一種替代檢測豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的新方法
2023-12-01 16:29:56 1
專利名稱：一種替代檢測豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的新方法
技術領域：
本發明涉及兔體熱反應測定方法，以替代家兔測定豬瘟兔化弱毒疫苗能否引起家兔產生熱反應是否合格的方法，克服了因家兔個體差異和環境因素導致結果的偏差。
背景技術：
常規的兔體熱反應測定方法是選取體重為1.5 3.0kg的健康家兔2隻，將豬瘟兔化弱毒疫苗150倍稀釋後從家兔耳緣靜脈接種到體內，每隻1ml，家兔接種後，上、下午各測體溫I次，48小時後，每隔6小時測體溫I次，定型熱的兔子潛伏期24 48h，體溫上升呈明顯曲線，超過常溫1°C以上，至少有3個溫次，並稽留18 36h ;當2隻家兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)、另I只兔呈輕熱反應(+)時，疫苗判為合格；此方法因家兔個體差異、環境因素、人為操作因素造成假陽性和假陰性，導致檢測結果的偏差，最終導致豬瘟兔化弱毒疫苗質量的不穩定。對國內最新相關研究的進展和成果進行檢索後結果表明:豬瘟兔化弱毒株除用上述方法進行兔體熱反應測定，還有實時螢光定量PCR，此方法有相關機構正在研究，但此方法成本高，對設備和人員素質要求較高，從研發到推廣尚需時日；而用免疫螢光檢測豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的新方法經國內範圍內的檢索查證，國內未見與本項目研究內容相同的成果公開報導。本發明構思是將已知兔體熱反應的豬瘟兔化弱毒疫苗接種PK-15細胞，培養5天後，用免疫螢光檢測豬瘟病毒的半數組織感染量(TCID5tl)，得到兔體熱反應和半數組織感染量之間的關係，用豬瘟病毒的TCID5tl替代家兔感染量，結果表明採用豬瘟病毒的TCID5tl替代家兔感染量，本檢測方法具有極強的穩定性與可重複性。
發明內容
本發明的目的在於:提供得的用免疫螢光檢測豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的新方法，替代了用家兔進行兔體熱反應的測定，確定豬瘟兔化弱毒疫苗是否合格，既節省時間又節約人力。本發明目的是這樣實現的:一種替代檢測豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的新方法，將豬瘟兔化弱毒株2倍梯度稀釋，然後接種於PK-15細胞，在37°C含5%的CO2培養箱中培養5日進行免疫螢光法的測定，Reed-Muench法計算病毒價，即為TCID5tl ；
其中病毒的稀釋:
將空白的96孔板中加入100 ill的無血清的MEM，然後將已知兔熱反應的豬瘟兔化弱毒株用移液器吸取100 u I加入96孔板的第I排，每個稀釋度做8重複，用移液器反覆吹打混勻，從第I排吸取100 U I加至第2排進行2倍梯度稀釋，如此稀釋至第11排，從第11排吸取IOOiU棄去，第12排為陰性對照；
其中PK-15細胞的製備:
將生長緻密的PK-15單層細胞用D-Hanks洗2次，加入濃度為0.25%的EDTA 胰酶消化細胞，消化完畢後，加入適量的培養基用吸管輕輕吹打，使細胞分散成單個細胞，取其中IOOMl,加900M1的D-Hanks液,混勻後滴於血細胞計數板上,按白細胞計數法,於低倍鏡下計數四角的4個大方格內的細胞，計數完畢後將細胞稀釋到約1.0X IO5個/ml，加入96孔板內，加細胞順序從第12排陰性開始,從使每孔細胞數約為1.0\104個,然後置於37°(:、5%的CO2培養箱中培養，培養5天後備用；
