一種適用於化妝品的魚鱗Ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法與流程

2023-12-06 10:47:11 2

本發明涉及到一種適用於化妝品的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法，屬於生物提取技術與化妝品領域。

背景技術：

膠原蛋白(collagen)是一種天然蛋白質，廣泛存在於動物的皮膚、骨、軟骨、牙齒、肌腱韌帶和血管中，是結締組織極重要的結構蛋白質，起著支撐器官、保護肌體的功能，具有很強的生物活性和生物功能。膠原蛋白肽(collagenpeptide)是膠原蛋白(collagen)的水解物，是多肽或小肽混合物。無論在食品保健、生物醫學還是在化妝品等行業中，膠原蛋白肽具有廣泛的應用和巨大的市場價值。在食品應用方面，膠原蛋白肽不僅可作為功能性食品，而且可以作為肉製品改良劑，還可以作為食品包裝材料——人工腸衣和可食性蛋白膜。

特別是在化妝品方面，由於膠原蛋白肽與人皮膚膠原蛋白的結構相似，相容性好，可以進入到人的皮膚深層，對皮膚有很好的營養作用，並且膠原蛋白肽中存在具有大量羧基和羥基的羥脯氨酸和羥賴氨酸等胺基酸，以及大量的甘氨酸等天然保溼因子，能提高組織細胞的貯水能力，對皮膚有很好的保溼效果，很多種膠原蛋白肽與皮膚細胞的生長、分裂、增殖、遷移以及分化有關，能夠給皮膚提供養分，延緩皮膚的衰老，促進皮膚的創面修復，膠原蛋白肽溶液還有較強的抗輻射作用，因而廣泛應用於化妝品行業。雖然目前市場中銷售的許多高檔化妝品中很多都含有膠原蛋白肽，但存在著膠原蛋白肽分子量分布不集中，產品穩定性較差，保溼能力有限等問題，這些問題都與膠原蛋白肽的製備工藝有關，急需解決。

目前，通過酶法提取已經是相當熱門的一類蛋白肽製備方法。相對於酸法和鹼法，酶法提取不僅可以避免酸、鹼水解法所產生的產品分子量分布廣泛和均勻度差的問題，還可以解決因提取過程中消耗大量的酸或鹼，導致提取產品成分非常複雜、後續純化處理困難的麻煩。

近年來的文獻表明：蛋白或肽的分子量分布與功能活性(保溼能力、乳化能力、感覺味道和抗氧化活性等)，理化性質(吸收率、抗原性和金屬結合能力)等性質之間存在著一定的關係，所以，特定分子量片段的蛋白肽具有其他分子量片段的蛋白肽難於比擬的功能活性與理化性質；而蛋白、肽的分子量分布的穩定性也在一定程度上決定其功能活性、理化性質的穩定性。

膠原蛋白肽可以作為化妝品核心原料，需要先溶於水，所以膠原蛋白肽溶液的穩定性對於其化妝品最終產品的穩定性尤為重要。

還有由於皮膚不像胃腸道，它缺乏相應的蛋白酶和微生物菌群。膠原蛋白肽接觸或進入皮膚中，基本上無法降解，所以，膠原蛋白肽的分子量大小直接決定了膠原蛋白肽的皮膚滲透性強弱和對皮膚的保溼作用大小。而特定分子量片段的膠原蛋白肽所形成的特殊微球結構也對其保溼能力產生影響。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明的技術解決方案是：

一種適用於化妝品的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法，包括以下步驟：

(1)預處理

將魚鱗投入反應釜中，加入魚鱗重量2—10倍的鹼溶液，攪拌0分鐘—1小時(優選10-30min)，除掉魚鱗的脂肪和其他雜質，用水洗淨，加入魚鱗重量2—10倍的酸溶液，攪拌15分鐘—1小時，再用去離子水洗淨，其中鹼溶液的質量體積濃度為1—4％，酸溶液的質量體積濃度為3—8％；

(2)酶解提取

利用合適的蛋白酶定向酶解魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽；將經過預處理並洗淨的魚鱗置於反應釜中，加入魚鱗重量的0.5～3倍的去離子水，加入濃鹼液調節ph值6～8之間，加入魚鱗投料重量0.5％～10％的蛋白酶，反應溫度為45～65℃，反應15分鐘～1小時；酶解反應結束後升溫至70～80℃，保溫0～30分鐘滅酶，得到魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解濃縮液，提取率≥97％；

