一種光學超分辨顯微成像系統的製作方法
2023-12-02 04:34:41 1
本實用新型涉及光學顯微成像領域，特別是涉及一種光學超分辨顯微成像系統。
背景技術：
隨著科學技術的發展，生命科學技術也得到了相應的發展，生物細胞成像的精度及準確度要求越來越高，微納材料的研究也如火如荼。而傳統光學顯微成像的空間解析度受限於物鏡的數值孔徑與光波長，解析度只能達到300nm左右，遠遠滿足不了現代顯微成像對解析度的要求。
螢光是自然界常見的一種發光現象。螢光是光子與分子的相互作用產生的，即螢光分子在吸收能量(光能、電能、化學能等等)後，從處於最低能量的基態躍遷到能量較高的激發態(第一或第二激發態)，激發態的電子處於高能量狀態，不穩定，會在納秒級的時間範圍內自發的躍遷回到基態，並以光子輻射的形式釋放出能量，具有這種性質的出射光稱為螢光。螢光成像的理論基礎是螢光物質被激發後所發射的螢光信號的強度在一定的範圍內與螢光素的量成線性關係。傳統的光學顯微成像即通過檢測這一自發輻射的螢光信號來成像的。
當處於激發態的螢光分子在外界輻射的影響下，產生與外界輻射同頻率、同相位和同偏振的輻射，即受激螢光輻射過程，如果這一過程競爭超過了自發螢光輻射，便不會測量到自發輻射的螢光，這種現象稱為STED(stimulated emission depletion，受激輻射耗盡)。基於該現象的光學顯微術屬於超分辨顯微成像技術，該方法從分子級別上改變成像原理，突破了傳統光學顯微成像因受衍射極限的限制而導致解析度無法提高的瓶頸，得到了很大的發展。
STED超分辨成像原理及光路如圖1-1至1-2所示，待成像目標受到第一束雷射激發產生螢光，形成具有衍射極限的圓斑(瑞利斑)，這個位置同時被第二束光束形狀為圓環的雷射激發，第二束雷射正好可以激發同一照射位置所形成光斑的非中心區域，兩束光疊加後使得只有中心區域的螢光分子能夠實現激發態自發輻射螢光，周圍的分子(即被第二束光照射的區域)處於耗損態不發光，這就使得有效的螢光激發半徑大大的降低，即光斑中心的螢光區域由於非中心的耗盡態區域的侵佔，直徑可以變得無限小，這樣就突破了瑞利衍射極限，提高成像的解析度。
現有技術中，STED超分辨成像方法雖然可以滿足解析度的要求，但是讓分子從基態轉化為激發態的需要的能量比較大，強的泵浦雷射會影響待成像目標的性質甚至是造成損壞；而且，該方法通常需要使用脈衝雷射，且對雷射脈衝需做精準的時序同步，需要較複雜的光學與電子系統，增加了操作成本，無疑也增大了費用成本。
技術實現要素：
本實用新型實施例的目的是提供一種光學超分辨顯微成像系統，使用低功率連續光泵浦，實現對待成像目標的超分辨顯微成像，不影響待成像目標的性質，而且光學系統與電子系統也相較STED簡單，節省了操作成本和費用成本。
為解決上述技術問題，本實用新型實施例提供以下技術方案：
本實用新型實施例提供了一種光學超分辨顯微成像系統，包括：
光學模塊以及成像模塊；
其中，所述光學模塊包括第一泵浦光單元、第二泵浦光單元以及第三泵浦光單元；
所述第一泵浦光單元用於利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態；
所述第二泵浦光單元用於產生第二波長空心光束，並利用所述第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設位置範圍內的分子轉化為第二電荷態；
所述第三泵浦光單元用於利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設位置範圍內的分子，以輻射螢光信號；
所述成像模塊用於根據所述待成像目標輻射的螢光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。
優選的，所述第一泵浦光單元包括：
光源，用於發射所述第一波長光束；
