一種可調節腸道功能、預防結腸炎的發酵乳桿菌HY01及其用途的製作方法
2023-12-04 22:14:56
本發明涉及微生物技術領域，尤其涉及一種可調節腸道功能、預防結腸炎的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01及其用途。
背景技術：
炎症性腸病是病因和發病機制尚不清楚的慢性非特異性腸道疾病，結腸炎是其中一種，主要症狀包括便血、腹痛、腹瀉、消瘦、裡急後重等，嚴重影響患者生活，給患者帶來巨大痛苦與困擾。結腸炎在世界範圍內均有發生，與種族、地域和年齡有關，發病人群中男女性別無顯著差異。據統計，西方國家結腸炎發病率最高，發生率為1.2-20.3/10萬，流行率為7.6-245/10萬；歐洲地區的發生率為19.2-24.3/10萬，亞洲和中東地區的發生率為6.3/10萬。但是，由於我國人民生活水平的提高和飲食結構的改變，結腸炎的發病率呈逐年增加趨勢，已成為我國消化系統常見疾病之一。此外，數據顯示有5％-10％的慢性結腸炎患者轉變為結腸癌，而患有結腸炎25年以上的長期患者，約40％轉變為結腸癌，給人民健康和結腸炎患者帶來巨大的威脅。因此，探尋有效預防結腸炎的方法已迫在眉睫。
在臨床研究中，由於結腸炎發病機制的不確定性，使得臨床上治療結腸炎的藥物種類繁多，目前常用的藥物可歸納為以下幾種：氨基水楊酸類(主要代表藥物：5-氨基水楊酸)、免疫抑制劑類(主要代表藥物：硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤)、糖皮質激素類(主要代表藥物：二丙酸倍氯松、巰氫可的松)、抗生素、維生素和細胞因子拮抗劑。雖然這些藥物可在不同程度上預防結腸炎，但其作用機理有所不同，並且大多具有副作用、價格高的特點，不適用於普通患者。例如，長期使用5-氨基水楊酸會導致腹痛、噁心、溶血性貧血和腎功能衰竭；低劑量使用糖皮質激素時結腸炎復發率較高，而高劑量使用又會導致白內障和骨質疏鬆症；此外，使用抗生素能使腸道菌群生存環境的條件發生改變，不利於有益微生物的生存。除此之外，不少研究者還關注中藥製劑治療結腸炎的效果，如黃連煎劑、烏梅丸、參苓白朮散、葛根芩連湯、四白湯和四神丸等，雖然表現出對結腸炎的預防效果，但是中藥製劑具有組成複雜且含有不明成分的特點。因此，尋找安全、有效且經濟的治療方法具有重要意義。
微生態製劑因其具有安全、有效且經濟的特點而受到國內外學者的重視，益生菌是微生態製劑中的一種，在保護腸道中發揮重要作用，cn1796540a公開了具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌及其用途，用於製備食品組合物或藥物組合物，殺死或抑制幽門螺旋桿菌或大腸桿菌，治療由其引起的各種疾病。cn102174450a公開了一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌及其用途，用於製備藥物組合物、發酵劑、動物飼料添加劑和保健品中來預防或減輕幽門螺桿菌的感染。目前認為其作用機理為：益生菌進入腸道後，通過調節腸道菌群，改善腸道免疫屏障和促進適應性與固有免疫反應途徑來維持機體腸道內穩態的平衡，從而抑制腸道內有害菌的生長和減少毒素的產生；益生菌產生的代謝產物(乳酸)使腸道內ph值降低，進而具有一定抗菌作用；此外，益生菌還能與胃腸道上皮細胞結合，從而抑制腸道內致病菌的黏附與定植等功能。因此，篩選具有預防結腸炎功能的乳酸菌對改善腸道功能的研究具有重要意義。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明提供了一種可調節腸道功能、預防結腸炎的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01及其用途，主要提供一種可調節腸道功能、預防結腸炎的發酵乳桿菌菌株和提供一種所述發酵乳桿菌在發酵食品中的用途。
本發明提供的一種可調節腸道功能、預防結腸炎的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01於2015年12月29日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccm2015792。
發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01從自然發酵犛牛酸乳中篩選出，利用形態特徵、培養性狀和生理生化特徵等微生物學特性對該乳酸桿菌lactobacillusfermentumhy01鑑定為發酵乳桿菌，該菌株已於2015年12月29日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccm2015792。