其中間接免疫螢光法的檢測:
1)細胞的固定，將培養5天的接種豬瘟兔化弱毒株的PK-15細胞板取出，將病毒液倒入廢棄桶中，每孔加入200 ill的PBST洗6次後，每孔加入100 ill的4%福馬林，固定10分鐘；其中PBST是0.lmol/L的PBS中加入0.05%的吐溫20配製所得；
2)一抗反應，固定完畢，每孔加入200 u I的PBST洗6次，以1%PBA 1000倍稀釋一抗，每孔加入50 u I的一抗，置於室溫反應I小時後，每孔再加入200 u I的PBST洗6次；其中1%PBA,即PBS中加入1%BSA配製所得；
3)二抗反應，以1%PBA1000倍稀釋FITC標記的兔抗豬的IgG 二抗，每孔加入50 yl的FITC標記的兔抗豬的IgG 二抗，置於室溫反應I小時，每孔加入200 u I的PBST洗4次；
4)毒價的判定，將PBST倒幹後，再加入50u 1PBST，並於倒立於螢光顯微鏡下，判讀豬瘟兔化弱毒株毒價，以Reed-Muench方式計算病毒毒價，以TCID5ciAil表示，測得兔體熱反應和TCID5tl之間的關係；
其中兔體熱反應和TCID5tl之間的關係的驗證:
將未知兔體熱反應和TCID5tl的豬瘟兔化弱毒株首先進行TCID5tl的測定，按照兔體熱反應和TCID5tl之間的關係將豬瘟兔化弱毒株稀釋至I個兔體熱反應，接種家兔，測定家兔的熱反應。所述方法避免了因家兔個體差異造成家兔定型熱的假陰性和假陽性，確保所檢測的豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的穩定性和可重複性。本發明的作用機理:豬瘟兔化弱毒株可在PK-15細胞上增殖，但不引起細胞病變，用常規的方法不能檢測病毒的TCID5tl，而本發明利用免疫螢光的方法測定豬瘟兔化弱毒株的TCID5tl，豬瘟兔化弱毒株作為抗原結合在細胞上，固定細胞，加入豬瘟兔化弱毒株的抗體與抗原結合，然後再與帶有螢光標記的二抗進行結合，最終使豬瘟兔化弱毒株的TCID5tl通過突光來判定。本發明方法，使用免疫螢光檢測豬瘟病毒兔化弱毒株進行兔體熱反應的測定，與常規的家兔測定豬痕兔化弱毒株的兔體熱反應相比，避免了因家兔個體差異、環境因素、人為操作因素造成假陽性和假陰性，導致檢測結果的偏差，最終導致豬瘟兔化弱毒疫苗質量的不穩定，同時節約了成本、時間和人力，彰顯技術進步。
具體實施例方式下面將結合實施例對發明作進一步說明。檢測流程:病毒稀釋、細胞製備、細胞計數、接種、免疫螢光的檢測、計算TCID5tl，得到TCID5tl和兔體熱反應之間的關係，檢測未知病毒的TCID5tl,驗證TCID5tl和兔體熱反應之間的關係步驟；其中病毒的稀釋:
將空白的96孔板中加入100 ill的無血清的MEM，然後將已知兔體熱反應的豬瘟兔化弱毒株用移液器吸取IOOiU加入96孔板的第I排(每個稀釋度做8重複)，用移液器反覆吹打混勻，從第I排吸取100 u I加至第2排，如此稀釋至第11排，第11排吸取100 Ul棄去，第12排為陰性對照。其中細胞的製備:
將生長緻密的PK-15單層細胞用D-Hanks洗2次，加入濃度為0.25%的EDTA 胰酶消化細胞，消化完畢後，加入適量的培養基用吸管輕輕吹打，使細胞分散成單個細胞；取其中100M1,加900M1的D-Hanks液,混勻後滴於血細胞計數板上,按白細胞計數法,於低倍鏡下計數四角的4個大方格內的細胞；計數完畢後將細胞稀釋到1.0X 105/ml，加入到上述稀釋病毒的96孔板內，使每孔細胞數約為1.0 X IO4個，然後置於37°C、5%的CO2培養箱中培養，培養5天後備用。其中免疫螢光的檢測:
I)細胞的固定，將培養約5天的接種豬瘟兔化弱毒株的PK-15細胞板取出，將病毒液倒入含有2%Na0H的廢液桶中，每孔加入200 U I的PBST洗6次後，每孔加入100 U I的4%的福馬林，固定10分鐘。其中PBST是0.lmol/L的PBS (磷酸緩衝液)中加入0.05%的吐溫20配製所得。2) 一抗反應，固定完畢後每孔加入200 ill的PST洗6次，以1%PBA1000倍稀釋一抗，每孔加入50 u I的一抗，置於室溫反應I小時後，每孔加入200 u I的PBST洗6次。其中1%PBA，即PBS中·加入1%BSA (牛血清白蛋白)配製所得。3)二抗反應，以1%PBA1000倍稀釋FITC標記的兔抗豬的IgG 二抗(避光)，每孔加入50 ill的FITC標記的兔抗豬的IgG 二抗，置於室溫反應I小時，每孔加入200 U I的PBST洗4次。4)毒價的判定，將PBST倒幹後，再加入50 iUPBST，並倒立於螢光顯微鏡下判讀豬瘟兔化弱毒株毒價，以Reed-Muench方式計算病毒毒價，以TCID5(l/ml表示，測得3個TCID5tl量相當於I個兔體感染。其中兔體熱反應和TCID5tl之間的關係的驗證:
將未知兔體熱反應和TCID5tl的豬瘟兔化弱毒株首先進行TCID5tl的測定，測定方法按上述方法進行，測得豬瘟兔化弱毒株的TCID5tl,按照兔體熱反應和TCID5tl之間的關係將豬瘟兔化弱毒株稀釋至I個兔體熱反應，接種家兔，測定家兔的熱反應。豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗標準:兔體熱反應的測定方法，用家兔效檢，按測得的豬瘟兔化弱毒株滅菌生理鹽水稀釋至9個、3個、I個TCID5ciAil，每個稀釋度耳靜脈注射體重
1.5或2.0或3.0kg家兔6隻，每隻兔耳靜脈注射1ml，家兔接種後，上下午各測體溫I次，48小時後，每隔6小時測體溫I次，根據體溫反應和攻毒結果進行綜合判定。①家兔接種兔化弱毒株後，體溫反應標準如下:
定型熱反應(++)潛伏期48或96小時，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個溫次超過常溫1°C以上,並稽留18或36小時,如稽留42小時以上,必須攻毒，攻毒後無反應可判為定型熱；
輕熱反應(+)潛伏期48或96小時，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個溫次超過常溫0.50C以上，並稽留12或36小時；
可疑反應(±)潛伏期48或96小時，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時；或潛伏期在24小時以上，不足48小時及超過96小時至120小時出現熱反應；
體溫反應呈二次高峰，有一次高峰符合定型熱反應(++)或輕熱反應(+)標準者，均須攻毒，攻毒後無反應時，該兔熱反應可判為定型熱或輕熱反應；
無反應(一)體溫正常。②結果判定:
注射病毒後，當2隻家兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)、另I只兔呈輕熱反應(+)時，稀釋的豬瘟兔化弱毒株判為可引起家兔熱反應，結果見下表。表三批豬瘟兔化弱毒株稀釋後進行兔體熱反應試驗結果
權利要求
