乳酸桿菌菌種及其分離選育方法和用途的製作方法

2023-12-03 07:02:51

專利名稱：乳酸桿菌菌種及其分離選育方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物營養學和微生態學領域，特別涉及4種在仔豬消化道內具有互作效應的乳酸桿菌菌種及其分離選育方法和用途，含該乳酸桿菌菌種的複合製劑可應用於斷奶仔豬的飼料添加劑，起到仔豬防病促生長效果。
背景技術：
飼料添加劑是飼料的核心問題，藥物飼料添加劑是隨著上個世紀40年代初抗菌素問世後逐漸被廣泛使用的。隨著抗菌素品種的增多和生產水平的提高，抗菌藥物的價格下降，在養殖業集約化程度日益提高的情況下，飼料中添加抗菌藥物已成為提高養殖效益的一種有效手段。但是抗菌藥物的耐藥性和藥物在動物性產品中的殘留對人類具有潛在危害性。狂牛症、口蹄疫、鹽酸克倫特羅中毒和「二惡英」事件等使消費者對食品安全，尤其是動物食品的安全更加重視。從上個世紀90年代以來，歐盟開始禁用和限用抗菌素作為畜禽生長促進劑的法規，2000年，歐盟做出了要在今後若干年內全面禁止抗菌素作為飼料添加劑使用的規定。我國由於飼養環境較差，對抗菌素的依賴更大，在日糧中大量使用抗菌素是限制我國畜牧業發展的重要因素和限制了我國動物產品的出口。斷奶仔豬腹瀉和生長受抑制是世界性的問題，由於抗菌素的不合理應用產生的耐藥性問題，使治療動物和人類疾病遇到很大困難，研究與開發抗菌素替代品是當前畜牧業和飼料工業的一個熱點，益生素是公認的作為抗菌素替代品的一種製劑。但目前市場上的益生素產品作用效果不穩定是影響益生素在養殖業中廣泛應用的一個重要原因，產品不穩定的原因主要有益生素產品的作用對象太廣泛和產品質量不穩定變異大。

發明內容
本發明的目的在於針對仔豬消化道的生理特點，分離選育出適合在仔豬胃發揮益生作用的格氏乳酸桿菌，在十二指腸發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌，在空腸發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸發揮益生作用的發酵乳酸桿菌；通過優化上述四種乳酸桿菌的組合，可製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中；
本發明的另一目的在於，提供一種分離選育上述四種乳酸桿菌的分離選育方法；本發明的再一目的在於提供本發明的格氏乳酸桿菌的用途，即與在健康仔豬十二指腸中發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後曰糧中。
本發明的技術方案如下本發明提供的格氏乳酸桿菌，為由仔豬胃黏膜中分離選育的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)，其保藏號為CGMCC No.0840；本發明提供的格氏乳酸桿菌分離選育方法，其分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.4，再用濃鹽酸調pH至4.5；並用Hungates管做成無菌厭氧滾管；取健康斷奶仔豬胃底部黏膜於無菌容器中，用無菌生理鹽水衝洗除去黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，將上述白色針尖大小菌落分別無菌操作轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物；將上述步驟得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯組分包括10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，蒸餾水1000毫升，並用醋酸調節pH至5.4；二、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌再進行以下選育(一)耐酸選育分別將上述乳酸桿菌24小時的培養物分別按1％接種量(乳酸桿菌與肉湯培養基的體積份配比為1∶100)接種在上述肉湯培養基中，選育出接種12-72小時後，在pH3.0的肉湯培養基中可生長的，即使肉湯變渾濁的耐酸乳酸桿菌；所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鍾；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至3.0；(二)耐高銅選育將上述選育的耐酸乳酸桿菌分別與1克五水硫酸銅加熱溶解後，混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出晾涼後，按1％接種量接種至肉湯培養基中，選育出接種後18-72小時能在該肉湯培養基中生長的同時耐酸和耐高銅的乳酸菌株；所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4；(三)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿；用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直；分別用上述選育出的同時耐酸和耐高銅的乳酸菌18-24小時的培養物將溝填滿，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離；選育出大腸桿菌菌落距離小溝邊緣最遠的同時耐酸、耐高銅和抗大腸桿菌的乳酸桿菌；(四)乳酸濃度為82mg/100ml的乳酸桿菌的選育將上述同時耐酸、耐高銅和抗大腸桿菌的乳酸桿菌培養物按1％接種量接種到肉湯培養基中，培養20小時，離心，取上清液，用超純水稀釋10倍後，在Technicon RA100生化儀上用酶法測定上清液中的乳酸濃度；選育得到一株乳酸濃度為82mg/100ml的乳酸桿菌；經中國科學院微生物研究所鑑定，該乳酸桿菌為格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)；所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，混合後裝進Hungates管，每管裝適量肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌；中國科學院微生物研究所對該乳酸桿菌為格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)的鑑定結果如下