(3)分離純化

連連續流離心結合相對分子質量為10kda～5kda的納濾膜去除魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解濃縮液中的固體殘渣和大分子雜質，所得清液再用相對分子質量為1kda～200da的納濾膜去除小分子雜質和無機鹽，並進一步濃縮得到含量≥95％，分子量主要分布在500～1100da之間的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液；

(4)快速乾燥和滅菌封裝

利用噴霧乾燥快速乾燥蛋白肽溶液，得到顆粒尺寸範圍集中在1～10μm之間的微米級魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球。再通過光輻射進行快速滅菌，最後進行無菌分裝。

所述步驟(1)原料預處理所使用的魚鱗可以是海洋魚類魚鱗或已經被證明膠原蛋白類型為ⅰ型的淡水魚類魚鱗。

所述步驟(1)預處理和所述步驟(2)加入濃鹼液調節ph值所使用的鹼為碳酸氫鈉(鉀)或氫氧化鈉(鉀)；酸為鹽酸或硝酸。

所述步驟(2)中所使用的蛋白酶為木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶中的一種或兩種組合。

所述步驟(2)中酶解反應結束後升溫至70～80℃進行升溫滅酶，如果直接進行連續流離心協同膜分離技術分離純化魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽，則升溫滅酶可以不做。

所述步驟(3)中所使用的相對分子質量為10kda～5kda的納濾膜流速為5～14立方米/小時，膜壓力為0.552-0.931mpa，溫度為20～50℃；所使用的相對分子質量為1kda～200da的納濾膜流速為5～14立方米/小時，膜壓力為0.483～2.758mpa，溫度為20～50℃。

所述步驟(3)中所使用的離心機為10000～15000rpm的連續流離心機。

所述步驟(4)中所使用的噴霧乾燥的進風溫度為120～180℃、出風溫度為70～95℃。

所述步驟(4)中所得到的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球的顆粒尺寸範圍集中在1～10μm之間，屬於微米級別，且微球內部為中空結構。

所述預處理步驟前，先對魚鱗進行清洗以除去顆粒雜質。

所述步驟(4)中所使用的光輻射可使用紫外光輻射、γ-射線或電子束輻射，輻射劑量為0.01～40kgy，輻射時間為1～60分鐘。

本發明與現有技術不同之處在於：魚鱗主要是由ⅰ型膠原蛋白和鈣鹽——羥基磷灰石組成的，所以定向酶解魚鱗ⅰ型膠原蛋白所得到的膠原蛋白肽，即魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽。而相關實驗表明，酸是鈣鹽的優良去除劑；而酶是包括ⅰ型膠原蛋白在內的所有蛋白的專屬消解劑。所以，在酶法提取魚鱗膠原蛋白肽的過程中，只要抓住以上要點，在預處理過程中去除足夠的魚鱗鈣鹽，保證魚鱗中的ⅰ型膠原蛋白完全暴露在蛋白酶之下，就能實現提取、酶解、溶解三位一體，一步將預處理後的魚鱗ⅰ型膠原蛋白固體直接溶解成為魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽液體，提取率接近於100％。同時，由於酶解反應開始時，加入少量的水僅起到魚鱗間的潤滑和導熱作用；酶解反應發生後，魚鱗ⅰ型膠原蛋白固體直接和蛋白酶接觸反應，保證整個酶解反應可以在1小時內完成，並起到濃縮的作用，形成高濃度的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽液體，減少後端分離純化步驟的時間消耗。由此更能滿足產業化放大和大規模生產的要求。

本發明立足海洋生物資源高值化，根據人體皮膚的實際需要，以我國來源豐富的水產加工產業下腳料——魚鱗作為膠原蛋白肽的原料，完全採用生物酶解技術，開發一步到位快速製備特定分子量片段(分子量主要分布在500～1100da之間)，特殊微球結構的化妝品用魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的工藝，製備的化妝品用魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽構型明確、分子量分布集中穩定，所形成的微球尺寸均勻、結構中空利於儲水，並與人體皮膚具備高度親和力。根據行業標準qb/t4256-2011《化妝品保溼功效評價指南》，經人體試驗表明：添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水，能夠有效提升人體皮膚角質層的水分，並有效改善化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水自身的保溼能力；不僅如此，添加了本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的精華液，與國際知名品牌的明星產品：蘭蔻小黑瓶精華肌底液和雅詩蘭黛特潤修護肌透精華露(第六代小棕瓶)對比，在保溼功效方面均顯示出相當的優勢。經過成年女性受試者在正常情況下連續8周的人體試用試驗，結果表明：添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝品具有保溼和改善皮膚水分流失，以及改善面部皮膚和眼部皮膚粗糙度的功效。本發明能夠實現高效率、高產量、高環保的「綠色」生產。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1.本發明選擇主要含有ⅰ型膠原蛋白的魚鱗作為原料，保證了酶提得到的膠原蛋白肽是源自單一構型蛋白的ⅰ型膠原蛋白肽。

