樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA檢測方法
2023-12-02 06:56:16 2
專利名稱：樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA檢測方法
技術領域：
本發明屬於免疫學檢測方法領域，具體涉及檢測樹駒IgG的抗體夾心ELISA方法。
背景技術：
樹駒(Tupaia, tree shrew)是一種形似松鼠的小型攀緣型哺乳動物，主要分布於 亞洲東南部的熱帶和亞熱帶地區，在我國雲南、廣西、廣東和海南等地廣泛分布。樹駒體型 小，生長繁殖快，易於捕捉、馴養和繁殖成本低，其新陳代謝特點和解剖學一些特點比齧齒 類動物更接近人類，很多人把樹駒歸到靈長類動物中。隨著國內外非人靈長類資源的逐漸 減少和實驗動物小型化的發展趨勢，樹駒作為研究人類相關疾病的可能動物模型受到廣泛 關注，現已應用於病毒學、腦缺血、神經、糖尿病、心理、血管、腫瘤、寄生蟲等方面的研究。國內外學者用樹駒作為動物模型在病毒學方面的研究和應用已有很多，可以此為 基礎利用樹駒進行多種病毒感染的發病機理，藥物篩選以及疫苗製備和檢定的研究，其中 研究最多的是肝炎病毒和皰疹病毒。樹駒作為一種人類疾病實驗動物模型有很大的應用前景，尤其是病毒性疾病動物 模型，但研究主要局限在通過PCR檢測病毒核酸和其它一些生理指標上。抗體水平是疾病 檢測中重要的指標之一，受研究工具的影響，與樹駒疾病相關抗體的研究很少。抗體方面研 究很難實現，樹駒應用於人類疾病，尤其是病毒方面動物模型有很大的阻礙，因此製備樹鼠句 抗體研究工具和建立抗體方法成為目前亟待解決的問題。迄今，現有技術中未見有檢測樹 鼠句IgG的方法的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測樹駒IgG的三抗體夾心ELISA方法，用於檢測樹 鼠句血漿中總IgG的含量。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案樹駒IgG的三抗體夾心ELISA檢測方法，包括以鼠抗樹駒IgG單克隆抗體為捕獲 抗體，以兔抗樹駒IgG多克隆抗體為二抗與抗原樹駒IgG結合，以羊抗兔IgG-HRP為檢測抗 體，建立檢測樹駒IgG的三抗體夾心ELISA方法。該方法包括將捕捉抗體即鼠抗樹駒IgG單克隆抗體包被與ELISA板上，100 μ 1/ 孔，37°C溫育2h，4°C過夜；將檢測樣品和標準品與固相化的捕捉抗體保溫，使樹駒IgG與捕 捉抗體結合，37°C溫育Ih ；使結合到固相化捕捉抗體上的樹駒IgG與二抗即兔抗樹駒IgG 多克隆抗體結合，37°C溫育Ih ；加入檢測抗體即羊抗兔IgG-HRP與兔抗樹駒IgG多克隆抗 體結合，37°C溫育lh，來檢測樹駒IgG。該方法中的酶標板為購自Coster公司的96孔單孔可拆式酶標板，包被緩衝液為 PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩衝液，樣品稀釋液為pH 7. 4的PBS緩衝液，洗滌液為0. 05 % 的PBST緩衝液，商品化的羊抗兔IgG-HRP購自博士德生物工程有限公司。該方法更具體的步驟包括
(I)IgG標準曲線的建立含1/400鼠抗樹駒IgG單克隆抗體腹水的包被液包被酶標板，100 μ 1/孔，37°C溫 育2h，4°C過夜；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹； 2% BSA封閉，200 μ 1/孔，37°C溫育2h ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去 洗滌液在吸水紙上拍幹；加不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG，將標準品樹駒IgG稀釋成濃 度為 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、 1· 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml,0. 125 μ g/ml,0. 0625 μ g/ml ；同時設陰性對照和空白 對照，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍 幹；加1/2000兔抗樹鼠句IgG多克隆抗體，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/ 孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/8000酶標羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C溫 育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加入TMB底 物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光溫育15min ；加入2M H2SO4終止反應，100 μ 1/孔，用酶標儀測 定OD45tl值；以不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG含量為橫坐標，以相應的OD值為縱坐標繪製 標準曲線，建立回歸方程；(2)樹駒血漿中IgG含量檢測含1/400鼠抗樹駒IgG單克隆抗體腹水的包被液包被酶標板，100 μ 1/孔，37°C溫 育2h，4°C過夜；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹； 2% BSA封閉，200 μ 1/孔，37°C溫育2h ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去 洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/5000待檢樹駒血漿，不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG，將標 準品樹鼠句 IgG 稀釋成濃度為 10. 0 μ g/ml,8. 0 μ g/ml,6. 0 μ g/ml,5. 0 μ g/ml,4. 0 μ g/ml, 3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、l. 0μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 25μ g/mUO. 125 μ g/mUO. 0625 μ g/ml, 同時設陰性對照和空白對照，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄 去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/2000兔抗樹駒IgG多克隆抗體，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ； PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/8000酶標羊 抗兔，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min,棄去洗滌液在 吸水紙上拍幹；加入TMB底物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光溫育15min ；加入2M H2SO4終止反 應，100 μ 1/孔，用酶標儀測定OD45tl值。本發明的方法可以概括為以鼠抗樹駒IgG單克隆抗體為捕獲抗體，以兔抗樹駒IgG多克隆抗體為二抗與抗 原樹駒IgG結合，以商品化的羊抗兔IgG-HRP為檢測抗體，建立檢測樹駒IgG的三抗體夾心 ELISA方法。包括以下步驟①將捕捉抗體即鼠抗樹駒IgG單克隆抗體包被與ELISA板上；②將檢測樣品和標準品與固相化的捕捉抗體保溫，使樹駒IgG與捕捉抗體結合；③使結合到固相化捕捉抗體上的樹駒IgG與二抗即兔抗樹駒IgG多克隆抗體結 合；④加入檢測抗體即商品化的羊抗兔IgG-HRP與兔抗樹駒IgG多克隆抗體結合，來 檢測樹駒IgG。⑤包被、封閉、兔抗樹駒多抗結合、羊抗兔檢測抗體結合、顯色、終止等不同環節， 進行試劑濃度、反應時間優化，最終建立方法。