本發明的格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)的生物學特性為(一)耐酸存活率在pH2.0處理6小時之後的存活率為133％；其耐酸測試步驟如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後先用冰醋酸調pH至5.6，再用濃鹽酸將pH調至2.0；
將製備的肉湯培養基置於Hungates管中，每個管放置20mlMRS肉湯培養基，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，涼下來後每管中加1ml的格氏乳酸桿菌培養物，在開始時和第6小時分別取樣，進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果；耐酸存活率的計算公式為S酸＝n6/n0S酸為經過pH2.0處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.0處理前塗布的每ml活菌數；n6為pH2.0處理6小時的每ml活菌數，得出在pH2.0處理6小時之後的存活率為133％；(二)耐熱存活率本發明的格氏乳酸桿菌的耐熱存活率為72％；其耐熱存活測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調pH為6.7；將製備的肉湯培養基置於Hungates管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，涼下來後每管中加1ml格氏乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數，同時將Hungates管放置在75℃水浴中加熱15分鐘，取樣進行活菌濃度計數。取樣進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果；耐熱存活率的計算公式為S熱＝n1/n0S熱為經過75℃加熱處理後的乳酸桿菌存活率；n0為加熱處理前每ml的活菌數；n1為加熱處理15分鐘後每ml的活菌數，得出耐熱存活率為72％；(三)耐貯藏存活率為38％；耐貯藏存活率測試方法如下
製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調，pH為6.7；將製備的肉湯培養基置於Hungates滾管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，涼下來後每管中加1ml乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數培養。室溫下放置30天後，取樣進行活菌濃度計數培養。取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150個的平皿計數，以平均值表示結果；耐貯藏存活率的計算公式為S貯＝n1/n0S貯為經過30天貯藏後的乳酸桿菌存活率；n0為貯藏前每ml的活菌數；n1為貯藏30天後每ml的活菌數，得出耐貯藏存活率為38％；(四)本發明的格氏乳酸桿菌在與大腸桿菌混合培養24小時後可使大腸桿菌(K88、K99和987P)下降105個數量級其測試方法如下(五)取5ml格氏乳酸桿菌培養物(108cfu/ml)與15ml無菌普通營養肉湯混合，製成含格氏乳酸桿菌培養物的營養肉湯，接種10％大腸桿菌培養物，大腸桿菌的起始濃度為107cfu/ml，起始培養液中格氏乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10倍，用0.1N的NaOH調培養液的pH為7.0，置37℃，2.5％CO2培養箱培養24個小時後，取出培養液，培養液經梯度稀釋後，取0.3ml稀釋液均勻塗布MRS瓊脂培養基上，每個梯度的培養液作3個平行樣，MRS瓊脂培養基置5％CO237℃培養箱培養18-48小時，取菌落數在30-150個的平皿計數，以平均值表示格氏乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中格氏乳酸桿菌的數量；同樣地，在培養24小時後取出培養液稀100倍後，取0.3ml稀釋液置於麥康凱瓊脂上，均勻塗布，做3個平行樣，將麥康凱瓊脂平板置37℃，普通培養箱培養18-48個小時，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示，其結果為本發明的格氏乳酸桿菌在與大腸桿菌混合培養24小時後可使大腸桿菌(K88、K99和987P)下降105個數量級(六)本發明的格氏乳酸桿菌在培養後20小時達到的最高生長濃度為1010cfu/ml；其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，在500ml的錐形瓶裡裝300ml的MRS肉湯，高壓滅菌並晾涼；晾涼後的肉湯培養基中接種5％的格氏乳酸桿菌培養物，分別在培養後24小時內每個小時、28、32、36、40、44、48小時取培養液進行梯度稀釋後，取0.3ml各梯度稀釋液注入裝有MRS瓊脂(pH6.5)的厭氧Hungates管中，用手輕輕滾勻，培養24-48小時計算滾管中的菌落數，以每管中菌落數在50-150個的管的梯度作為計算用，每個梯度做3個平行，以平均值表示結果，其結果為本發明的格氏乳酸桿菌在培養後20小時達到最高生長濃度為1010cfu/ml。