所述發酵乳桿菌hy01的形態學特徵具體為：
菌體特徵：呈革蘭氏染色陽性，細胞杆狀，無芽孢，兩端圓形。
菌落特徵：在mrs固體培養基上形成明顯的菌落，圓形，邊緣整齊，乳白色，菌落凸起，表面溼潤光滑，不產生色素。
所述發酵乳桿菌hy01體內耐受特徵為：
發酵乳桿菌的菌株耐受能力較強，在ph3.0的人工胃液中處理3h後的存活率為103.73±8.60％；在0.3％膽鹽濃度下的生長效率為無膽鹽培養的21.62±0.86％。
所述發酵乳桿菌hy01在製備調節腸道功能或/和預防結腸炎的食品中的應用。
所述發酵乳桿菌來源於傳統發酵食品，屬公認安全(generallyrecognizedassafe,gras)菌種，用於發酵食品中；
所述發酵食品為含有發酵乳桿菌的乳酸菌奶飲料、乳粉、膠囊製品或發酵乳中的一種或多種。
利用所述發酵乳桿菌hy01製備乳酸菌奶飲料的方法，將保存的發酵乳桿菌hy01作為發酵工作劑加入經殺菌的原料乳中，培養至發酵乳桿菌hy01濃度達到106cfu/ml以上，保存，得乳酸菌奶飲料；
所述原料乳選自脫脂奶、鮮奶或復原奶。
進一步，所述乳酸菌奶飲料是按照下述步驟製備得到的：
所述發酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍乾燥菌粉的形式保存備用；
利用所述發酵乳桿菌的原始菌種製備發酵乳桿菌工作發酵劑；
原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫熱殺菌2s，冷卻到4℃，加入所述發酵乳桿菌工作發酵劑，使其濃度達到106cfu/ml以上，在4℃冷藏保存。
利用所述發酵乳桿菌hy01製備乳粉的方法，將保存的發酵乳桿菌hy01作為發酵工作劑加入經殺菌的原料乳中，發酵獲得發酵乳桿菌發酵乳，然後將獲得的發酵乳桿菌發酵乳與經殺菌的原料乳按照體積比為1:3混合，進行均質，真空濃縮、噴霧乾燥得到乳粉。
進一步，所述乳粉是按照下述步驟製備得到的：
所述發酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍乾燥菌粉的形式保存備用；
利用所述發酵乳桿菌的原始菌種製備發酵乳桿菌工作發酵劑；
原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫熱殺菌2s，然後冷卻到37℃，再以原料乳體積的4％接菌量接種所述的發酵乳桿菌工作發酵劑，37℃下發酵16h，得到發酵乳桿菌發酵乳；所述發酵乳桿菌發酵乳和滅菌後的原料乳按照1∶3(v∶v)配比加入，進行均質，真空濃縮、噴霧乾燥得到含發酵乳桿菌的乳粉。
利用所述發酵乳桿菌hy01製備膠囊製品的方法，將保存的發酵乳桿菌hy01作為發酵工作劑加入經殺菌的原料乳中，發酵獲得發酵乳桿菌發酵乳，然後將獲得的發酵乳桿菌發酵乳與經殺菌的原料乳按照體積比為1:3混合，進行均質，真空濃縮、噴霧乾燥得到乳粉，將乳粉裝到膠囊中製成膠囊製品。
進一步，所述膠囊製品是按照下述步驟製備得到的：
所述發酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍乾燥菌粉的形式保存備用；
利用所述發酵乳桿菌的原始菌種製備發酵乳桿菌工作發酵劑；
將原料乳在140℃高溫熱殺菌2s，然後冷卻至37℃，以原料乳體積的4％接菌量接種所述發酵乳桿菌工作發酵劑，在37℃下發酵16h，得到發酵乳桿菌發酵乳；將所述發酵乳桿菌發酵乳和滅菌後的原料乳按照以1∶3(v∶v))配比加入，均質，真空濃縮、噴霧乾燥處理後得到乳粉，將得到含有發酵乳桿菌的膠囊製品。
利用所述發酵乳桿菌hy01製備發酵乳的方法，將保存的發酵乳桿菌hy01作為發酵工作劑按體積百分比為3～5％加入經殺菌的原料乳中，在加入相當於原料乳體積百分比為3～5％的可共生發酵劑，混勻後在發酵至滴定酸度以乳酸計0.6-0.7％，然後冷卻至4℃，再進行冷藏保存得發酵乳。
進一步，所述發酵乳是按照下述步驟製備得到的：
所述發酵乳桿菌的原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍乾燥菌粉的形式保存備用；
利用所述發酵乳桿菌的原始菌種製備發酵乳桿菌工作發酵劑；
原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫熱殺菌2s，然後冷卻到37℃，再按照3-5％(體積)加入發酵乳桿菌工作發酵劑，再加入3-5％(體積)可共生的用於製備發酵乳製品的發酵劑，混勻後在37℃下混菌發酵至滴定酸度以乳酸計0.6-0.7％，然後冷卻至4℃，再進行冷藏保存得到含有發酵乳桿菌的發酵乳。