⑥從自有種群中選取30隻健康樹駒，尾靜脈採血，EDTA抗凝獲得血漿，用所建立 方法，進行血漿中IgG定量檢測。上述三抗體夾心ELISA方法中酶標板為購自Coster公司的96孔單孔可拆式酶標 板，包被緩衝液為PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩衝液，樣品稀釋液為pH 7. 4的PBS緩衝液， 洗滌液為0. 05 %的PBST緩衝液，商品化的羊抗兔IgG-HRP購自博士德生物工程有限公司。本發明的積極效果在於以鼠抗樹駒IgG單克隆抗體為捕獲抗體，以兔抗樹駒IgG 多克隆抗體為二抗與抗原樹駒IgG結合，以商品化的羊抗兔IgG-HRP為檢測抗體，建立檢測 樹駒IgG的三抗體夾心ELISA方法。檢測樹駒IgG的三抗體夾心ELISA方法的建立及其應 用，為研究樹駒抗體提供了有力的工具，為樹駒作為人類相關疾病，尤其是人類病毒的實驗 動物模型建立奠定了基礎。
圖1為樹駒IgG濃度-OD45tl值曲線；橫坐標為不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG,縱 坐標為相應的OD45tl值。圖2為樹駒IgG濃度-OD45tl值標準曲線；橫坐標為不同稀釋濃度的標準品樹鼠句 IgG,縱坐標為相應的OD45tl值。
具體實施例方式下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不此 來限定本發明。實施例1 下面本發明的三抗體夾心ELISA方法中使用的酶標板均為購自Coster公司的96 孔單孔可拆式酶標板，包被緩衝液為PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩衝液，樣品稀釋液為pH 7.4的PBS緩衝液，洗滌液為0. 05%的PBST緩衝液，商品化的羊抗兔IgG-HRP購自博士德 生物工程有限公司。三抗體夾心ELISA方法的建立1、方法1. 1、IgG標準曲線的建立含1/400鼠抗樹駒IgG單克隆抗體腹水的包被液包被酶標板，100 μ 1/孔，37°C溫 育2h，4°C過夜；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹； 2% BSA封閉，200 μ 1/孔，37°C溫育2h ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去 洗滌液在吸水紙上拍幹；加不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG，將標準品樹駒IgG稀釋成濃 度為 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、 1· 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml, 0. 125 μ g/ml,0. 0625 μ g/ml,同時設陰性對照和空白 對照，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍 幹；加1/2000兔抗樹鼠句IgG多克隆抗體，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/ 孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/8000酶標羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C溫 育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加入TMB底 物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光溫育15min ；加入2M H2SO4終止反應，100 μ 1/孔，用酶標儀測定OD45tl值。以不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG含量為橫坐標，以相應的OD值為縱坐標繪 制標準曲線，建立回歸方程。1. 2、樹駒血漿中IgG含量檢測含1/400鼠抗樹駒IgG單克隆抗體腹水的包被液包被酶標板，100 μ 1/孔，37°C溫 育2h，4°C過夜；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹； 2% BSA封閉，200 μ 1/孔，37°C溫育2h ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去 洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/5000待檢樹駒血漿，不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG，將標 準品樹鼠句 IgG 稀釋成濃度為 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、 3· 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、l. 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/mU0. 125μ g/mU0. 0625 μ g/ml, 同時設陰性對照和空白對照，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄 去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/2000兔抗樹駒IgG多克隆抗體，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ； PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/8000酶標羊 抗兔，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min,棄去洗滌液在 吸水紙上拍幹；加入TMB底物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光溫育15min ；加入2M H2SO4終止反 應，100 μ 1/孔，用酶標儀測定OD45tl值。2、結果將標準品樹駒IgG 稀釋成濃度為 10. 0 μ g/ml、8· 0 μ g/ml、6· 0 μ g/ml、5. 0 μ g/ ml、4. 0μ g/ml>3. 0 μ g/ml>2. 0 μ g/ml、l. 0μ g/ml、0. 5μ g/mU0. 25 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、 0. 0625 μ g/ml,重複檢驗三次，結果表明，其具有良好線性關係的檢測區間為0. 25 μ g/ ml 3. 0 μ g/ml，標準曲線方程為 y = 0. 3674x_0. 0352 (R2 = 0. 9912)。選取30隻健康樹駒，尾靜脈採血，EDTA抗凝獲得血漿，用上述建立的方法進行抗 凝血漿的IgG含量檢測。檢測結果為樹駒抗凝血漿的IgG含量水平為8. 6-17. 8g/L。