本發明還從健康斷奶仔豬十二指腸黏膜中分離選育出一種羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)，於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》其保藏號為CGMCC No.0841；該羅伊氏乳酸桿菌的分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.0；高壓蒸汽滅菌，並用Hungates管做成無菌厭氧滾管；取健康斷奶仔豬十二指腸的黏膜於無菌容器中，先用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述含分離培養基的Hungates無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，在生物無菌操作下，將上述白色針尖大小菌落分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯組分10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30無水硫酸鎂克，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，蒸餾水1000毫升，並用醋酸調節pH至5.4；將上述步驟得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；二、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌再進行以下選育(一)耐酸選育分別將上述乳酸桿菌24小時培養物按1％接種在肉湯培養基中，在試驗開始時和第8小時分別用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，計算活菌數，計算存活率。
所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先用冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至2.5；存活率的計算公式為S酸＝n8/n0S酸為經過pH2.5處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.5處理前塗布的每ml活菌數；n8為pH2.5處理8小時的每ml活菌數。
選育出在pH2.5處理8小時後存活率大於18％的乳酸桿菌；(二)耐膽鹽選育製備斜面厭氧瓊脂培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；3克豬膽鹽；1000毫升蒸餾水，用冰醋酸調pH至5.2，將上述培養基溶解完後，分裝在Hungates管，每管裝15ml左右，充1.5％二氧化碳40秒，加蓋封口後，高壓滅菌，取出後擺成斜面培養基；分別將上述耐酸性強的乳酸桿菌培養物，用無菌生理鹽水稀釋1000倍後，取0.2ml稀釋液接種到斜面厭氧瓊脂培養基中，輕輕搖蕩使其均勻分散在培養基表面，置37℃培養箱培養18-48小時；選育出能長出菌落的乳酸桿菌；
(三)耐高銅選育製備肉湯培養基10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，將上述成分與1克五水硫酸銅分別加熱溶解後，將二者混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出晾涼；按1％接種量將上述能長出菌落的乳酸桿菌培養物接種在上述肉湯培養基中，選育出接種後18-72小時能生長的菌株；(四)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿；用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直；用上述步驟(三)得到的乳酸桿菌培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離；選育出大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌；(五)將步驟(四)得到的大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養培養24小時後，觀察乳酸桿菌與大腸桿菌的數量變化關係，選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌；其選育方法如下分別取5ml大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌培養物(108cfu/ml)與15ml無菌普通營養肉湯混合，製成含乳酸桿菌培養物的營養肉湯，接種10％大腸桿菌培養物，大腸桿菌的起始濃度為107cfu/ml，起始培養液中乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10倍，用0.1N的NaOH調培養液的pH為7.0，置37℃，2.5％CO2培養箱培養24個小時後，取出培養液，培養液經梯度稀釋後，取0.3ml稀釋液均勻塗布在MRS瓊脂培養基上，每個梯度作3個平行樣，MRS瓊脂培養基置5％CO237℃培養箱培養18-48小時，取菌落數在30-150個的平皿計數，以平均值表示乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中乳酸桿菌的數量；同樣地，在培養24小時後取出培養液稀釋100倍後，取0.3ml稀釋液置於麥康凱瓊脂上，均勻塗布，作3個平行樣，將麥康凱瓊脂平板置37℃普通培養箱培養18-48個小時，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示；最後選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌，該乳酸桿菌經中國科學院微生物研究所鑑定為羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)；其鑑定結果如下表

五、本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌Lactobacillus reuteri的生物學特性(一)耐酸存活率本發明的羅伊氏乳酸桿菌經過pH2.0處理6小時之後的存活率為34.4％；其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後先用冰醋酸調pH至5.6，再用濃鹽酸將pH調至2.0。置於Hungates管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，晾涼；