透鏡組，用於將所述第一波長光束聚焦到調製器，並將經所述調製器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；
所述調製器，用於將所述第一波長光束在預設時間範圍內轉化為第一高階衍射光束。
優選的，所述第二泵浦光單元包括：
光源，用於發射第二波長光束；
透鏡組，用於將所述第二波長光束聚焦到調製器，並將經所述調製器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；
所述調製器，用於將所述第一波長光束在預設時間範圍內轉化為第二高階衍射光束；
螺旋相位片，用於將所述第二波長光束轉化為所述第二波長空心光束。
優選的，所述第三泵浦光單元包括：
光源，用於發射所述第三波長光束；
透鏡組，用於將所述第三波長光束聚焦到調製器，並將經所述調製器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；
所述調製器，用於將所述第三波長光束在預設時間範圍內轉化為第三高階衍射光束。
優選的，所述光學模塊還包括：
合束單元，用於將三束泵浦光通過雙色片組和反射鏡合為一束，並通過物鏡聚焦到所述待成像目標上。
優選的，所述成像模塊包括：
雙色片，用於將所述待成像目標輻射的螢光信號與泵浦光信號進行分離；
濾波片，用於將分離的螢光信號中摻入的泵浦光信號濾出；
探測器，用於收集過濾的螢光信號，並將所述螢光信號發送到控制單元；
透鏡，用於將所述過濾的螢光信號聚焦到所述探測器上；
位置掃描單元，用於將所述待成像目標的待測像素點移動到預設位置，以對所述待測像素點進行成像；
所述控制單元用於計算所述螢光信號的光強，並根據所述待成像目標輻射的螢光信號的光強與對應的位置對所述待成像目標進行成像。
優選的，所述調製器為聲光調製器。
優選的，所述控制單元包括數據採集卡和脈衝信號卡。
優選的，所述探測器為單光子探測器。
本實用新型實施例提供了一種光學超分辨顯微成像系統，包括光學模塊以及成像模塊；光學模塊用於通過第一波長光束以及第二波長光束照射待成像目標，以使待成像目標的分子初始化為第一電荷態以及在第一預設位置範圍內分子轉化為第二電荷態；利用第三波長光束照射待成像目標第二預設位置範圍內的分子，以輻射螢光信號；根據所述待成像目標輻射的螢光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。
本實用新型的優點在於使用低功率連續光泵浦，實現了對待成像目標的超分辨顯微成像。與現有技術相比，由於電荷態較激發態(幾個納秒)的壽命較長，可達到秒量級，故功率較低的泵浦光便可控制待成像目標的電荷態，採用較低功率的泵浦光不影響待測樣品的性質；此外，本申請技術方案不需要對雷射脈衝做精準的時序同步，故光學系統與電子系統結構也相較簡單，使用和組裝更加方便，節省了操作成本和費用成本，提高了用戶的使用體驗。
附圖說明
為了更清楚的說明本實用新型實施例或現有技術的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實用新型的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1-1為本實用新型實施例提供的STED超分辨成像原理圖；
圖1-2為本實用新型實施例提供的STED超分辨成像與普通成像的光路圖；
圖2為本實用新型實施例提供的光學超分辨顯微成像系統的一種具體實施方式的結構圖；
圖3為本實用新型實施例提供的光學超分辨顯微成像系統的另一種具體實施方式的結構圖；
圖4為本實用新型實施例提供的控制信號與讀取信號序列圖；
圖5為本實用新型實施例提供的一個示例性應用場景的示意圖；
圖6為本實用新型實施例提供圖5中示例性例子的光學超分辨顯微成像系統的結構示意圖；
圖7為本實用新型實施例提供的圖5中示例性例子的成像示意圖；