2.本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽製備方法完全使用生物酶定向酶解技術，符合蛋白酶解機制，在酶解提取開始時，僅加入少量的水起到魚鱗間的潤滑和導熱作用；酶解提取發生後，魚鱗ⅰ型膠原蛋白固體直接和蛋白酶接觸反應，保證酶解提取過程可以在1小時內完成，並起到濃縮的作用，形成高濃度的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽液體，實現提取、酶解、溶解三位一體，一步到位將預處理後魚鱗ⅰ型膠原蛋白固體直接溶解成為魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽濃縮液，提取率≥97％，接近於100％；一方面，可以有效杜絕化學法中強酸、強鹼和高熱，帶來的環境汙染和巨大的能源消耗，顯著降低了生產成本，同時不產生任何有毒有害物質。另一方面，可以減少後端分離純化步驟的時間消耗。由此，更能滿足產業化放大和大規模生產的要求。

3.本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽規模化生產周期基本上可以控制在24小時內完成，更為簡短務實；流程整體更為簡單可行，高效節能，使用同樣的設備，單位時間的效率可以提高5～15倍，更為適合大規模生產。

4.本發明方法生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽含量高(≥95％)，結構為特殊的微球結構，顆粒均勻，尺寸位於1～10μm之間的微米級別，微球內部為中空結構，更有利於吸收存儲大量的水分，並避免水分流失。。

5.本發明方法生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽具有特定的分子量片段，分子量主要分布在500～1100da之間，更為集中。既可以保證產品的穩定性，膠原蛋白肽溶液穩定性試驗證明：對比國內外14種膠原蛋白肽，魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的穩定性良好，在室溫條件下放置3周，分子量基本保持不變；又可以更有效地透過皮膚，更好地補充皮膚水分。

6.本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽與人體皮膚具備高度親和力，根據行業標準qb/t4256-2011《化妝品保溼功效評價指南》，經8小時人體試驗表明：添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水，不僅能夠有效提升人體皮膚角質層的水分，還能有效改善化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水自身的保溼能力。與國內外有代表性的5種膠原蛋白肽產品(分別為：法國羅塞洛、德國雅名、日本nippi(兩種)和中國海南華研)相比，本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽對皮膚的保溼性具有較大的優勢。

7.根據行業標準qb/t4256-2011《化妝品保溼功效評價指南》，經8小時人體試驗表明：添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的精華液，與國際知名品牌的明星產品：蘭蔻小黑瓶精華肌底液和雅詩蘭黛特潤修護肌透精華露(第六代小棕瓶)對比，在保溼功效方面均顯示出相當的優勢。這不僅體現添加本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝品具有良好的皮膚親和力，能夠較好地提升和保持人體皮膚水分；而且由於保溼性是一切化妝品的基礎，本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽擁有的優異的保溼性能和與生具備的良好的皮膚親和力，預示著添加本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝品在抗衰老功效方面也會有不遜於甚至超越國際知名品牌的類似產品的表現。

8.以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，在正常情況下連續8周的人體試用試驗，評價待檢樣品的人體安全性及功效。試驗結果表明：受試物對於人體皮膚的安全性良好；試用8周後，面部皮膚角質層含水量增加，水分流失速率降低，皮膚粗糙度rz降低，且具有顯著差異性，提示該受試物具有保溼、改善皮膚水分流失和改善皮膚粗糙度的功效；試用8周後，眼周皮膚粗糙度rz、ra均顯著降低，提示該受試物具有改善眼部皮膚粗糙度的功效。本試驗得到的有關功效的所有數據結果均是有統計學差異的。需要提別說明的是，連續8周的人體功效評價試驗，在試用前及試用4周後及8周後測試面部的角質層含水量、經皮水分流失(tewl)，面部皮膚與眼周皮膚的紋理(ra，rz)，並進行visia拍照。測定時，是要洗淨臉上的所有化妝品，並在溫度：20±2℃；相對溼度：50±10％的測試環境下，等待2個小時以上，才能進行測定，這樣得到的結果才是真正代表化妝品長期使用對皮膚的真實效果。