將本發明的羅伊氏乳酸桿菌培養物放入涼下來的Hungates管中，每管中加1ml羅伊氏乳酸桿菌培養物，在開始時和第6小時分別取樣，進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果；耐酸存活率的計算公式為S酸＝n6/n0S酸為經過pH2.0處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.0處理前塗布的每ml活菌數；n8為pH2.0處理6小時的每ml活菌數，得出本發明的羅伊氏乳酸桿菌經過pH2.0處理6小時之後的存活率為34.4％；(二)耐熱存活率本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌的耐熱存活率為31％；其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調pH為6.7，置於Hungtes管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，晾涼待用；將本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌培養物加入Hungtes管中，每管中加1ml羅伊氏乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數，同時將Hungates管放置在75℃水浴中加熱15分鐘，取樣進行活菌濃度計數。取樣進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果；耐熱存活率的計算公式為S熱＝n0/n1S熱為經過75℃加熱處理後的乳酸桿菌存活率；n0為加熱處理前每ml的活菌數；n1為加熱處理15分鐘後每ml的活菌數，得出本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌的耐熱存活率為31％的結果；(三)耐貯藏存活率本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌的耐貯藏存活率為85％；
其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調，pH為6.7，置於Hungates滾管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，晾涼待用；本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌培養物置入Hungates滾管中，每管中加1ml羅伊氏乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數培養。室溫下放置30天後，取樣進行活菌濃度計數培養。取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150個的平皿計數，以平均值表示結果；耐貯藏存活率的計算公式為S貯＝n1/n0S貯為經過30天貯藏後的乳酸桿菌存活率；n0為貯藏前每ml的活菌數；n1為貯藏30天後每ml的活菌數，得出本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌的耐貯藏存活率分別為85％的結果；(四)生長量本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌在培養後18小時達到最高生長濃度為109cfu/ml；其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，在500ml的錐形瓶裡裝300ml的MRS肉湯，高壓滅菌，晾涼待用；將本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌培養物按5％接種量接種於肉湯培養基中，分別在培養後24小時內每個小時、28、32、36、40、44、48小時取培養液進行梯度稀釋後，取0.3ml各梯度稀釋液注入裝有MRS瓊脂(pH6.5)的厭氧Hungates管中，用手輕輕滾勻，培養24-48小時計算滾管中的菌落數，以每管中菌落數在50-150個的管的梯度作為計算用，每個梯度做3個平行，以平均值表示結果，得出本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌在培養後18小時達到最高生長濃度為109cfu/ml。
本發明還從健康斷奶仔豬空腸黏膜中分離選育出一種嗜酸乳酸桿菌Lactobacillusacidophilus，於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》其保藏號為CGMCC No.0842；該嗜酸乳酸桿菌的分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.0；高壓蒸汽滅菌，並在Hungates管做成無菌厭氧滾管；分離方法為取健康斷奶仔豬空腸黏膜於無菌容器中，先用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述含分離培養基的Hungates無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，在生物無菌操作下，將上述白色針尖大小菌落分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物，將得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的為乳酸桿菌屬；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯的組分包括10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，1000毫升蒸餾水，並用醋酸調節pH至5.4；二、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌再進行以下選育(一)耐酸選育製備肉湯培養基，其組分為10克蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先用冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至2.5；