進一步，所述可共生發酵劑保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。
本發明中，所述發酵乳桿菌工作發酵劑的製備方法包括：
將所述發酵乳桿菌的原始菌種接種於12％(重量)的脫脂乳中，110℃滅菌10min，在37℃條件下培養14-16h至凝乳，連續培養活化兩代，用作母發酵劑；將所述母發酵劑按3-5％(體積)接種於滅菌乳中，培養14-16h至凝乳，至該凝乳中的活菌數約109cfu/ml，得到工作發酵劑，可以直接將這種工作發酵劑添加到食品中，或者與可共生的製備發酵乳的商業發酵劑如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌一起使用製備發酵乳；或
將所述發酵乳桿菌的原始菌種接種於mrs液體培養基中，在37℃條件下培養12-16h進行活化，連續活化兩代，然後將活化培養物按2-4％(體積)接種於mrs培養基中，培養16-18h，在4℃條件下3000r/min離心15min，去除上清夜，得到細胞沉澱，將沉澱用無菌脫脂乳製成懸浮液，得到工作發酵劑。
本發明中，加熱殺菌是例如使用上海沃迪自動化裝備股份有限公司銷售的tw10d1000型管式殺菌機進行的。
高溫熱殺菌是例如使用北京勇創嘉業機械設備有限公司銷售的yc-104型板式超高溫殺菌機進行的。
均質是例如使用常州市均質機械有限公司銷售的gjb500-40小型均質機進行的。
濃縮是例如使用上海偉宙輕工機械有限公司銷售的真空濃縮鍋進行的。
噴霧乾燥是例如使用上海沃迪科技有限公司銷售的實驗型噴霧乾燥機進行的。
商品發酵劑優選的是保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。
在本發明的意義上，所述的原料乳選自脫脂奶、鮮奶、復原奶的一種或多種。
本發明實施例的技術方案帶來的有益效果如下：
本發明公開了一種分離自四川省紅原縣牧民家自然發酵犛牛酸乳中的可調節腸道功能、預防結腸炎的發酵乳桿菌和以該菌株為發酵劑或添加的發酵乳、健康食品以及動物保健製品中的應用，發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01菌株耐受能力較強，在ph3.0的人工胃液中處理3h後的存活率為103.73±8.60％；在0.3％膽鹽濃度下的生長效率為無膽鹽培養的21.62±0.86。這表明發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01在人的腸道內能夠良好生長。小鼠體內試驗表明，發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01能夠緩解結腸炎小鼠結腸縮短、結腸水腫，結腸炎性細胞浸潤和黏膜損傷等。此外，在血清水平上，發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01能夠下調促炎因子ifn-γ，il-12、tnf-α和il-6的水平。在蛋白水平上，發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01還能提高iκbα的水平，降低nf-κbp65、inos和cox-2的水平，具有預防結腸炎的作用。
附圖說明
為了更清楚的說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見的，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01菌落形態；
圖2發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01的菌體形態(l000×)；
圖3不同組小鼠結腸長度與重量的變化(a：不同組小鼠結腸照片；b：不同組小鼠結腸長度；c：不同組小鼠結腸重量)；
圖4不同組小鼠結腸病理學觀察(a：正常組；b：模型組；c：低濃度組；d：高濃度組)；
圖5不同組小鼠血清中炎症相關因子水平(a：inf-γ因子水平；b：il-12因子水平；c：tnf-α因子水平；d：il-6因子水平)；
圖6不同組小鼠結腸中炎症相關蛋白水平(a：iκbα蛋白水平；b：nf-κbp65蛋白水平；c：inos蛋白水平；d：cox-2蛋白水平)。
生物材料保藏