圖8為本實用新型實施例提供的圖5中示例性例子的成像示意圖；
圖9為本實用新型實施例提供的光學超分辨顯微成像系統的工作流程示意圖。
具體實施方式
為了使本技術領域的人員更好地理解本實用新型方案，下面結合附圖和具體實施方式對本實用新型作進一步的詳細說明。顯然，所描述的實施例僅僅是本實用新型一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本實用新型中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本實用新型保護的範圍。
本申請的說明書和權利要求書及上述附圖中的術語「第一」、「第二」、「第三」「第四」等是用於區別不同的對象，而不是用於描述特定的順序。此外術語「包括」和「具有」以及他們任何變形，意圖在於覆蓋不排他的包含。例如包含了一系列步驟或單元的過程、方法、系統、產品或設備沒有限定於已列出的步驟或單元，而是可包括沒有列出的步驟或單元。
首先參見圖2，圖2為本實用新型實施例提供的光學超分辨顯微成像系統在一種具體實施方式中的結構圖，本實用新型實施例可包括以下內容：
一種光學超分辨顯微成像系統可包括光學模塊21以及成像模塊 22。
其中，所述光學模塊21包括第一泵浦光單元211、第二泵浦光單元212以及第三泵浦光單元213。
所述第一泵浦光單元211用於利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態。
所述第二泵浦光單元212用於產生第二波長空心光束，並利用第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設位置範圍內分子轉化為第二電荷態。
所述第三泵浦光單元213用於利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設位置範圍內的分子，以輻射螢光信號。
待成像目標一般為螢光材料，或者是使用螢光材料進行修飾的材料，例如螢光蛋白標記的細胞。螢光材料通常存在著帶有不同電荷量的狀態，不同的電荷態的螢光光譜和強度不同，而且，電荷態的壽命較長，通常可達到秒量級，而分子的激發態壽命僅僅為幾個納秒。
螢光材料的大多數分子在常態下，是處於具有最低能量的基態能級，當受到能量(光能、電能、化學能等等)激發後，該螢光材料會吸收能量進行躍遷。分子不同狀態的吸收的能量是不同的，可根據螢光材料分子的性質確定使其躍遷到需求的分子狀態需要吸收的能量。也就是說不同的波長的光可將同一螢光材料的分子泵浦到不同的電荷態，舉例來說，對於金剛石中的氮-空位(nitrogen vacancy，NV)色心螢光材料來說，NV的電荷態主要為帶負電的NV-以及電中性的 NV0，使NV分子的電荷態變為NV-需要使用637nm雷射進行泵浦，而使NV分子的電荷態變為NV0則使用532nm雷射進行泵浦。
第一波長光束、第二波長空心光束以及第三波長光束可以是雷射光束，當然也可以為其他任何一種光，例如紅外光，紫外光，極光， X射線等等；當然也可為其他能量如電能、化學能，本實用新型實施例並不對此做任何的限定。
需要說明的是，由上可知第一波長光束(初始光)與待成像目標的分子處於第一電荷態相對應；第二波長光束(轉換光)與待成像目標的分子處於第二電荷態相對應。
第二波長空心光束需要在第二波長光束的基礎上進行轉換，例如雷射光束為高斯形狀的光束，為了獲得空心形狀的光束，高斯光束可通過一片螺旋相位片進行轉化。相位片對光束相位按照入射面上的角分布進行不同的調製，從而獲得空心光束。
待成像目標的第一預設位置範圍為光束照射在待成像目標不包括空心光束空心對應照射位置的其他位置，也就是說當第一波長光束與第二波長光束為同樣形狀的光時，第一預設位置範圍為第一波長光束照射在待成像目標的表面區域減去第二波長空心光束空心位置映射在待成像目標的區域。舉例來說，假設第一波長光束與第二波長光束皆為高斯光束，當其照射在待成像目標時，光束的直徑為1cm，第二波長空心光束的空心位置映射在待成像目標的直徑為0.1cm，則第一預設位置範圍為外直徑為1cm，內直徑為0.1cm的圓環的區域。