9.以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，在正常情況下連續8周的人體試用試驗，評價待檢樣品的性能和功效。大部分的受試者認為：產品耐受性好；產品性狀好；產品氣味好；產品質地好；使用後眼周皺紋有改善；使用後面部細紋有改善；使用後皮膚變得滋潤；使用後皮膚變得有彈性；使用後皮膚變得光滑；使用後皮膚變得柔軟；該產品適合本人皮膚類型；整體來說，產品令人滿意；願意繼續使用此產品；會購買該試用產品(假設價錢在可接受範圍內)。本試驗得到的有關功效的所有數據結果均是有統計學差異的。

10.本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽特別適合作為化妝品的功能原料，但也可以作為臨床營養品、保健食品、運動食品以及蛋白營養補充劑直接食用。

附圖說明

圖1是本發明方法：魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法的工藝流程圖。

圖2是本發明魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的傅立葉變換離子迴旋共振質譜(ft-ms)譜圖。

圖3是本發明製備的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽顆粒的sem電鏡圖(a——×2000倍；b——×10000倍；c——×4000倍；d——×3000倍；e——×1500倍；f——×2000倍)。

圖4是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解濃縮液與本發明魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的凝膠色譜對比圖(a——本發明步驟2後魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解濃縮液的凝膠色譜圖；b——本發明魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的凝膠色譜圖)。

圖5是國內外15種膠原蛋白肽溶液放置3周前後的凝膠色譜對比圖(a——海康生物膠原蛋白肽；a』——放置3周後的海康生物膠原蛋白肽；b——湖北德炎生物膠原蛋白肽；b』——放置3周後的湖北德炎生物膠原蛋白肽；c——天久生物膠原蛋白肽；c』——放置3周後的天久生物膠原蛋白肽；d——天驕生物膠原蛋白肽；d』——放置3周後的天驕生物膠原蛋白肽；e——阿敏生物膠原蛋白肽；e』——放置3周後的阿敏生物膠原蛋白肽；f——海南華研膠原蛋白肽；f』——放置3周後的海南華研膠原蛋白肽；g——可生魚鱗膠原蛋白；g』——放置3周後的可生魚鱗膠原蛋白；h——可生魚皮膠原蛋白肽；h』——放置3周後的可生魚皮膠原蛋白肽；i——玉脂研膠原蛋白肽；i』——放置3周後的玉脂研膠原蛋白肽；j——法姬瑪膠原蛋白肽；j』——放置3周後的法姬瑪膠原蛋白肽；k——吉利鼎膠原蛋白肽；k』——放置3周後的吉利鼎膠原蛋白肽；l——瑞邦膠原蛋白肽；l』——放置3周後的瑞邦膠原蛋白肽；m——法國羅塞洛膠原蛋白肽；m』——放置3周後的法國羅塞洛膠原蛋白肽；n——德國雅名膠原蛋白肽；n』——放置3周後的德國雅名膠原蛋白肽；o——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽；o』——放置3周後的本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)。

表1是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液放置3周後的降解物所佔比例。

圖6是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽與國內外18種膠原蛋白肽溶液的ge凝膠色譜對比圖(1——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽；2——日本胜肽；3——海康生物膠原蛋白肽；4——湖北德炎生物膠原蛋白肽；5——天久生物膠原蛋白肽；6——天驕生物膠原蛋白肽；7——阿敏生物(牛)膠原蛋白肽；8——海南華研膠原蛋白肽；9——可生魚鱗膠原蛋白肽；10——可生魚皮膠原蛋白肽；11——玉脂研膠原蛋白肽；12——法姬瑪膠原蛋白肽；13——吉利鼎膠原蛋白肽；14——瑞邦保健級別膠原蛋白肽；15——瑞邦食品級別膠原蛋白肽；16——法國羅塞洛膠原蛋白肽；17——德國雅名膠原蛋白肽；18——日本nippicollagen-100膠原蛋白肽；19——日本nippi海洋膠原蛋白肽)。