權利要求
樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA檢測方法，包括以鼠抗樹鼩IgG單克隆抗體為捕獲抗體，以兔抗樹鼩IgG多克隆抗體為二抗與抗原樹鼩IgG結合，以羊抗兔IgG HRP為檢測抗體，建立檢測樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA方法。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於該方法包括將捕捉抗體即鼠抗樹駒IgG 單克隆抗體包被與ELISA板上，100 μ 1/孔，37°C溫育2h，4°C過夜；將檢測樣品和標準品與 固相化的捕捉抗體保溫，使樹駒IgG與捕捉抗體結合，37°C溫育Ih ；使結合到固相化捕捉抗 體上的樹駒IgG與二抗即兔抗樹駒IgG多克隆抗體結合，37°C溫育Ih ；加入檢測抗體即羊 抗兔IgG-HRP與兔抗樹駒IgG多克隆抗體結合，37°C溫育lh，來檢測樹駒IgG。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於上述三抗體夾心ELISA方法中酶標板為 購自Coster公司的96孔單孔可拆式酶標板，包被緩衝液為pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩 衝液，樣品稀釋液為PH 7. 4的PBS緩衝液，洗滌液為0. 05%的PBST緩衝液，商品化的羊抗 兔IgG-HRP購自博士德生物工程有限公司。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於更具體的步驟為(1)IgG標準曲線的建立含1/400鼠抗樹駒IgG單克隆抗體腹水的包被液包被酶標板，100 μ 1/孔，37 °C溫 育2h，4°C過夜；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹； 2% BSA封閉，200 μ 1/孔，37°C溫育2h ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去 洗滌液在吸水紙上拍幹；加不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG，將標準品樹駒IgG稀釋成濃 度為 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、 1· 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml,0. 125 μ g/ml,0. 0625 μ g/ml ；同時設陰性對照和空白 對照，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍 幹；加1/2000兔抗樹鼠句IgG多克隆抗體，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/ 孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/8000酶標羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C溫 育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加入TMB底 物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光溫育15min ；加入2M H2SO4終止反應，100 μ 1/孔，用酶標儀測 定OD45tl值；以不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG含量為橫坐標，以相應的OD值為縱坐標繪製 標準曲線，建立回歸方程；(2)樹駒血漿中IgG含量檢測含1/400鼠抗樹駒IgG單克隆抗體腹水的包被液包被酶標板，100 μ 1/孔，37°C溫育2h， 4°C過夜；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；2% BSA封 閉，200 μ 1/孔，37°C溫育2h ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水 紙上拍幹；加1/5000待檢樹駒血漿，不同稀釋濃度的標準品樹駒IgG，將標準品樹駒IgG稀 釋成濃度為 10. 0 μ g/ml,8. 0 μ g/ml,6. 0 μ g/ml,5. 0 μ g/ml,4. 0 μ g/ml,3. 0 μ g/ml,2. 0 μ g/ ml、l. 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、0. 0625 μ g/ml，同時設陰性對照和空白 對照，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹； 加1/2000兔抗樹鼠句IgG多克隆抗體，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ；PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每 次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加1/8000酶標羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C溫育Ih ； PBST洗滌3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，棄去洗滌液在吸水紙上拍幹；加入TMB底物溶液， 100μ 1/孔，37°C避光溫育15min ；加入2M H2SO4終止反應，100 μ 1/孔，用酶標儀測定OD45tl值。
全文摘要
本發明公開一種樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA檢測方法，並將其應用於檢測樹鼩血漿中總IgG含量。以鼠抗樹鼩IgG單克隆抗體包被於酶標板作為捕獲抗體，結合待檢測樹鼩IgG；進而用兔抗樹鼩IgG多克隆抗體為二抗，以商品化的羊抗兔IgG-HRP為檢測抗體，通過抗體濃度等多因素條件優化，建立檢測樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA方法。所建立的方法應用於檢測健康樹鼩(30隻)血漿IgG水平，發現樹鼩血漿正常IgG水平為8.6-17.8g/L。樹鼩IgG的三抗體夾心ELISA檢測方法的建立，為樹鼩作為人類疾病實驗動物模型及相關疾病免疫機制的研究提供了必要工具。
文檔編號G01N33/558GK101923093SQ20101022470
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者馮悅, 劉麗, 夏雪山, 楊恆, 溫志剛, 魏大巧 申請人:昆明理工大學