一種Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙醯基‑賴/鳥氨酸的製備方法與流程
2023-12-03 16:44:51 1
本發明涉及一種賴/鳥氨酸衍生物的製備方法，尤其是Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴/鳥氨酸的製備方法。
背景技術：
在免疫學和生物化學研究中，用螢光染料對蛋白質修飾是一個重要的手段，應用廣泛。對於研究生物結構和功能、細胞內過程的顯影、分子間相互作用，生物活化多肽的染料衍生物是個很有用的工具。螢光底物具有可連續檢測、低濃度的高敏性等優點，因此提供了一種特別便利的酶活性檢測方法。作為螢光探針或者標記物，香豆素系列化合物具有廣闊而多樣的應用前景，它們表現出更寬的光譜寬度，更好的光穩定性和高量子發射效率。7-甲氧基-4-乙醯基（Mca）就是一個典型，將Mca接入到賴氨酸上做成Fmoc-Lys(Mca)-OH，再通過固相合成的方法，嵌入到多肽鏈或者蛋白質上以後，從而引入螢光標記，大大方便觀察蛋白質的系列生物化學反應。Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴氨酸[Fmoc-Lys(Mca)-OH]是一種應用前景廣泛的多肽標記試劑。Cas號：386213-32-7。分子式：C33H32N2O8。分子量：584.62。
目前的合成方法有兩種，第一種，用於螢光基質固相合成中的Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴氨酸的合成（Letters in Peptide Science (2000) 7: 263.）公開了下述內容：賴氨酸鹽酸鹽與銅離子絡合，得到賴氨酸銅鹽絡合物與7-甲氧基香豆素-4-乙酸在乙腈-DMF混合溶劑中縮合，然後通過樹脂處理，得到Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴氨酸，Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴氨酸再用Fmoc-OSu上保護，即得到Fmoc-Lys(Mca)-OH，此方法步驟較長，總體收率為17%，收率較低，處理過程複雜，相對成本偏高。
第二種，固相多肽中的螢光標記（Org. Biomol. Chem., 2008,6, 4582-4586.）公開了下述內容：7-甲氧基香豆素-4-乙酸先與HOBt（1-羥基苯並三唑）在氯化亞碸催化下反應，生成4-(苯並三唑-1-乙醯基)-7-甲氧基香豆素，4-(苯並三唑-1-乙醯基)-7-甲氧基香豆素再與Nα-芴甲氧羰基-賴氨酸反應生成Fmoc-Lys(Mca)-OH，此反應過程中用到氯化亞碸，具有較強揮發性，氣味難聞，不利於身體健康，兩步反應處理都相對複雜。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-賴/鳥氨酸的製備方法，主要解決現有合成方法中的收率低、處理複雜、環境不友好等問題。
本發明的技術方案為：一種Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴/鳥氨酸的製備方法，包括以下步驟：Nα-芴甲氧羰基-賴/鳥氨酸叔丁酯（即Fmoc-Lys-OtBu或者Fmoc-Orn-OtBu，市面有售）與7-甲氧基香豆素-4-乙酸（市面有售）在縮合劑催化下縮合生成Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-賴/鳥氨酸叔丁酯，Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-賴/鳥氨酸叔丁酯再用三氟乙酸脫除叔丁酯，即得到產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴/鳥氨酸。
具體操作步驟為，第一步，將Nα-芴甲氧羰基-賴/鳥氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF（N,N-二甲基甲醯胺）中，用冰鹽浴降溫到-10℃到0℃之間，滴加縮合劑的DMF溶液，保持溫度在-5℃到5℃之間，滴加完畢，室溫（20-30℃）攪拌過夜（12-16小時），過濾去鹽，減壓蒸餾去除DMF，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸乾乙酸乙酯，得到中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-賴/鳥氨酸叔丁酯。第二步，將Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-賴/鳥氨酸叔丁酯加入到適量二氯甲烷中，降溫，保持溫度在0℃到10℃之間，滴加三氟乙酸，然後室溫（20-30℃）反應過夜，補加適量二氯甲烷，用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚結晶，得到最終產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴/鳥氨酸。
所述縮合劑為N,N'-二異丙基碳二亞胺（DIC）、N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)中的一種。
所述賴氨酸包括L-賴氨酸、DL-賴氨酸或D-賴氨酸中的一種，鳥氨酸為L-鳥氨酸、DL-鳥氨酸或D-鳥氨酸中的一種。
本發明的有益效果是：本發明提供了一種Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-賴/鳥氨酸的製備方法，避免了使用刺激性較大對身體有害的氯化亞碸，不產生藍色銅鹽廢水。反應步驟短，處理方便，高效便捷，收率可高達54%。
附圖說明
圖1為本發明產品的紅外圖譜。
圖2為本發明產品的核磁共振圖譜。
具體實施方式
實施例1：