第三波長光束作為探測光，照射第二預設位置範圍內的螢光材料分子，使其吸收光能從當前的電荷態躍遷到激發態，再從激發態回到基態，以光子輻射的形式釋放出能量，即發射螢光。
第二預設位置範圍可為第一預設位置範圍；也可為第一波長光束照射待成像目標的表面區域不包含第一預設位置範圍的其他任何區域，也可以是第二波長空心光束空心位置映射在待成像目標的區域；當然也可為任意指定的光束照射在待成像目標的表面區域上的任何一塊區域。可根據實驗者或用戶的需求來確定第二預設位置範圍的區域。
所述成像模塊22用於根據所述待成像目標輻射的螢光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。
成像模塊22通過獲取螢光並收集螢光，將收集到的螢光發送到控制單元，控制單元通過對收集到的螢光的光強進行計算，然後根據螢光光強信息通過軟體(例如MATLAB、LabVIEW)進行對待成像目標進行成像。
可選的，在本實施例的一些實施方式中，所述第一泵浦光單元211 可包括：
光源2111，用於發射所述第一波長光束；
透鏡組2112，用於將所述第一波長光束聚焦到調製器，並將經所述調製器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；
所述調製器2113，用於將所述第一波長光束在預設時間範圍內轉化為第一高階衍射光束。
所述第二泵浦光單元212包括：
光源2121，用於發射第二波長光束；
透鏡組2122，用於將所述第二波長光束聚焦到調製器，並將經所述調製器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；
所述調製器2123，用於將所述第一波長光束在預設時間範圍內轉化為第二高階衍射光束；
螺旋相位片2124，用於將所述第二波長光束轉化為所述第二波長空心光束。
所述第三泵浦光單元213包括：
光源2131，用於發射所述第三波長光束；
透鏡組2132，用於將所述第三波長光束聚焦到調製器，並將經所述調製器出來的光準直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標上；
所述調製器2133，用於將所述第三波長光束在預設時間範圍內轉化為第三高階衍射光束。
光源2111、光源2121、光源2131可為雷射光源，也可為其他光源。雷射光源可為半導體雷射器，當然也可採用其他類型的雷射器。因為雷射光源的準直性高、亮度高、單色性好、能量密度大等優勢，優選的，可採用雷射光源。
需要說明的是，光源2111、光源2121、光源2131可為同一臺機器發射的不同波長的光，也可為三臺不同的機器發射三束泵浦光。
調製器用於將當前的光束在預設時間範圍內轉化為高階衍射光束，即用來控制各光源的開關和持續時間。調製器的個數與光源的個數相對應，舉例來說，如果三束泵浦光由一臺半導體雷射器產出。則只需要一臺調製器。
調製器可置於光束焦點處，調整調製器的三維位置與角度，使光束通過調製器後發生衍射，產生高階衍射光束。調製器可通過控制單元發射預設信號來控制，當對調製器加信號後，可以得到高階衍射光。舉例來說，當調製器接收控制單元發射的高電壓TTL信號時，調製器將泵浦光轉化為高階衍射光束輸出；當接收低電壓TTL信號時，則調製器不輸出光束。
優選的，調製器可採用聲光調製器，高階衍射光可為聲光調製器的1階衍射光，其衍射效率可達百分之八十左右，消光比約為2000： 1。TTL控制信號可由插置於控制單元的PCI卡產生，並通過LabView 程序進行控制。通過採用調製器對光源照射時間的控制和光源的開啟和關閉，避免用戶自己操作，節約操作成本，提升用戶的使用體驗；此外，經過調整後的光束可以獲得更好的成像效果。