分別將得到的乳酸桿菌培養物按1％接種量接種於上述肉湯培養基中，在試驗開始時和第8小時分別用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，計算活菌數，計算存活率；存活率的計算公式為S酸＝n8/n0S酸為經過pH2.5處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.5處理前塗布的每ml活菌數；n8為pH2.5處理8小時的每ml活菌數，選育出在pH2.5處理8小時後的存活率大於18％的乳酸桿菌；(二)耐膽鹽選育製備斜面厭氧瓊脂培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；3克豬膽鹽；1000毫升蒸餾水，用冰醋酸調pH至5.2，將上述培養基溶解完後，分裝在Hungates管，每管裝15ml左右，充1.5％二氧化碳1分鐘，加蓋封口後，高壓滅菌，取出後擺成斜面培養基，冷卻後待用；將上述步驟選育出的耐酸性強的乳酸桿菌培養物用無菌生理鹽水稀釋1000倍後，取0.2ml稀釋液接種，輕輕搖蕩使乳酸桿菌均勻分散在培養基表面，置37℃培養箱培養18-48小時，選育出能長出菌落的乳酸桿菌；(三)耐高銅選育製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，將上述成分與1克五水硫酸銅分別加熱溶解後，將二者混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出晾涼後待用；將步驟(二)選育出的能長出菌落的乳酸桿菌培養物按1％接種量分別接種在上述肉湯培養基中，選育出接種後18-72小時能生長的菌株；(四)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直；
用將上述步驟(三)選育出接種後18-72小時能生長的菌株培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離，選育出大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌；(五)將步驟(四)選育出的大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養24小時後，觀察乳酸桿菌與大腸桿菌的數量變化關係，選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌，該乳酸桿菌經中國科學院微生物研究所鑑定為嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)；其具體方法如下分別取5ml乳酸桿菌培養物(108cfu/ml)與15ml無菌普通營養肉湯混合，製成含乳酸桿菌培養物的營養肉湯，接種10％大腸桿菌培養，大腸桿菌的起始濃度為107cfu/ml，起始培養液中乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10倍，用0.1N的NaOH調培養液的pH為7.0，置37℃，2.5％CO2培養箱培養24個小時後，取出培養液，培養液經梯度稀釋後，取0.3ml稀釋液均勻塗布MRS瓊脂培養基上，每個梯度的培養液作3個平行樣，MRS瓊脂培養基置5％CO237℃培養箱培養18-48小時，取菌落數在30-150個的平皿計數，以平均值表示乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中乳酸桿菌的數量。同樣地，在培養24小時後取出培養液稀100倍後，取0.3ml稀釋液置於麥康凱瓊脂上，均勻塗布，做3個平行樣，將麥康凱瓊脂平板置37℃，普通培養箱培養18-48個小時，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示；選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌，該乳酸桿菌經中國科學院微生物研究所鑑定為嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)；其鑑定結果見下表


五、其生物學特性(一)耐酸存活率本發明選育的嗜酸乳酸桿菌經過pH2.0處理6小時之後的存活率為69.5％；其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後先用冰醋酸調pH至5.6，再用濃鹽酸將pH調至2.0。置於Hungates管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，晾涼後待用；在晾涼後的Hungates管中，按每管中加1ml嗜酸乳酸桿菌培養物，在開始時和第6小時分別取樣，進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果；耐酸存活率的計算公式為S酸＝n6/n0S酸為經過pH2.0處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.0處理前塗布的每ml活菌數；n8為pH2.0處理6小時的每ml活菌數，得出本發明選育的嗜酸乳酸桿菌經過pH2.0處理6小時之後的存活率為69.5％；(二)耐熱存活率本發明選育的嗜酸乳酸桿菌的耐熱存活率為62％；