將等當量的Nα-芴甲氧羰基-L-賴氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰鹽浴降溫到-10℃到0℃之間，滴加1當量N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)的DMF溶液，保持溫度-5℃到5℃之間，滴加完畢，室溫攪拌過夜（20-30℃），過濾去鹽，減壓蒸餾去除DMF，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸乾乙酸乙酯，得到中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-賴氨酸叔丁酯。另取一個燒杯，加入適量二氯甲烷，中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-賴氨酸叔丁酯加入到燒杯中，降溫，保持溫度在0℃到10℃之間，滴加3倍當量的三氟乙酸，然後室溫（20-30℃）反應過夜，補加適量二氯甲烷，用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚結晶，得到最終產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-L-賴氨酸。純度98.5%，兩步收率51%。產品的紅外和核磁共振圖譜見圖1、2。
實施例2：
將等當量的Nα-芴甲氧羰基-L-賴氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰鹽浴降溫到-10℃到0℃之間，滴加1當量N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）的DMF溶液，保持溫度-5℃到5℃之間，滴加完畢，室溫攪拌過夜（20-30℃），過濾去鹽，減壓蒸餾去除DMF，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸乾乙酸乙酯，得到中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-賴氨酸叔丁酯。另取一個燒杯，加入適量二氯甲烷，中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-賴氨酸叔丁酯加入到燒杯中，降溫，保持溫度在0℃到10℃之間，滴加3倍當量的三氟乙酸，然後室溫（20-30℃）反應過夜，補加適量二氯甲烷，用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚結晶，得到最終產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-L-賴氨酸。純度98.1%，兩步收率43%。產品的紅外和核磁共振圖譜見圖1、2。
實施例3：
將等當量的Nα-芴甲氧羰基-L-鳥氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰鹽浴降溫到-10℃到0℃之間，滴加1當量N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)的DMF溶液，保持溫度-5℃到5℃之間，滴加完畢，室溫攪拌過夜（20-30℃），過濾去鹽，減壓蒸餾去除DMF，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸乾乙酸乙酯，得到中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-鳥氨酸叔丁酯。另取一個燒杯，加入適量二氯甲烷，中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-鳥氨酸叔丁酯加入到燒杯中，降溫，保持溫度在0℃到10℃之間，滴加3倍當量的三氟乙酸，然後室溫（20-30℃）反應過夜，補加適量二氯甲烷，用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚結晶，得到最終產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-L-鳥氨酸。純度97.9%，兩步收率48%。產品的紅外和核磁共振圖譜見圖1、2。
實施例4：
將等當量的Nα-芴甲氧羰基-L-鳥氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰鹽浴降溫到-10℃到0℃之間，滴加1當量1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)的DMF溶液，保持溫度-5℃到5℃之間，滴加完畢，室溫攪拌過夜（20-30℃），過濾去鹽，減壓蒸餾去除DMF，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸乾乙酸乙酯，得到中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-鳥氨酸叔丁酯。另取一個燒杯，加入適量二氯甲烷，中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-L-鳥氨酸叔丁酯加入到燒杯中，降溫，保持溫度在0℃到10℃之間，滴加3倍當量的三氟乙酸，然後室溫（20-30℃）反應過夜，補加適量二氯甲烷，用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚結晶，得到最終產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-L-鳥氨酸。純度98.9%，兩步收率54%。產品的紅外和核磁共振圖譜見圖1、2。
實施例5：
將等當量的Nα-芴甲氧羰基-DL-賴氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰鹽浴降溫到-10℃到0℃之間，滴加1當量N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)的DMF溶液，保持溫度-5℃到5℃之間，滴加完畢，室溫攪拌過夜（20-30℃），過濾去鹽，減壓蒸餾去除DMF，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸乾乙酸乙酯，得到中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-DL-賴氨酸叔丁酯。另取一個燒杯，加入適量二氯甲烷，中間體Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙醯基-DL-賴氨酸叔丁酯加入到燒杯中，降溫，保持溫度在0℃到10℃之間，滴加3倍當量的三氟乙酸，然後室溫（20-30℃）反應過夜，補加適量二氯甲烷，用飽和食鹽水洗滌三次，用硫酸鈉乾燥，過濾去除硫酸鈉，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚結晶，得到最終產物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙醯基-DL-賴氨酸。純度98.5%，兩步收率51%。產品的紅外和核磁共振圖譜見圖1、2。