399:823-33. Zhou P. Targeted protein degradation.Curr Opin Chem Biol 2005;9:51-5o本發明中，我們通過將翻譯後PKO系統與轉錄物靶向RNAi聯合應用，在更短的時間內獲得了更高水平的蛋白質清除(圖I)。為了檢測這種雙交叉或雙敲除方法，我們利用抗-RBl shRNA 構建體(Zagorski WA, Knudsen ES, Reed MF. Retinoblastoma deficiencyincreases chemosensitivity in lung cancer. Cancer Res 2007;67:8264-73.) 和3 -TrCP-E7N構建體來靶向SA0S-2細胞中異位表達的Rb蛋白。使用pCDNA3-Rb-HA，以及編碼針對 Rb 的 shRNA 的 pMSCV_LMP_sh-Rb、編碼3 -TrCP_E7N 的 pCDNA3_0 _TrCP_E7N 中的任一個或二者，通過 nucleofection (Amaxa)轉染SA0S-2細胞。對照細胞用pMSCV-LMP轉染。所有的樣品在轉染後經嘌呤黴素篩選24小時，然後利用針對Rb、標籤或P -肌動蛋白的抗體進行免疫印跡分析。如圖2B所示，在轉染48小時後，單獨轉染sh-Rb (即針對Rb的shRNA)或^ -TrCP-E7N的樣品中，Rb表達水平分別減少29%和19% (相對於對照樣品)。在同時使用sh-Rb和PKO兩種構建體的樣品中，Rb的表達則幾乎完全被清除(僅剩4%Rb)，超過單獨使用shRNA或PKO構建體的樣品中觀察到的減少(圖2B)。因此這些結果證實，轉錄後和翻譯後敲除技術的聯合應用較單獨應用顯示出協同的更加有效的效果。Rb已被證實具有抑制E2F1轉錄活性的細胞內功能，我們進一步比較了單獨和聯合敲除技術在這方面破壞Rb的能力。在此，我們使用螢光素酶報告基因構建體，其由E2F1響應的 DHFR 啟動子(DHFR-Luc)驅動(圖 3A)。Sdek 等 The central acidic domain ofMDM2 is critical in inhibition of retinoblastoma-mediated suppression ofE2F andcell growth. 了 Biol Chem2004: 279:53317-22。首先對 SA0S-2 細胞轉染 pCDNA3-Rb_HAp、CDNA-E2Fl、pCMV-DPl、DHFR-luc、pRL-Tk (海腎(Renilla))以及上述敲除構建體，以進行雙
螢光素酶檢測(Promega)。裂解經嘌呤黴素選擇後的細胞，檢測Firef ly/Renilla (F/R)螢光素酶信號的比值，檢測三次。檢測結果以對照數值為參照進行歸一化，圖表表示了 F/R比率的平均倍數差異(三次結果)。在圖3B中，單獨的敲除方法僅產生相當有限的增加(20-30%)，並且不具有統計學意義，而聯合敲除方法則導致對DHFR啟動子活性的協同的去抑制作用(約增加兩倍)，且具有統計學意義(P〈0. 05)。因此，聯合RNAi和PKO的效果也協同性地超過任一種方法單獨產生的效果。實施例2靶向降解哺乳動物細胞的內源性pl07為了評價RNAi和PKO技術聯合應用靶向清除的動力學速率，同時也為了證明該技術的通用性，我們接下來靶向內源性P107蛋白。P107是腫瘤抑制蛋白Rb家族成員，其能結合HPV 16E7。用抗-RBLlsiRNA寡核苷酸轉染C33A細胞，來靶向pl07轉錄物(ThermoScientific)，然後用攜帶P-TrCP-E7N構建體的腺病毒對其進行感染。通過三次獨立實驗獲得P107蛋白表達水平的平均值，並以模擬轉染和感染的C33A細胞中的pl07蛋白水平為標準進行歸一化處理。在所有時間點，與siRNA或Adl-P -TrCP_E7N單獨處理相比，通過二者聯合處理過的細胞具有最大的P107敲除程度。與未處理的對照相比，siRNA轉染樣品中P107在24小時減少了 39%，在48小時減少了 53%(圖4)。Adl-P _TrCP_E7N轉染樣品比siRNA轉染樣品顯示出更顯著的P107清除水平，在24小時和48小時分別減少了 62%和94%。令人驚奇的是，轉染siRNA和Adl-P -TrCP-E7N的樣品在所有時點均達到最大的pl07敲除程度，pl07的下降水平在24小時和48小時分別達到73%和98% (圖4)。因此，RNAi和PKO聯合方法在清除pl07表達時比RNAi或PKO單獨應用時更加迅速和高效。本發明的範圍不受上述具體展示和描述的內容的限制。本領域技術人員可以認識到可用於替換或改變上述實例中的材料，配置，結構和規模。大量的參考文獻，包括專利和多種出版物在本發明的說明書中被引用和討論。這些參考文獻的引用和討論僅用於闡明本發明的描述，而不是認為任何參考文獻是本文所述發明的現有技術。在本發明的說明書中引用和討論的所有參考文獻通過整體引用併入本文。在不違背本發明的主旨和範圍的情況下，本領域的普通技術人員可能對上述說明進行改變、修改或者其它的補充說明。儘管已描述和說明了本發明的某些實施方式，但是在不違背本發明的主旨和範圍的情況下本領域技術人員顯然可對其進行各種改變和修改。在上述說明書中的物質 及其附圖只用於說明並不用於限制。
權利要求
1.一種降低細胞內至少一種靶蛋白水平的方法，所述方法包括使第一試劑和第二試劑與所述細胞接觸的步驟，其中所述第一試劑減少所述靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解，並且其中所述第一試劑在所述第二試劑之前、之後或同時與所述細胞接觸。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