表2是ge凝膠色譜測定本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽與國內外18種膠原蛋白肽溶液的最高出峰位置與半峰寬對比。

圖7是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽系列化妝品的8小時保溼能力對比(1——透明化妝水(含2％本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)；2——半透明化妝水(含2％本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)；3——化妝膏(含2％本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)；4——化妝乳液(含1％本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)；5——空白對照(不塗抹任何化妝品))。

圖8是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽透明化妝水相對於透明化妝水對照，皮膚角質層含水量比例的變化(1——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽透明化妝水(含量2％)；2——透明化妝水對照(未添加膠原蛋白肽))。

圖9是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽半透明化妝水相對於半透明化妝水對照，皮膚角質層含水量比例的變化(1——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽半透明化妝水(含量2％)；2——半透明化妝水對照(未添加膠原蛋白肽))。

圖10是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽化妝膏相對於化妝膏對照，皮膚角質層含水量比例的變化(1——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽化妝膏(含量2％)；2——化妝膏對照(未添加膠原蛋白肽))。

圖11是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽化妝乳液相對於化妝乳液對照，皮膚角質層含水量比例的變化(1——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽化妝乳液(含量1％)；2——化妝乳液對照(未添加膠原蛋白肽))。

圖12是國內外6種膠原蛋白肽透明化妝水的8小時保溼能力對比(1——透明化妝水(含2％本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)；2——透明化妝水(含2％德國雅名膠原蛋白肽)；3——透明化妝水(含2％法國羅塞洛膠原蛋白肽)；4——透明化妝水(含2％日本nippi海洋膠原蛋白肽)；5——透明化妝水(含2％中國海南華研膠原蛋白肽)；6——透明化妝水(含2％nippicollagen-100膠原蛋白肽)；7——透明化妝水對照(不添加任何膠原蛋白肽))。

圖13是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽與國內外5種膠原蛋白肽的凝膠色譜圖對比(1——nippi海洋膠原蛋白肽(號稱日本最大的膠原蛋白企業)；2——中國海南華研(號稱中國最大的膠原蛋白對外出口企業)；3——德國雅名aymin膠原蛋白肽；4——nippicollagen-100膠原蛋白肽；5——法國羅塞洛膠原蛋白肽；6——本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)。

圖14是本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的精華液與國際知名品牌的明星產品：蘭蔻小黑瓶精華肌底液和雅詩蘭黛特潤修護肌透精華露(第六代小棕瓶)，8小時保溼能力對比(1——海洋源i型膠原蛋白肽精華液(含2％本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽)；2——蘭蔻小黑瓶精華肌底液；3——雅詩蘭黛特潤修護肌透精華露(第六代小棕瓶)；4——空白對照(不塗抹任何化妝品))。

圖15是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用8周後，受試者面部皮膚角質層含水量的變化趨勢。

圖16是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用8周後，受試者面部皮膚水分流失速率的變化趨勢。

圖17是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用8周後，受試者面部皮膚粗糙度rz的變化趨勢。

圖18是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用8周後，受試者眼部皮膚粗糙度ra的變化趨勢。

圖19是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用8周後，受試者眼部皮膚粗糙度rz的變化趨勢。

圖20是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用期為8周，受試者使用前後眼部皮膚的圖片對比(a——使用前；b——使用4周後；c——使用8周後)。

圖21是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用期為8周，受試者使用前後面部皮膚的圖片對比(a——使用前；b——使用4周後；c——使用8周後)。

表3是以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，選擇皮膚乾燥、有明顯皺紋等皮膚問題的中國成年女性作為受試者，試用期為8周，受試者的評價內容與評價結果。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳述。

實施例1：

一種適用於化妝品的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法，步驟如下：

(1)預處理

將美國紅魚(sciaenopsocellatus)魚鱗投入反應釜中，加入魚鱗重量10倍的鹼溶液，攪拌30分鐘，用水洗淨，加入魚鱗重量10倍的酸溶液，攪拌30分鐘，再用去離子水洗淨，其中鹼溶液的質量體積濃度為3％，酸溶液的質量體積濃度為5％；