其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調pH為6.7，置於Hungates管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，晾涼後待用；在Hungates管中，按每管中加1ml嗜酸乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數，同時將Hungates管放置在75℃水浴中加熱15分鐘，取樣進行活菌濃度計數。取樣進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果；耐熱存活率的計算公式為S熱＝n1/n0S熱為經過75℃加熱處理後的乳酸桿菌存活率；n0為加熱處理前每ml的活菌數；n1為加熱處理15分鐘後每ml的活菌數，得出本發明選育的嗜酸乳酸桿菌的耐熱存活率為62％；(三)耐貯藏存活率本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌的耐貯藏存活率為59％；其測試方法如下製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調pH為6.7，置於Hungates滾管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，晾涼後待用；在Hungates滾管中，按每管中加1ml嗜酸乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數培養。室溫下放置30天後，取樣進行活菌濃度計數培養。取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150個的平皿計數，以平均值表示結果；耐貯藏存活率的計算公式為
S貯＝n1/n0S貯為經過30天貯藏後的乳酸桿菌存活率；n0為貯藏前每ml的活菌數；n1為貯藏30天後每ml的活菌數，得出本發明選育的羅伊氏乳酸桿菌的耐貯藏存活率為59％；(四)生長量本發明選育的嗜酸乳酸桿菌在培養後18小時達到最高生長濃度為1011cfu/ml；其測試方法如下製備肉湯培養物，其組分為10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，在500ml的錐形瓶裡裝300ml的MRS肉湯，高壓滅菌，晾涼後待用；將嗜酸乳酸桿菌培養物按5％接種量分別接種於錐形瓶中，分別在培養後24小時內每個小時、28、32、36、40、44、48小時取培養液進行梯度稀釋後，取0.3ml各梯度稀釋液注入裝有MRS瓊脂(pH6.5)的厭氧Hungates管中，用手輕輕滾勻，培養24-48小時計算滾管中的菌落數，以每管中菌落數在50-150個的管的梯度作為計算用，每個梯度做3個平行，以平均值表示結果，本發明選育的嗜酸乳酸桿菌在培養後18小時達到最高生長濃度為1011cfu/ml。
本發明還從健康斷奶仔豬結腸黏膜中分離選育出一種發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)，於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》其保藏號為CGMCC No.0843；該發酵乳酸桿菌的分離選育的步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.0；高壓蒸汽滅菌，並在Hungates管做成無菌厭氧滾管；分別取來自健康斷奶仔豬結腸的黏膜於無菌容器中，先用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器杯中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述含分離培養基的Hungates無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，在生物無菌操作下，將上述白色針尖大小菌落分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯的組分包括10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，1000毫升蒸餾水，並用醋酸調節pH至5.4；將上述步驟得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；二、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌進行以下選育(一)耐酸選育製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先用冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至2.5；分別將上述乳酸桿菌培養物按1％接種量接種在肉湯培養基中，在試驗開始時和第8小時分別用無菌注射器取出培養物進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，計算活菌數，計算存活率，得出在pH2.5處理8小時後的存活率大於18％的乳酸桿菌；存活率的計算公式為S酸＝n8/n0S酸為經過pH2.5處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.5處理前塗布的每ml活菌數；n8為pH2.5處理8小時的每ml活菌數。
選育出在pH2.5處理8小時後的存活率大於18％的乳酸桿菌；(二)耐膽鹽選育製備斜面厭氧瓊脂培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；3克豬膽鹽；1000毫升蒸餾水，用冰醋酸調pH至5.2，將上述培養基溶解完後，分裝在Hungates管，每管裝15ml左右，充1.5％二氧化碳1分鐘，加蓋封口後，高壓滅菌，取出後擺成斜面培養基，冷卻後待用；取上述831株耐酸性強的乳酸桿菌培養物0.1ml，用無菌生理鹽水稀釋1000倍後，取0.2ml稀釋液接種，輕輕搖蕩使乳酸桿菌均勻分散在培養基表面，置37℃培養箱培養18-48小時。選擇123株能長出菌落的乳酸桿菌。