透鏡組主要用於對光源出射的光進行整形，使其達到最好的成像效果。例如可採用焦距為15cm的凸透鏡將三束不同波長的光束由平行光聚焦到凸透鏡焦點，使其全部或大多數的光可通過下一個器件。經過調製器後，光束可通過另外一個15cm焦距的凸透鏡將光束重新準直為平行光束。
優選的，可採用美國RPC Photonics公司的VPP-1a螺旋相位片，獲得的空心光束中心光功率密度與最高光密度之比約為2：100。
需要說明的是，三束泵浦光可以同時照射帶成像目標，也可依次進行照射，當然也可根據預設的時間進行照射，預設的時間一般為多次實驗總結出效果最好的的照射時間。舉例來說，初始光照射時間為 10微秒，轉換光照射時間為10微秒，探測光照射時間為1毫秒。
作為一種具體實施方式，請參閱圖3，上述實施例中的光學模塊還可還包括：
合束單元，用於將三束泵浦光通過雙色片組和反射鏡合為一束，並通過物鏡聚焦到所述待成像目標上。
第一波長光束(初始化光)通過凸透鏡準直的平行光經過反射鏡投射到第一雙色片，第二波長空心光束(轉換光)通過凸透鏡準直的平行光入射到第一雙色片，第三波長光束(探測光)通過凸透鏡準直的平行光入射到第二雙色片，初始化光與轉換光通過第一雙色片入射到第二雙色片後再入射到第三雙色片，從第三雙色片出射的三束光通過第三雙色片入射到物鏡上，通過物鏡將三束光聚焦到待成像目標。優選的，物鏡的數值孔徑可為NA＝0.9。調節雙色片的位置與角度，使三束雷射光束通過物鏡後的聚焦點能夠完美重合。
需要說明的是，當三束光分別在各自的預設時間內依次照射待成像目標時，則不需要合束單元。
通過將三束泵浦光進行合束，使其全部或絕大多數的光照射到待成像目標上，從而獲取更多的螢光信號，有利於對待成像目標進行成像。
在本實施例的另一些實施方式中，請參閱圖3，成像模塊22可包括：
螢光收集單元221，用於對待成像目標輻射的螢光光子進行收集，具體包括：
雙色片2211，用於所述待成像目標輻射的螢光信號與泵浦光信號進行分離。
濾波片2212，用於將分離的螢光信號中摻入的泵浦光信號濾出。
探測器2213，用於收集過濾的螢光信號，並將所述螢光信號發送到控制單元。
透鏡2214，用於將所述過濾的螢光信號聚焦到所述探測器上。
位置掃描單元222，用於將所述待成像目標的待測像素點移動到預設位置，以對所述待測像素點進行成像。
所述控制單元223用於計算所述螢光信號的光強，並根據所述待成像目標輻射的螢光信號的光強與對應的位置對所述待成像目標進行成像。
因為泵浦光照射到待成像目標上，然後待成像目標會自發輻射螢光光子，這樣不可避免的泵浦光與螢光會有重合，而螢光的光強較弱，與泵浦光混合後難以識別，故需要雙色片進行分離；此外，由於兩者光強懸殊太大，導致螢光中只要混較少的泵浦光，對收集等後續操作都是不利的，故還需要經過濾波片進行進一步的過濾，將螢光信號中摻入的泵浦光濾出，以得到純度較高的螢光光子，獲得更佳的成像效果。
需要說明的是，雙色片2211與實施例中的第三雙色片可以為同一片雙色片，即雙色片2211即為第三雙色片，這樣即可以節省材料和成本，又可簡化系統結構。
優選的，可採用單光子探測器進行收集螢光光子，螢光光束可由一個7.5cm焦距的凸透鏡聚焦到單光子探測器。每當一個螢光光子被測量到，單光子探測器將發出一個TTL脈衝信號。TTL信號被控制單元的數據採集卡記錄，從而得到螢光強度數值。
對待成像目標進行成像時，可以直接對整個目標進行成像，也可按照每一個像素點進行成像，優選的，可採用第二種方式。通過位置掃描單元將待成像目標的待測像素點移動到探測位置，對每一個像素點輻射的螢光進行收集，然後根據該像素點的位置與光強的關係利用控制單元進行成像。位置掃描系統可為壓電陶瓷位移臺，壓電陶瓷位移臺可採購德國PI公司P733.3系列，位置掃描系統可通過控制單元進行控制，即通過控制單元控制壓電平移臺將樣品移動到下一個位置，依次完成對每一個像素點的螢光強度的測量。