(2)酶解提取

將經過預處理並洗淨的魚鱗置於反應釜中，加入魚鱗重量的1倍的去離子水，加入濃鹼液調節ph為6.5，加入魚鱗投料重量2％的木瓜蛋白酶，反應溫度為55℃，反應45分鐘；酶解結束後升溫至70℃，保溫20分鐘滅酶，得到魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解濃縮液，提取率＝99.8％。

(3)分離純化

魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液用連續流離心機在14000rpm下高速離心，所得清液用相對分子質量為10kda的納濾膜去除大分子雜質，流速為8立方米/小時，膜壓力為0.931mpa，溫度為30℃；再用相對分子質量為200da的納濾膜去除小分子雜質和無機鹽，流速為5立方米/小時，膜壓力為2.758mpa，溫度為30℃，濃縮得到含量＝96％，魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液。

(4)快速乾燥與滅菌封裝

噴霧乾燥快速乾燥蛋白肽溶液，設定進風溫度為160℃，出風溫度為90℃。得到顆粒尺寸範圍集中在1～10μm之間的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球；再通過γ-射線輻射進行快速滅菌與適度交聯，輻射劑量為10kgy，輻射時間為30分鐘，最後進行無菌分裝。

實施例2：

一種適用於化妝品的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法，步驟如下：

(1)預處理

將鱅魚魚鱗先粉碎，投入反應釜中，加入魚鱗重量2倍的鹼溶液，攪拌15分鐘，用水洗淨，加入魚鱗重量10倍的酸溶液，攪拌30分鐘，再用去離子水洗淨，其中鹼溶液的質量體積濃度為4％，酸溶液的質量體積濃度為4％；

(2)酶解提取

將經過預處理並洗淨的魚鱗置於反應釜中，加去離子水，加入濃鹼液調節ph為7.0，加入魚鱗投料重量1.5％的木瓜蛋白酶和1.5％的中性蛋白酶，反應溫度為60℃，反應35分鐘，得到魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液，提取率＝99.5％。

(3)分離純化

魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液用連續流離心機在14000rpm下高速離心，所得清液用相對分子質量為5kda的納濾膜去除大分子雜質，流速為6立方米/小時，膜壓力為0.931mpa，溫度為35℃；再用相對分子質量為200da的納濾膜去除小分子雜質和無機鹽，流速為5立方米/小時，膜壓力為2.758mpa，溫度為30℃，濃縮得到含量＝97％的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液。

(4)快速乾燥與滅菌封裝

噴霧乾燥快速乾燥蛋白肽溶液，設定進風溫度為150℃，出風溫度為85℃。得到顆粒尺寸範圍集中在1～10μm之間的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球；再通過紫外光輻射進行快速滅菌與適度交聯，輻射劑量為5kgy，輻射時間為60分鐘，最後進行無菌分裝。

實施例3：

一種適用於化妝品的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法，步驟如下：

(1)預處理

將羅非魚(oreochromisspp)魚鱗投入反應釜中，加入魚鱗重量10倍的鹼溶液，攪拌15分鐘，用水洗淨，加入魚鱗重量10倍的酸溶液，攪拌25分鐘，再用去離子水洗淨，其中鹼溶液的質量體積濃度為4％，酸溶液的質量體積濃度為6％；

(2)酶解提取

將經過預處理並洗淨的魚鱗置於反應釜中，加去離子水，加入濃鹼液調節ph為6.5，加入魚鱗投料重量2.5％的風味蛋白酶和1.5％的木瓜蛋白酶，反應溫度為53℃，反應30分鐘；酶解結束後升溫至75℃，保溫20分鐘滅酶，得到魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液，提取率＝98.8％。

(3)分離純化

魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液用連續流離心機在14000rpm下高速離心，所得清液用相對分子質量為5kda的納濾膜去除大分子雜質，流速為6立方米/小時，膜壓力為0.931mpa，溫度為35℃；再用相對分子質量為500da的納濾膜去除小分子雜質和無機鹽，流速為8立方米/小時，膜壓力為2.5mpa，溫度為35℃，濃縮得到含量＝96％的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液。

(4)快速乾燥與滅菌封裝

噴霧乾燥快速乾燥蛋白肽溶液，設定進風溫度為165℃，出風溫度為88℃。得到顆粒尺寸範圍集中在1～10μm之間的微米級魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球；再通過γ-射線輻射進行快速滅菌與適度交聯，輻射劑量為15kgy，輻射時間為15分鐘，最後進行無菌分裝。

