一種絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽及其製備方法和應用的製作方法
2023-06-24 19:45:06
一種絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽及其製備方法和應用，屬於基因工程及其製備領域。本發明通過構建人源絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor原核表達載體，優化重組多肽表達，改善重組多肽純化，鑑定重組多肽活性，其重組多肽可以抑制胰蛋白酶的蛋白活性及人肝癌細胞株SMMC-7721的增殖活性，為人源絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽抗腫瘤應用奠定基礎，可望形成新的抗腫瘤治療藥物。
【專利說明】一種絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程及其製備領域，特別涉及一種絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽及其製備方法。
【背景技術】
[0002]侵襲和轉移是惡性腫瘤的生物學特性，是造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因。降低惡性腫瘤患者死亡率，改善惡性腫瘤患者預後，抑制惡性腫瘤細胞侵襲和轉移是醫學治療的難點。細胞外基質(ECM)的水解是腫瘤細胞侵襲和轉移的重要步驟。腫瘤細胞可分泌一種多功能絲氨酸蛋白酶尿激酶型纖溶酶原，激活纖溶酶原產生纖溶酶，繼而降解細胞外基質；同時還能激活基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP),降解細胞外基質和層粘連蛋白、纖粘連蛋白、纖維蛋白聚糖、膠原纖維等基膜成分。當細胞和基質屏障被穿透破壞，腫瘤細胞實現侵襲和/或轉移。
[0003]抑制尿激酶型纖溶酶原激活系統活性可以阻止腫瘤的侵襲和/或轉移。尿激酶型纖溶酶原激活系統由尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogenactivator, uPA)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPA receptor, uPAR)、纖溶酶原激活物抑制因子 I (plasminogen activator inhibitorl, PA1-1)和 2 (PA1-2)組成，後者屬於絲氨酸蛋白酶抑制因子(serine protease inhibitors, Serpin)超家族。Serpin是一類絲氨酸蛋白酶活性調節因子，可特異性結合絲氨酸蛋白酶活性中心，抑制絲氨酸蛋白酶活性。常見的類型包括Kazal型、Kunitz型、α -巨球蛋白、Bowman_Brik、pacifastin家族,其中Kazal型Serpin較為保守，主要存在於哺乳動物中，目前已發現100多種，多為小分子多肽，大多能夠抑制腫瘤細胞的增殖和活性。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種人源絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽及其製備方法。本發明通過構建人源絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor原核表達載體，優化重組蛋白表達，改善重組蛋白純化，鑑定重組蛋白活性，其重組多肽可以抑制胰蛋白酶的蛋白活性及人肝癌細胞株SMMC-7721的增殖活性，為人源絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽抗腫瘤應用奠定基礎，可望形成新的抗腫瘤治療藥物。
[0005]本發明的人源絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor是利用SSH技術研究B型肝炎病毒DNA聚合酶反式調節作用，從人肝母細胞瘤HepG2細胞中篩選得到的基因，經Real-TimePCR驗證後，結合生物信息學方法確定該基因是一種新的Kazal型Serpin。胺基酸序列同源的Serpin基本結構。
[0006]本發明通過RT-PCR於H印G2細胞總RNA獲得Hespintor cDNA，該基因具有SEQ IDN0.1中的核苷酸序列，該序列全長285bp。
[0007]本發明的人源絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因編碼的胺基酸序列具有SEQID N0.2的序列，由94個胺基酸組成。本發明Hespintor多肽全長包括三部分:信號肽(l-23aa)、連接區(24-34aa)和Kazal結構域(35_94aa)。真正起蛋白活性的是Kazal結構域，即為本發明的重組多肽。
[0008]本發明的重組多肽製備方法如下:
(1)重組多肽基因的獲取:利用RNAis0Plus從H印G2細胞中提取總RNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。以H印G2細胞總RNA為模板，利用TaKaRa RNA LA PCR KU，先逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴增重組多肽基因片段RNA並反轉錄為cDNA，設計引物，序列如下:
Forward:5』 -GGATCCGCCTAAGCCCCG-3，；
Reverse:5』 -GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3> ；
Forward中GGATCC及Reverse中AAGCTT為酶切位點鹼某序列，其中GGATCC為BamH I酶切位點，AAGCTT為Hind III酶切位點；
(2)重組多肽基因的克隆與鑑定:利用TaKaRaDNA Ligation KU，將回收的重組多肽基因片段與PMD19-T載體連接，載體與DNA片段的摩爾比為1:3 ;將連接後的產物後轉化至JM109感受態細胞中，塗布LB/Amp/X-Gal/IPTG篩選平板，培養；挑取陽性菌落進行菌落PCR對目的基因進行序列鑑定；取菌落PCR鑑定為陽性的菌液，培養後，提取質粒，BamH I ,HindIII進行雙酶切鑑定；
(3)重組多肽基因的克隆與鑑定:
將 Hespintor/pMD19-T 載體與 pET_40b (+)載體分別進行 BamH 1、Hind III雙酶切；後按載體與插入片段摩爾比1: 3，對載體和片段進行連接，將連接後產物轉化至E.coliRosetta(DE3)中，塗於LB (Cam+、Kana+)瓊脂平板上培養，取菌體PCR鑑定為陽性的菌液，培養後，提取質粒，以BamH 1、Hind III進行雙酶切鑑定；
(4)挑取陽性克隆的單菌落Rosetta (DE3)/Hespintor/pET_40b (+)於 LB (Cam+、Kana+)培養液中培養，當0D_=0.6-0.8時，加入IPTG，誘導表達，得菌液；
(5)取菌液,離心,棄上清,加入LysisBuffer,用尿素洗漆緩衝液洗漆,得到包涵體沉澱，將所得包涵體沉澱用尿素緩衝液重懸，離心，取上清液，即為柱前蛋白液；
(6)利用蛋白親和層析柱純化柱前蛋白液，以0.3M NaCl, 20mM Tris, 300mMimidazole, pH8.0,為流動相，收集280nm吸收峰處的目的多肽,得到絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽，其胺基酸序列具有SEQ ID N0.235-94aa的序列；
本發明所述Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因通過Motif Scan分析表明Hespintor基因有一個Kazal型Serpin結構域，位於35_94aa。該結構域一般由50~60個胺基酸殘基組成，其中包括一個較為保守的序列模體和6個半胱氨酸殘基:C I —X(1-7) —C I1-X (5) -PVC III G-X (4) —TY—X—N—X—C IV—X (2-6) —C V-X(9-17) — C VKX與括號內的數字分別表示任意殘基和殘基的數目)。Hespintor在基本結構上與其它Kazal家族成員既有相似性又有獨特性。結合SignalP分析可知，Hespintor基因結構包括3部分:N端l-23aa構成信號肽，表明其具有分泌到細胞外的性質，並符合PSORT II預測Hespintor亞細胞定位於細胞外的結果；C端35_94aa構成成熟肽(即一個典型的Kazal結構域)；在信號肽與成熟肽之間的24-34aa構成了連接區。通過SWISS-MODEL預測發現Hespintor結構主要由螺旋和摺疊組成。
[0009]Hespintor基因的開放讀碼框架(ORF)長度為285bp，編碼產物由94aa組成，具有SEQ ID N0.2的胺基酸序列。通過Unigene資料庫分析發現,Hespintor基因定位於人類5號染色體長臂3區3帶I亞帶(5q33.1)。
[0010]本發明所公開的絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽優點在於①具有人源性特點，可在不影響療效的前提下，減少化療藥物的用量，降低其毒副作用；②由60個胺基酸組成的小分子多肽，一旦應用於臨床將最大程度地減少降低機體免疫排斥反應；③抑制uPA活性最為直接和有效。由於腫瘤細胞分泌的uPA是腫瘤局部浸潤和/或形成遠處轉移的限速步驟，因此該重組多肽作為化療替代藥物的臨床應用前景是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為原核表達菌液粗提重組多肽圖，泳道1:Rosetta (DE3)本底表達；泳道2:Rosetta (DE3)/pET_40b (+)空載誘導；泳道]\1:Marker ;泳道 3:Rosetta (DE3) /Hespintor/pET_40b (+)未誘導；泳道4:Rosetta (DE3)/Hespintor/pET_40b (+)誘導；