1.一種替代檢測豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的新方法，其特徵在於:將豬瘟兔化弱毒株2倍梯度稀釋，然後接種於PK-15細胞，在37°C含5%的CO2培養箱中培養5日進行免疫螢光法的測定，Reed-Muench法計算病毒價，即為TCID5tl ； 其中病毒的稀釋: 將空白的96孔板中加入100 ill的無血清的MEM，然後將已知兔熱反應的豬瘟兔化弱毒株用移液器吸取100 u I加入96孔板的第I排，每個稀釋度做8重複，用移液器反覆吹打混勻，從第I排吸取100 U I加至第2排進行2倍梯度稀釋，如此稀釋至第11排，從第11排吸取IOOiU棄去，第12排為陰性對照； 其中PK-15細胞的製備: 將生長緻密的PK-15單層細胞用D-Hanks洗2次，加入濃度為0.25%的EDTA 胰酶消化細胞，消化完畢後，加入適量的培養基用吸管輕輕吹打，使細胞分散成單個細胞，取其中100M1,加900M1的D-Hanks液,混勻後滴於血細胞計數板上,按白細胞計數法,於低倍鏡下計數四角的4個大方格內的細胞，計數完畢後將細胞稀釋到約1.0X IO5個/ml，加入96孔板內，加細胞順序從第12排陰性開始,從使每孔細胞數約為1.0\104個,然後置於37°(:、5%的CO2培養箱中培養，培養5天後備用； 其中間接免疫螢光法的檢測: 1)細胞的固定，將培養5天的接種豬瘟兔化弱毒株的PK-15細胞板取出，將病毒液倒入廢棄桶中，每孔加入200 ill的PBST洗6次後，每孔加入100 ill的4%福馬林，固定10分鐘；其中PBST是0.lmol/L的PBS中加入0.05%的吐溫20配製所得； 2)一抗反應，固定完畢，每孔加入200 u I的PBST洗6次，以1%PBA 1000倍稀釋一抗，每孔加入50 u I的一抗，置於室溫反應I小時後，每孔再加入200 u I的PBST洗6次；其中1%PBA,即PBS中加入1%BSA配製所得； 3)二抗反應，以1%PBA1000倍稀釋FITC標記的兔抗豬的IgG 二抗，每孔加入50 yl的FITC標記的兔抗豬的IgG 二抗，置於室溫反應I小時，每孔加入200 u I的PBST洗4次； 4)毒價的判定，將PBST倒幹後，再加入50u 1PBST，並於倒立於螢光顯微鏡下，判讀豬瘟兔化弱毒株毒價，以Reed-Muench方式計算病毒毒價，以TCID5ciAil表示，測得兔體熱反應和TCID5tl之間的關係； 其中兔體熱反應和TCID5tl之間的關係的驗證: 將未知兔體熱反應和TCID5tl的豬瘟兔化弱毒株首先進行TCID5tl的測定，按照兔體熱反應和TCID5tl之間的關係將豬瘟兔化弱毒株稀釋至I個兔體熱反應，接種家兔，測定家兔的熱反應。
2.按照權利要求1所述方法，其特徵在於:該方法避免了因家兔個體差異造成家兔定型熱的假陰性和假陽性，確保所檢測的豬瘟兔化弱毒株的兔體熱反應的穩定性和可重複性。
全文摘要
本發明是一種用於豬瘟兔化弱毒測定兔體熱反應的新方法，即對已知兔體熱反應的豬瘟兔化弱毒半數組織感染量(TCID50)實施測定，將病毒在96孔板內2倍梯度稀釋，接種ST細胞，在37℃、5%的CO2培養箱中培養，用免疫螢光方法測定豬瘟兔化弱毒的TCID50，得到病毒TCID50與兔體熱反應之間的關係；然後再用免疫螢光方法測定未知兔體熱反應和TCID50的豬瘟兔化弱毒的TCID50，根據TCID50與兔體熱反應之間的關係將豬瘟兔化弱毒稀釋成9個TCID50，3個TCID50，1個TCID50，注射到家兔體內進行熱反應檢測，其中9個TCID50，3個TCID50可使家兔產生有效熱反應，與最初得到的3個TCID50可使家兔產生有效熱反應的關係一致。
文檔編號G01N33/569GK103105493SQ201310048618
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月7日 優先權日2013年2月7日
發明者李俊輝, 李延濤, 賀筍, 王尊寶, 劉宏 申請人:新疆天康畜牧生物技術股份有限公司