舉例來說，以二維成像為例，在對面積為2微米*2微米的待成像目標進行成像時，可將成像區域分為40*40個像素點，每個像素點大小則為50納米＊50納米。利用壓電平移臺將樣品依次移動到40*40 個坐標，分別測量每個坐標點的螢光強度，對該待成像目標進行光學超分辨成像。
控制單元，可由電腦以及整合到電腦主板的數據採集卡和脈衝信號發生卡構成，數據採集卡可採購美國NI公司的USB6343系列，脈衝信號發生卡可採購美國Spincore公司生產的PCI脈衝卡。控制系統可基於LabVIEW軟體編寫，可用於對光源開關和位置移動的控制，獲取的螢光強度和位置信息也可通過LabVIEW程序實現最終的成像。
需要說明的是，對待成像目標或每一個像素點進行成像時，通常需要對每一塊區域或每一個像素點循環多次以獲得足夠的螢光光子計數。也就是說初始光、轉化光、探測光需要循環多次。這樣，通過獲得足夠多的螢光光子，得到較高的光強值，有利於對待成像目標進行超分辨成像。
在一種具體的實施方式，舉例來說，可參見圖5，圖5為控制信號與讀取信號序列圖。對一個像素點進行收集螢光光子時，可採用初始光照射10微秒，轉換光照射20微秒，探測光照射10微秒，然後初始光、轉化光、探測光在50毫秒內循環多次進行。
為了更好的理解本實用新型實施例的原理和思想，請參閱圖5至圖8，以下以一種具體的應用場景介紹利用本實用新型實施例所述的光學超分辨顯微成像系統對金剛石中的NV(nitrogen vacancy，氮-空位)色心螢光材料進行光學超分辨顯微成像。
NV有兩種電荷態，帶負電的NV-，以及電中性的NV0。如圖5 所示，637納米雷射可將NV以95％的概率泵浦到NV0電荷態；而532 納米雷射可將NV以75％的概率泵浦到NV-電荷態。589納米雷射可用於對電荷態進行探測。由於NV-輻射的螢光波長比NV0輻射的螢光波長更長，可採用在光路中加入650納米長通濾波片濾出NV0輻射的光子，從而只探測NV-輻射的光子。
如圖6所示，為對NV進行光學超分辨成像的光路及系統圖。圖中1為第一波長光束(初始光)，2為第三波長光束(探測光)，3為第二波長光束(轉換光)，三束光通過半導體雷射器同時發射；4為凸透鏡，用於對光束進行準直；5為聲光調製器，用於對光束的開閉進行控制以及將光束調製為一階衍射光，聲光調製器通過控制單元的脈衝信號發生卡141進行控制；6為螺旋相位片用於將第二波長光束調製為空心光束；反射鏡10、雙色片7-1、7-2、7-3用於對三束泵浦光進行合束將其照射到待成像目標9上；8物鏡用於進一步將合束後的光聚焦到待成像目標9上；7-3雙色片與11濾波片為了對螢光中的泵浦光進行分離得到純度較高的螢光；螢光經過凸透鏡12與4聚焦到單光子探測器13上進行螢光的收集；單光子探測器收集到一個螢光光子，便將發出一個TTL脈衝信號，TTL信號被控制單元14的數據採集卡 142記錄，從而得到螢光強度數值。
電荷態的壽命較長，通常可達到秒量級，因此可以使用功率較低的光束控制電荷態。而受激輻射耗盡技術中，需要控制的是螢光材料的激發態，其壽命僅為幾個納秒，自發輻射速率較大。為了實現對螢光強度的控制，其雷射泵浦的受激輻射耗儘速率需要大於其自發輻射速率。受激輻射耗盡的雷射功率較高，通常達到上百毫瓦；相反本實用新型的雷射功率僅需幾毫瓦便可獲得較高的解析度。因637和532 納米雷射均能用作成像的初始化光或轉化光，有兩種實現超分辨成像的方案。
請參閱圖7，以637納米雷射為初始化光，532納米光為轉化光實現超分辨成像：