本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01於2015年12月29日保藏於中國典型培養物保藏中心，編號為cctccm2015792。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然所描述的實施例僅是本發明的一部分實施例，不是全部的實施例，基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有付出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例1
發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01的分離、純化及初步鑑定，該實施例按照下述步驟進行：
(1)lactobacillusfermentumhy01的分離、純化
以無菌操作吸取樣品(四川省紅原縣牧民家自然發酵犛牛酸乳)1ml加入至9ml滅菌生理鹽水混合作成1∶10的均勻稀釋液，並繼續作一定比例的稀釋。選擇合適梯度的稀釋液，用無菌槍頭各吸取100μl分別塗布到mrs固體平板培養基中，37℃培養48h，觀察記錄菌落形態，如圖1所示。用接種環從平板表面挑取不同菌落接種於mrs液體培養基中，置37℃，100r/min搖床培養18h；重複以上步驟連續活化2代後進行塗片革蘭氏染色鏡檢，如圖2所示，確定為g+菌的繼續活化，直至得到純菌落(鏡檢無雜菌)並保存，具體操作參照《微生物學實驗技術》。
實驗結果顯示，從四川紅原的十二份樣品中共分離出乳酸菌43株。
(2)lactobacillusfermentumhy01的初步鑑定
革蘭氏染色：取典型菌落塗片，進行革蘭氏染色，在微生物顯微鏡油鏡下觀察菌體形態及其排列方式。挑取視野清晰、形態典型的菌株，進行拍照。結果表明，從樣品中分離純化出的菌株均為革蘭氏染色陽性。
實施例2
lactobacillusfermentumhy01的體外篩選
乳酸菌是正常腸道菌的一部分，作為益生菌的首要條件之一，是能在胃和小腸前段存活，被篩選的菌株應具有足夠的耐酸性和酸性環境下生長發育的特性，有必要對發酵乳桿菌lactobacillusfermentumhy01的耐酸性進行分析。
(1)益生菌耐受ph3.0人工胃液的篩選
人工胃液的配製：nacl0.2％、胃蛋白酶0.35％、用1m的hcl調整ph值為3.0後，在無菌操作臺中用真空泵抽濾除菌後備用。
益生菌對人工胃液耐受性的測定：取5ml已經活化好的菌株培養液，在無菌操作臺中倒入已滅菌10ml離心管中，經3000r/min離心10min收集菌體，加入5ml滅菌生理鹽水混勻製成菌懸液，取1ml菌懸液與9mlph3.0的人工胃液混合，搖勻，置於恆溫振蕩器中培養(37℃，100r/min)，並分別在0h和3h取樣，用mrs瓊脂培養基塗布37℃培養48h。用平板計數法測定活菌數，計算其存活率(％)：存活率(％)＝3h的活菌數/0h的活菌數×100％，結果如表1所示。
(2)益生菌耐受不同濃度膽鹽的測定
將活化好的菌種5ml按2％的接種量(100μl)用移液槍分別接種於含0.0％牛膽鹽(即空白)0.05％，0.1％，0.2％和0.3％牛膽鹽(w/v)的mrs-thio培養基(mrs培養基中加0.2％的巰基乙酸鈉)。在恆溫振蕩器中37℃培養24h後，以空白培養基為對照(未接種的mrs-thio培養基)，分別測定上述不同濃度培養基的od值，計算菌株對膽鹽的耐受力。膽鹽耐受力＝含膽鹽的培養基的od值/空白培養基的od值×100％，結果如表1所示。
表1、lactobacillusfermentumhy01的篩選結果
篩選結果表明，lactobacillusfermentumhy01菌株能耐受ph3.0的環境，且存活率為103.73±8.60％。
通過胃後存活的菌體將與小腸中的膽鹽接觸，本實驗把乳酸菌對膽鹽的抵抗能力用於作為潛在益生菌的一個選擇標準。耐酸性較好的lactobacillusfermentumhy01隨著膽鹽濃度的增加，生長效率逐漸降低，在0.3％膽鹽濃度下的生長效率仍保持在20％以上。
通過以上實驗我們篩選出了耐酸性、耐膽鹽能力較好的lactobacillusfermentumhy01，該菌株已於2015年12月29日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號cctccm2015792。
實施例3