(三)耐高銅選育肉湯10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，將上述成分與1克五水硫酸銅分別加熱溶解後，將二者混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出涼下來後，按1％接種量分別接種上述123株乳酸桿菌培養物在上述肉湯中，選擇51株接種後18-72小時能生長的菌株。
(四)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直。用上述51株乳酸桿菌培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離。選擇出現大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的2株乳酸桿菌。
(五)乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養的選育。將上述2株乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養24小時後，觀察乳酸桿菌與大腸桿菌的數量變化關係。方法如下分別取5ml乳酸桿菌培養物(108cfu/ml)與15ml無菌普通營養肉湯混合，製成含乳酸桿菌培養物的營養肉湯，接種10％大腸桿菌培養，大腸桿菌的起始濃度為107cfu/ml，起始培養液中乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10倍，用0.1N的NaOH調培養液的pH為7.0，置37℃，2.5％CO2培養箱培養24個小時後，取出培養液，培養液經梯度稀釋後，取0.3ml稀釋液均勻塗布MRS瓊脂培養基上，每個梯度的培養液作3個平行樣，MRS瓊脂培養基置5％CO237℃培養箱培養18-48小時，取菌落數在30-150個的平皿計數，以平均值表示乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中乳酸桿菌的數量。同樣地，在培養24小時後取出培養液稀100倍後，取0.3ml稀釋液置於麥康凱瓊脂上，均勻塗布，作3個平行樣，將麥康凱瓊脂平板置37℃，普通培養箱培養18-48個小時，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示。選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌，該乳酸桿菌經中國科學院微生物研究所鑑定為發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)。
四、鑑定結果

五、生物學特性(一)耐酸存活率。本發明選育出來的發酵乳酸桿菌經過pH2.0處理6小時之後的存活率為80.9％。方法如下肉湯組分10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後先用冰醋酸調pH至5.6，再用濃鹽酸將pH調至2.0。置於Hungates管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，涼下來後每管中加1ml發酵乳酸桿菌培養物，在開始時和第6小時分別取樣。進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果。
耐酸存活率的計算公式為S酸＝n6/n0S酸為經過pH2.0處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.0處理前每ml活菌數；n8為pH2.0處理6小時的每ml活菌數。
(二)耐熱存活率。本發明選育出來的發酵乳酸桿菌的耐熱存活率為45％。方法如下肉湯組分10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調pH為6.7，置於Hungtes管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，涼下來後每管中加1ml發酵乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數，同時將Hungates管放置在75℃水浴中加熱15分鐘，取樣進行活菌濃度計數。取樣進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度做3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150的平皿計數，以平均值表示結果。
耐熱存活率的計算公式為S熱＝n1/n0S熱為經過75℃加熱處理後的乳酸桿菌存活率；n0為加熱處理前每ml的活菌數；n1為加熱處理15分鐘後每ml的活菌數。
(三)耐貯藏存活率。本發明選育出來的羅伊氏乳酸桿菌的耐貯藏存活率分別為78％。方法如下肉湯組分10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，溶解後用冰醋酸調pH為6.7，置於Hungates滾管中，每個管放置20mlMRS肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，加塞封口，高壓滅菌，涼下來後每管中加1ml發酵乳酸桿菌培養物，放置在37℃培養箱中16小時後，取樣進行活菌濃度計數培養。室溫下放置30天後，取樣進行活菌濃度計數培養。取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，每個梯度作3個平行樣，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，取平皿中的菌落數50-150個的平皿計數，以平均值表示結果。
耐貯藏存活率的計算公式為S貯＝n1/n0S貯為經過30天貯藏後的乳酸桿菌存活率；n0為貯藏前每ml的活菌數；n1為貯藏30天後每ml的活菌數。