對於每一個像素點的螢光測量，首先用一束功率為2毫瓦的637 納米高斯光束將NV初始化到NV0，光束的持續時間可為10微秒；然後用30毫瓦的532納米空心光束將除光束中心以外的NV的電荷態轉化為NV-，光束的持續時間也可為10微秒；最後用40微瓦的589納米高斯光束泵浦，並用單光子計數器測量NV-電荷態對應的光子數。「初始化-轉化-探測」序列循環50毫秒，然後通過壓電平移臺控制NV 待成像目標進行移動，測量下一個像素點的螢光強度。由於光束中心的NV始終處於NV0態，而探測的是NV-態的螢光，最後得到的圖像中每個暗點代表一個NV。在這樣的泵浦條件下，得到的單個NV的解析度達約為25納米，遠低於350納米左右的衍射極限。
請參閱圖8，以532納米雷射為初始化光，637納米雷射為轉化光實現超分辨成像：
首先用一束功率為2毫瓦的532納米高斯光束將NV初始化NV-，光束的持續時間可為10微秒；然後用30毫瓦的637納米空心光束將除光束中心以外的NV的電荷態轉化為NV0，光束的持續時間為10 微秒；最後用40微瓦的589納米高斯光束泵浦，並測量NV-電荷態輻射的光子數。每一個像素點的螢光測量時間同樣為50毫秒。由於光束中心的NV處於NV-電荷態，最後得到的圖像中每個亮點代表一個NV。在這樣的泵浦條件下，得到的單個NV的解析度達約為45納米，同樣遠低於衍射極限。
由上可知，本實用新型實施例使用低功率連續光泵浦，不僅實現了對待成像目標的超分辨顯微成像，而且不影響待成像目標的性質，與現有技術相比，不需要對雷射脈衝做精準的時序同步，故光學與電子系統結構也相較簡單，使用和組裝更加方便，節省了操作成本和費用成本，提高了用戶的使用體驗。
請參閱圖9，圖9為本實用新型實施例提供的光學超分辨顯微成像系統的工作流程示意圖，本實用新型實施例可包括以下內容：
S901：利用第一波長光束照射待成像目標，以使所述待成像目標的分子初始化為第一電荷態；
S902：利用第二波長空心光束照射所述待成像目標，以使所述待成像目標第一預設位置範圍內分子轉化為第二電荷態；
S903：利用第三波長光束照射所述待成像目標第二預設位置範圍內的分子，以輻射螢光信號；
S904：根據所述待成像目標輻射的螢光信號的光強信息對所述待成像目標進行成像。
由上可知，本實用新型實施例使用低功率連續光泵浦，不僅實現了對待成像目標的超分辨顯微成像，而且不影響待成像目標的性質，與現有技術相比，不需要對雷射脈衝做精準的時序同步，故光學與電子系統結構也相較簡單，使用和組裝更加方便，節省了操作成本和費用成本，提高了用戶的使用體驗。
專業人員還可以進一步意識到，結合本文中所公開的實施例描述的各示例的單元及算法步驟，能夠以電子硬體、計算機軟體或者二者的結合來實現，為了清楚地說明硬體和軟體的可互換性，在上述說明中已經按照功能一般性地描述了各示例的組成及步驟。這些功能究竟以硬體還是軟體方式來執行，取決於技術方案的特定應用和設計約束條件。專業技術人員可以對每個特定的應用來使用不同方法來實現所描述的功能，但是這種實現不應認為超出本實用新型的範圍。
結合本文中所公開的實施例描述的方法或算法的步驟可以直接用硬體、處理器執行的軟體模塊，或者二者的結合來實施。軟體模塊可以置於隨機存儲器(RAM)、內存、只讀存儲器(ROM)、電可編程 ROM、電可擦除可編程ROM、寄存器、硬碟、可移動磁碟、CD-ROM、或技術領域內所公知的任意其它形式的存儲介質中。
以上對本實用新型所提供的光學超分辨顯微成像系統進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本實用新型的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用於幫助理解本實用新型的方法及其核心思想。應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本實用新型原理的前提下，還可以對本實用新型進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本實用新型權利要求的保護範圍內。