實施例4：

一種適用於化妝品的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的規模化製備方法，步驟如下：

(1)預處理

將沙丁魚(sardine)魚鱗先粉碎，再投入反應釜中，加入魚鱗重量5倍的鹼溶液，攪拌18分鐘，用水洗淨，加入魚鱗重量5倍的酸溶液，攪拌25分鐘，再用去離子水洗淨，其中鹼溶液的質量體積濃度為3％，酸溶液的質量體積濃度為5％；

(2)酶解提取

將經過預處理並洗淨的魚鱗置於反應釜中，加去離子水，加入濃鹼液調節ph為8，加入魚鱗投料重量3.5％的胰蛋白酶或糜蛋白酶，反應溫度為50℃，反應1小時；酶解結束後升溫至80℃，保溫30分鐘滅酶，得到魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液，提取率＝97.5％。

(3)分離純化

魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液用連續流離心機在14000rpm下高速離心，所得清液用相對分子質量為10kda的納濾膜去除大分子雜質，流速為8立方米/小時，膜壓力為0.931mpa，溫度為25℃；再用相對分子質量為500da的納濾膜去除小分子雜質和無機鹽，流速為5立方米/小時，膜壓力為2.758mpa，溫度為40℃，濃縮得到含量＝95％的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液。

(4)快速乾燥與滅菌封裝

噴霧乾燥快速乾燥蛋白肽溶液，設定進風溫度為165℃，出風溫度為92℃。得到顆粒尺寸範圍集中在1～10μm之間的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球；再通過電子束輻射進行快速滅菌與適度交聯，輻射劑量為10kgy，輻射時間為15分鐘，最後進行無菌分裝。

如圖2所示，魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽通過傅立葉變換離子迴旋共振質譜(ft-ms)分析譜圖特徵，證明其均為單電荷物質，核質比(m/z)代表其分子量；所以，魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的分子量主要分布在500～1100da之間。

如圖3(a)和圖3(b)所示，魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球通過2000倍和10000倍的掃描電鏡放大後，觀察可見：其顆粒尺寸集中在1～10μm的範圍之間，屬於微米級別，而且可以推測出微球內部應該為中空結構，這樣才有可能在真空負壓的狀態下，呈現乾癟狀態。如圖3(c)所示，經過4000倍的掃描電鏡放大觀察並驗證得到：魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球內部的確是的中空結構，且具有較大的存儲空間。如圖3(d)、圖3(e)和圖3(f)所示，魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球通過3000倍、1500倍和2000倍的掃描電鏡放大後，觀察可見：魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽微球因逐漸吸收水分，而逐漸飽滿，顯示水分就是存儲在微球內部的中空結構的。

圖4、圖5、圖6和圖13採用的是凝膠色譜法測定；而表1和表2分別是基於圖5和圖6的凝膠色譜實驗總結的結論。

凝膠色譜法是利用凝膠把分子量大小不同的物質分離開的一種方法。凝膠是一種具有立體網狀結構且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質，對於某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內部的篩孔，然後又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內部越深，所走的路程越多，故小分子最後流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介於大分子與小分子之間，只能進入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介於大、小分子之間。因此，在凝膠色譜中，物質出峰時的體積(volume)與物質分子量(mr)的對數(log)成正比，即出峰體積越大，物質的分子量越大；出峰體積越小，物質的分子量越小。

根據孫大文教授的研究，對於分子量小於3000da的蛋白質水解物，ge公司的superdexpeptide系列的凝膠色譜柱比tskgelg2000swxl色譜柱具有更好的選擇性。所以本發明也選擇ge公司的凝膠色譜柱作為色譜固定相。測定方法也參見以下文章：

1)su,g.w.,ren,j.y.,zhao,m.m.&sun,d.w.(2013).comparisonofsuperdexpeptidehr10/30columnandtskgelg2000swxlcolumnformolecularweightdistributionanalysisofproteinhydrolysates.foodandbioprocesstechnolog,6:3620–3626.