3.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑是RNAi分子。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述RNAi分子是小幹擾RNA(siRNA)。
5.如權利要求3所述的方法，其中所述RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
6.如權利要求3所述的方法，其中所述RNAi分子是小分子核糖核酸(miRNA)。
7.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑是雙鏈RNA(dsRNA)。
8.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑是反義寡核苷酸。
9.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑是核酶。
10.如權利要求I所述的方法，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述泛素連接酶多肽是E3泛素連接酶多肽。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述E3泛素連接酶多肽選自SCF多肽、HECT多肽和UBRl多肽。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述F-box多肽選自Cdc4/FBff7、HOS、^ TrCP、FffDK Poplp、Pop2p、Grrlp 和 Met30p。
15.如權利要求12所述的方法，其中所述HECT多肽選自E6AP、Nedd4、RSP5、SmurfUTOMl 和 EDD。
16.如權利要求10所述的方法，其中所述靶蛋白相互作用結構域選自乳頭瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。
17.如權利要求I所述的方法，其中所述靶蛋白選自Rb、pl07、IicB、Siclp、Cln2p、E2、c-myc 和 3 -連環蛋白(3 -catenin)。
18.如權利要求I所述的方法，其中所述靶蛋白是細胞質蛋白、核內蛋白或者膜蛋白。
19.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑和所述第二試劑在分開的遞送載體中。
20.如權利要求I所述的方法，其中所述第一試劑和所述第二試劑在同一遞送載體中。
21.如權利要求I所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是人類細胞或者小鼠細胞。
23.如權利要求I所述的方法，其中所述方法用於在對象中治療或預防疾病或狀況。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述方法用於治療或預防癌症。
25.如權利要求23所述的方法，其中所述方法用於治療或預防心血管疾病。
26.如權利要求I所述的方法，其中所述方法用於在對象中診斷疾病或狀況。
27.—種表達載體,所述表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列，其中所述第一試劑減少靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解。
28.如權利要求27所述的表達載體，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或者減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
29.如權利要求27所述的表達載體，其中所述第一試劑是RNAi分子。
30.如權利要求29所述的表達載體，其中所述RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
31.如權利要求27所述的表達載體，其中所述第一試劑是反義寡核苷酸。
32.如權利要求27所述的表達載體，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
33.如權利要求32所述的表達載體，其中所述泛素連接酶多肽是E3泛素連接酶。
34.如權利要求33所述的表達載體，其中所述E3泛素連接酶選自SCF多肽、HECT多肽和UBRl多肽。
35.如權利要求34所述的表達載體，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
36.一種細胞,所述細胞包含表達載體，其中所述表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列，其中所述第一試劑減少細胞內靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解。
37.如權利要求36所述的細胞，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或者減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
38.如權利要求36所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
39.如權利要求38所述的細胞,其中所述哺乳動物細胞是人類細胞或小鼠細胞。
40.如權利要求36所述的細胞，其中所述第一試劑是RNAi分子。