dss(葡聚糖硫酸鈉，dextransulfatesodium)誘導結腸炎實驗：將40隻昆明小鼠隨機分成4組，每組10隻，雌雄各半，飼養一周後開始實驗，實驗周期為五周。每組小鼠飼養情況如下：實驗期間，飼養在不鏽鋼籠中，室溫保持25±2℃，相對溼度50±10％，12h明暗輪換，各組小鼠攝食自由。此外，正常組小鼠每天自由飲水(不含dss)，直到實驗結束。模型組小鼠第一、二、四周自由飲水(不含dss)，第三周自由飲用含2％dss的水，第五周自由飲用含4％dss的水。低濃度組(109cfu/kg·bw)和高濃度組(1010cfu/kg·bw)實驗期間每天灌胃相應濃度的lactobacillusfermentumhy01菌液，並且均在第三周自由飲用含2％dss的水，第五周自由飲用含4％dss的水，各濃度菌體灌胃量根據小鼠體重計算。脫頸椎處死小鼠前24h禁水禁食。處死小鼠後，記錄小鼠結腸的長度與重量，結果如圖3所示。結果表明，高濃度組能夠顯著提高dss誘導結腸炎的結腸長度，同時結腸重量與正常組差異不顯著。
實施例4
小鼠結腸病理學觀察：小鼠脫頸椎處死後，取結腸用10％福馬林溶液浸泡，將其固定，做常規he切片。
實驗期內各組小鼠結腸病理學觀察如圖4所示。結果顯示，正常組結腸黏膜、隱窩完整，固有層無炎性細胞浸潤現象，杯狀細胞連續分布；而模型組結腸黏膜損傷嚴重、杯狀細胞減少、固有層細胞浸潤現象嚴重，並伴有腸壁增厚。而經lactobacillusfermentumhy01處理的結腸炎小鼠結腸黏膜損傷和炎性細胞浸潤現象均得到緩解，說明lactobacillusfermentumhy01處理能夠改善dss導致的結腸損傷，對預防結腸炎的發生具有促進作用。
實施例5
小鼠血清中各因子水平的測定：取0.2ml小鼠動脈血，在4℃，3000r/min離心10min，取上層血清。按照il-6、il-12、tnf-α和inf-γ測試劑盒說明書的方法測定血清中上述因子水平。
實驗期內各小組小鼠血清中各因子水平如圖5所示。
相對於結腸炎對照組，lactobacillusfermentumhy01高低組均能不同程度的下調血清中促炎因子il-6、il-12、tnf-α和inf-γ的水平，所以lactobacillusfermentumhy01能夠下調炎症因子，對預防炎症加重具有促進作用。
實施例6
小鼠結腸中炎症相關蛋白的表達。
取結腸組織100mg加入裝有1ml高效ripa裂解液的離心管中勻漿，充分勻漿後4℃，12000r/min離心5min，取其上清用bca法分析其蛋白含量。經sds-page凝膠電泳後，將蛋白轉移到0.45μmpvdf，並用5％bsa室溫封閉2h。然後一抗孵育過夜(4℃)，tbst洗膜5次，每次5min。二抗室溫孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min。最後用eclplus化學發光顯影。
實驗期內各組小鼠結腸中炎症相關蛋白的表達如圖6所示。
iκbα是iκb蛋白家族中的一員，iκb蛋白具有抑制細胞內無活性nf-κb的作用，在外界條件作用下，iκb表達的蛋白被磷酸化和被泛素和蛋白酶降解後，使得抑制作用降低，從而激活並釋放nf-κb。研究發現，被激活nf-κb在潰瘍性結腸炎的發病機制中扮演重要角色，能夠刺激大量促炎因子的分泌，使腸道炎症加重，並且nf-κb具有調節調控cox-2和inos的轉錄因子，炎症發生時，二者蛋白水平提高。實驗中，lactobacillusfermentumhy01處理結果表明，其能有效防止iκbα的降解，使nf-κb從而抑制nf-κbp65蛋白的磷酸化和inos和cox-2蛋白水平的提高，具有預防結腸炎的作用，其中，高濃度處理對預防dss誘導小鼠結腸炎的效果最佳。
應用實施例1：利用發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01製造乳酸菌奶飲料
首先，所述發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01原始菌種在溫度-80℃下以磁珠形式保存，或者在溫度4℃下以冷凍乾燥菌粉的形式保存備用。
然後，可以採用兩種方法製備本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發酵劑：
第一種方法是將上述發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01原始菌種接種於12％(重量)在110℃滅菌10min的脫脂乳中，在37℃條件下培養14-16h至凝乳，連續培養活化兩代，用作母發酵劑；將所述母發酵劑按3-5％(體積)接種於滅菌乳中，培養14-16h至凝乳，此時該凝乳中的活菌數約109cfu/ml，得到所述的工作發酵劑，可以直接將這種工作發酵劑添加到食品中，或者與可共生的製備發酵乳的商業發酵劑如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌一起使用製備發酵乳。