圖2為原核表達純化重組多肽圖，泳道M =Marker ;泳道1:全菌沉澱；泳道2:柱前重組多肽液；泳道3，4:柱後重組多肽液；
圖3為純化重組多肽對胰蛋白活性的抑制作用圖；
圖4為MTT法檢測純化重組多肽對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖的抑制作用圖。【具體實施方式】
[0012]以下實施例子進一步解釋本發明的內容，但並不用以限制本發明。
[0013]實施例1:所述重組多肽基因的克隆與鑑定 其具體方法如下:
(I)重組多肽基因的獲取:利用RNAiso Plus從HepG2細胞中提取總RNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。以H印G2細胞總RNA為模板，利用TaKaRa RNA LA PCR KU，先逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴增重組多肽基因片段。
[0014]設計PCR擴增引物如下(下劃線示酶切位點鹼基序列):
Forward:5』 -GGATCCGCCTAAGCCCCG-3，
Reverse:5』 -GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3>
其中GGATCC為BamH I酶切位點，AAGCTT為Hind III酶切位點。引物由寶生物工程(大連)公司合成。
[0015]PCR反應體系:
【權利要求】
1.一種絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽，其特徵在於:重組多肽全序列見序列表SEQID N0.235_94aa。
2.如權利要求2所述的重組多肽，其特徵在於:重組多肽由60個胺基酸組成。
3.一種絲氨酸蛋白酶抑制因子多肽，其特徵在於:多肽全序列見序列表SEQ ID N0.2,其中l_23aa處為信號肽區域、24_34aa處為連接區域和35_94aa處為重組多肽區域。
4.如權利要求3所述的多肽，其特徵在於:多肽由94個胺基酸組成。
5.一種權利要求1所述的氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽的製備方法如下: (1)重組多肽基因的獲取:從H印G2細胞中提取總RNA，反轉錄為cDNA，設計引物，序列如下:
Forward:5，-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3，；
Reverse:5』 -GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3』 ； 其中GGATCC為BamH I酶切位點，AAGCTT為Hind III酶切位點； PCR擴增， 得到重組多肽基因片段，基因全序列見序列表SEQ ID N0.1; (2)重組多肽基因的克隆與鑑定:重組多肽基因片段與PMD19-T載體連接，載體與DNA片段的摩爾比為1:3;將連接後的產物後轉化至JM109感受態細胞中，培養後提取質粒，BamH 1、Hind III進行雙酶切鑑定； (3)重組多肽基因的表達: 將 Hespintor/pMD19-T 載體與 pET_40b (+)載體分別進行 BamH 1、Hind III雙酶切；後按載體與插入片段摩爾比1: 3，對載體和片段進行連接，將連接後產物轉化至E.coliRosetta (DE3)中，培養，培養後，提取質粒，以BamH 1、Hind III進行雙酶切鑑定； 挑取陽性克隆的單菌落 Rosetta (DE3)/Hespintor/pET_40b (+)於 LB (Cam+、Kana+)培養液中培養，當OD6tltl=0.6-0.8時，加入IPTG，誘導表達，得菌液； (4)取菌液，離心，棄上清，用尿素洗滌緩衝液洗滌，得到包涵體沉澱，將所得包涵體沉澱用尿素緩衝液重懸，離心，取上清液，即為柱前蛋白液； (5)利用蛋白親和層析柱純化柱前蛋白液，以0.3M NaCl, 20mM Tris, 300mMimidazole, pH8.0,為流動相，收集280nm吸收峰處的目的多肽，得到絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽，重組多肽全序列見序列表SEQ ID N0.2中35-94aa處。
6.權利要求1所述的絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽在製備抑制胰蛋白酶藥物中的應用。
7.權利要求1所述的絲氨酸蛋白酶抑制因子重組多肽在製備抑制腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103772499SQ201410006050
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】倫永志, 王雪蕾, 馮潔 申請人:大連大學