如圖4所示，本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解濃縮液與本發明魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的凝膠色譜對比圖上的出峰位置基本一致，這一方面說明：本發明步驟2製備的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽酶解液已經與魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽最終產品在分子量分布方面高度類似，本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的特定分子量片段是主要由於步驟2酶解提取工藝產生的，膜分離純化僅起到後期的輔助性的去除小分子雜質和無機鹽的作用。

如圖5所示，除本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽以外，其他國內外14種膠原蛋白肽溶液在放置3周後，它們的分子量分布均出現較大的變化，顯示這些膠原蛋白肽在液體狀態下的穩定性較差，並不適合在化妝品領域使用，這說明：這些膠原蛋白肽本身的分子量片段的穩定性較差，這些產品的製備工藝有待改進。

如圖5(o)和表1所示，在放置3周後，本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽溶液與剛配置時候相比，主要出峰位置完全一樣。所不同的地方(圖5(o)中用紅色圓圈標出)可能是在放置階段的由於少部分肽降解產生的胺基酸脫落的緣故。但經過表1的峰面積歸一化法計算所佔的峰面積比例為3.3％，小於5％，基本可忽略不計。這說明：本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽由於特定的500～1100da之間的分子量片段，在液體狀態下的穩定性更佳，放置3周，分子量分布基本無波動，特別適合在各種化妝品中使用。

如圖6和表2所示，對比國內外18種膠原蛋白肽，本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽分子量的集中度較好，且分子量分布均小於國內外18種膠原蛋白肽。

如圖7所示，無論是透明化妝水、半透明化妝水，還是化妝膏，亦或是化妝乳液，添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽後，受試者皮膚的含水量均有所提升。特別是魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽化妝水系列(透明化妝水和半透明化妝水)，受試者皮膚的含水量提升更是顯著。

如圖7、圖8、圖9、圖10和圖11所示，無論是透明化妝水、半透明化妝水，還是化妝膏，亦或是化妝乳液，添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽後，均能提高相應化妝品基質的保溼能力，這顯示本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽是維持化妝品保溼能力的主要物質。

如圖12所示，添加了本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的透明化妝水的8小時保溼能力明顯優於添加國內外5種膠原蛋白肽的透明化妝水。結合圖13所示，本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的分子量片段與國內外5種膠原蛋白肽相比有明顯不同，分子量分布明顯更為集中且偏小。這一方面說明：膠原蛋白肽的保溼功效與其分子量分布之間息息相關。本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽特定的500～1100da之間的分子量片段，能夠更有效地透過皮膚，更好地補充皮膚水分，具有更高的保溼功效。

如圖14所示，添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的精華液，與國際知名品牌的明星產品：蘭蔻小黑瓶精華肌底液和雅詩蘭黛特潤修護肌透精華露(第六代小棕瓶)對比，在保溼功效方面均顯示出相當的優勢。這不僅體現添加本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝品具有良好的皮膚親和力，能夠較好地提升和保持人體皮膚水分；而且由於保溼性是一切化妝品的基礎，本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽擁有的優異的保溼性能和與生具備的良好的皮膚親和力，預示著添加本發明生產出來的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝品在抗衰老功效方面也會有不遜於甚至超越國際知名品牌的類似產品的表現。

如圖15和圖16所示，以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，試用8周後，受試者面部皮膚角質層含水量增加，水分流失速率降低，且具有顯著差異性，提示該受試物具有保溼和改善皮膚水分流失的功效。

如圖17所示，以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，試用8周後，受試者面部皮膚粗糙度rz降低，且具有顯著差異性，提示該受試物具有改善皮膚粗糙度的功效。

如圖18和圖19所示，以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，試用8周後，受試者眼周皮膚粗糙度rz、ra均顯著降低，提示該受試物具有改善眼部皮膚粗糙度的功效。

如圖20所示，以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，試用8周後，受試者眼部皺紋變少變淺，更加細膩平滑。

如圖21所示，以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，試用8周後，受試者面部乾燥與細紋現象均有改善，皮膚更加滋潤平滑。

如表3所示，以添加本發明的魚鱗ⅰ型膠原蛋白肽的化妝膏、化妝乳液、透明化妝水和半透明化妝水作為受試物，試用8周後，受試者在以下14個方面評價良好：產品耐受性好；產品性狀好；產品氣味好；產品質地好；使用後眼周皺紋有改善；使用後面部細紋有改善；使用後皮膚變得滋潤；使用後皮膚變得有彈性；使用後皮膚變得光滑；使用後皮膚變得柔軟；該產品適合本人皮膚類型；整體來說，產品令人滿意；願意繼續使用此產品；會購買該試用產品(假設價錢在可接受範圍內)。

表1

表2

表3