41.如權利要求40所述的細胞，其中RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
42.如權利要求36所述的細胞，其中所述第一試劑是反義寡核苷酸。
43.如權利要求36所述的細胞，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
44.如權利要求43所述的細胞，其中所述泛素連接酶多肽是E3泛素連接酶。
45.如權利要求44所述的細胞，其中所述E3泛素連接酶選自SCF多肽、HECT多肽和UBRl多肽。
46.如權利要求45所述的細胞，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
47.—種包含第一表達載體和第二表達載體的細胞,其中所述第一表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列，所述第二表達載體包含編碼第二試劑的第二核酸序列，所述第一試劑減少細胞內靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解。
48.如權利要求47所述的細胞，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或者減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
49.如權利要求47所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
50.如權利要求48所述的細胞,其中所述哺乳動物細胞是人類細胞或小鼠細胞。
51.如權利要求47所述的細胞，其中所述第一試劑是RNAi分子。
52.如權利要求51所述的細胞，其中所述RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
53.如權利要求47所述的細胞，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
54.—種包含表達載體的製品，其中所述表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列和編碼第二試劑的第二核酸序列，所述第一試劑減少靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解。
55.如權利要求54所述的製品，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
56.如權利要求54所述的製品,其中所述第一試劑是RNAi分子。
57.如權利要求56所述的製品，其中所述RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
58.如權利要求54所述的製品，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
59.一種包含第一表達載體和第二表達載體的製品，其中所述第一表達載體包含編碼第一試劑的第一核酸序列，所述第二表達載體包含編碼第二試劑的第二核酸序列，所述第一試劑減少靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解。
60.如權利要求59所述的製品，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
61.如權利要求59所述的製品，其中所述第一試劑是RNAi分子。
62.如權利要求61所述的製品，其中所述RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
63.如權利要求59所述的製品，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
64.一種包含第一試劑和第二試劑的製品，其中所述第一試劑減少靶蛋白的合成，所述第二試劑增加所述靶蛋白的降解。
65.如權利要求64所述的製品，其中所述第一試劑降低所述靶蛋白mRNA的水平或減少所述革巴蛋白mRNA的翻譯。
66.如權利要求64所述的製品,其中所述第一試劑是RNAi分子。
67.如權利要求66所述的製品，其中所述RNAi分子是小髮夾RNA(shRNA)。
68.如權利要求64所述的製品，其中所述第二試劑是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。
全文摘要
本發明提供了降低細胞內至少一種靶蛋白水平的方法。將第一試劑和第二試劑與所述細胞接觸。所述第一試劑減少所述靶蛋白的合成，例如通過降低靶蛋白mRNA的水平或抑制mRNA的翻譯。所述第二試劑促進所述靶蛋白的降解。所述第一試劑可以在第二試劑之前、之後或同時接觸所述細胞。第一試劑和第二試劑可以在分開的遞送載體中，或在同一遞送載體中。第一試劑可以是RNAi分子(RNA幹擾)，如小幹擾RNA(siRNA)、小髮夾RNA(shRNA)或小分子核糖核酸(miRNA)。第二試劑可以是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素連接酶多肽和靶蛋白相互作用結構域。所述泛素連接酶可以是E3泛素連接酶，包括但不限於SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。在一個實施方式中，SCF多肽是F-box多肽。
文檔編號C12N15/11GK102802655SQ201180014213
公開日2012年11月28日 申請日期2011年1月17日 優先權日2010年1月15日
發明者周蓬勃 申請人:康奈爾大學