第二種方法是將上述發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01原始菌種接種於mrs液體培養基中，在37℃條件下培養12-16h進行活化，連續活化兩代，然後將活化培養物按2-4％(體積)接種於mrs培養基中，培養16-18h，在4℃條件下3000r/min離心15min，去除上清夜，得到細胞沉澱，將沉澱用一定量的無菌脫脂乳製成懸浮液，得到工作發酵劑備用。
然後，原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫熱殺菌2s，然後冷卻到4℃，再加入前面所述的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發酵劑，使其濃度達到106cfu/ml以上，在4℃冷藏保存即得到含發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01活菌的乳酸菌奶飲料。
在本發明中，所述的mrs液體培養基是本技術領域的技術人員熟知的，是索萊寶公司銷售的用於乳桿菌培養的培養基。
所述的加熱殺菌是例如使用上海沃迪自動化裝備股份有限公司銷售的tw10d1000型管式殺菌機進行的。
所述的高溫熱殺菌是例如使用北京勇創嘉業機械設備有限公司銷售的yc-104型板式超高溫殺菌機進行的。
應用實施例2：利用發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01製造乳粉
按照上述乳酸菌奶飲料的製備方法製備，只是原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫熱殺菌2s，然後冷卻到37℃，再以原料乳體積的4％接菌量接種前面所述的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發酵劑，再在37℃下發酵16h，得到發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發酵乳；然後所述的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發酵乳按照1∶3(v∶v)加到上述滅菌原料乳中，進行均質，真空濃縮、噴霧乾燥得到含發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01的乳粉。
所述的均質是例如使用常州市均質機械有限公司銷售的gjb500-40小型均質機進行的。
所述的濃縮是例如使用上海偉宙輕工機械有限公司銷售的真空濃縮鍋進行的。
所述的噴霧乾燥是例如使用上海沃迪科技有限公司銷售的實驗型噴霧乾燥機進行的。
應用實施例3：利用發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01製造膠囊製品
將原料乳在140℃高溫熱殺菌2s，然後冷卻至37℃，以原料乳體積的4％接菌量接種本發明的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發酵劑，在37℃下發酵16h，得到發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發酵乳。將發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01發酵乳以1∶3(v∶v)加入滅菌後的原料乳中均質，經真空濃縮、噴霧乾燥處理後得到乳粉，將得到的乳粉裝到膠囊中製成膠囊製品。
應用實施例4：利用發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01製備發酵乳
按照上述乳酸菌奶飲料的製備方法製備，只是原料乳在95℃下加熱殺菌20min或在140℃下高溫熱殺菌2s，然後冷卻到37℃，再按照3-5％(體積)加入前面所述的發酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)hy01工作發酵劑，再加入3-5％(體積)可共生的製備發酵乳商品發酵劑，混勻後在37℃下混菌發酵至滴定酸度以乳酸計0.6-0.7％，然後冷卻至4℃，再進行冷藏保存得到所述的發酵乳。
所述的商品發酵劑優選的是保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。
在本發明的意義上，所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復原奶的原料乳。
以上所述，僅為本發明的具體實施例，但本發明的特徵並不局限於此，任何熟悉該項技術的人在本發明領域內，可輕易想到的變化或修飾，都應涵蓋在以下本發明的申請專利範圍中。