(四)生長量。本發明選育的發酵乳酸桿菌在培養後24小時達到最高生長濃度為1011cfu/ml。方法如下肉湯組分10克胰蛋白腖，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氫二鉀，2克枸椽酸二銨，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸鎂，0.25克四水硫酸錳，5克乙酸鈉，1ml吐溫-80，1000毫升蒸餾水，在500ml的錐形瓶裡裝300ml的MRS肉湯，高壓滅菌，涼下來接種5％的發酵乳酸桿菌培養物。分別在培養後24小時內每個小時、28、32、36、40、44、48小時取培養液進行梯度稀釋後，取0.3ml各梯度稀釋液注入裝有MRS瓊脂(pH6.5)的厭氧Hungates管中，輕輕滾勻，培養24-48小時計算滾管中的菌落數，以每管中菌落數在50-150個的管的梯度作為計算用，每個梯度做3個平行，以平均值表示結果。
本發明提供的格氏乳酸桿菌的用途為該格氏乳酸桿菌與在仔豬十二指腸發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸中發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
本發明提供的羅伊氏乳酸桿菌的用途為該羅伊氏乳酸桿菌與在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸中發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
本發明提供的嗜酸乳酸桿菌的用途為該嗜酸乳酸桿菌與在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在十二指腸中發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌和在結腸中發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
本發明提供的發酵乳酸桿菌的用途為該發酵乳酸桿菌與在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在十二指腸中發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌和在空腸中中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
本發明提供的含乳酸桿菌的用於斷奶仔豬飼料中的複合添加劑，含在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在仔豬十二指腸發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸發揮益生作用的發酵乳酸桿菌；將分離選育出的4種乳酸桿菌按不同的數量比例關係添加到斷奶仔豬曰糧中，以生長性能和腹瀉發病情況為指標優化4種乳酸桿菌的組合，試驗選擇4種乳酸桿菌的6個水平，水平分別為2.0×104、4×104、6×104、8×104、1×105、1.2×105。選擇均勻設計表中6個水平4因素的設計表安排動物試驗。每個處理仔豬飼餵基礎日糧加不同組合的乳酸桿菌製劑，發酵培養後離心得到的乳酸桿菌分別用稀釋劑稀釋後，乳酸桿菌複合製劑以0.1％的比例添加到日糧中。21日齡斷奶仔豬的體重在6.0-10kg之間，試驗設6個處理，每個處理6個重複，每個重複3頭仔豬，試驗期21天。記錄每周的日增重、曰採食量和腹瀉情況。經過均勻設計4.0統計軟體統計分析和綜合比較得到四株乳酸桿菌在仔豬日糧中的合理比例為格氏乳酸桿菌4.0-5.0×104cfu/g；羅伊氏乳酸桿菌6.0-8.0×104cfu/g；嗜酸乳酸桿菌1.0-1.2×105cfu/g；發酵乳酸桿菌2.0-4.0×104cfu/g，組成優質高效的益生素產品。
具體實施例方式
實施例1選擇12頭21±2日齡斷奶的健康杜長大商品雜交仔豬，體重為7.65±1.10公斤，隨機分成2組，在代謝籠上單籠飼養，豬代謝室的室溫控制在25-27℃，處理組的6頭仔豬每天飲水口服液態益生乳酸桿菌製劑，每毫升飲水中各株乳酸桿菌製劑的濃度分別為格氏乳酸桿菌4.0×104cfu/ml；羅伊氏乳酸桿菌6.0×104cfu/ml；嗜酸乳酸桿菌1.0×105cfu/ml；發酵乳酸桿菌4.0×104cfu/ml。對照組的6頭仔豬飲用自來水作為對照，7天後用大腸桿菌K99、K88和987P的混合培養液(108)口服攻毒，一日二次，共一天，測定攻毒後腹瀉發病率和腹瀉指數，觀察益生菌對仔豬的保護作用，試驗期14天。結果表明飲用乳酸桿菌複合製劑組的仔豬的腹瀉率比對照組下降69.1％，腹瀉指數下降66。
實施例2試驗選擇36頭杜長大斷奶仔豬，體重為7.64±1.09kg，按體重和性別隨機分成2組，每組為一個處理，每組18頭，每組小豬隨機分成6個小組，每小組3頭仔豬一個欄圈，欄圈面積為2.0×2.0米，高層網上飼養，每個欄圈為一個重複，每個處理三圈閹公豬，三圈母豬。試驗期間仔豬飼養在全封閉式的保育仔豬舍內，舍內的溫度保持在24-27℃。自由採食，自由飲水。基礎日糧不含有任何抗生素，仔豬的免疫按豬常規獸醫傳染病的免疫程序進行。處理1為基礎日糧添加0.1％乳酸桿菌複合製劑；乳酸桿菌複合製劑中4種菌的比例格氏乳酸桿菌5.0×104cfu/g；羅伊氏乳酸桿菌8.0×104cfu/g；嗜酸乳酸桿菌1.2×105cfu/g；發酵乳酸桿菌2.0×104cfu/g。處理2為基礎日糧添加100mg/kg喹乙醇。試驗期21天，在試驗開始、7天、14天和21天時稱仔豬體重，記錄每周的日增重、飼料採食量、腹瀉指數以及腹瀉發病率。試驗結果表明益生乳酸桿菌製劑與喹乙醇相比，試驗全期可提高仔豬日增重27.6％，提高日採食量18.2％，腹瀉率下降19％，腹瀉指數下降60。
實施例3試驗選擇72頭杜長大斷奶仔豬，體重為8.42±1.15kg，按體重和性別隨機分成3組，每組為一個處理，每組24頭，每組小豬隨機分成6個小組，每小組4頭仔豬一個欄圈，欄圈面積為2.0×2.0米，高層網上飼養，每個欄圈為一個重複，每個處理三圈閹公豬，三圈母豬。試驗期間仔豬飼養在全封閉式的保育仔豬舍內，舍內的溫度保持在24-27℃。自由採食，自由飲水。基礎日糧不含有任何抗生素，仔豬的免疫按豬常規獸醫傳染病的免疫程序進行。處理1為對照組，仔豬飼餵基礎日糧，基礎日糧營養水平按照NRC(1998)的推薦量配製。處理2為基礎日糧添加0.1％乳酸桿菌複合製劑；乳酸桿菌複合製劑中4種菌的比例格氏乳酸桿菌4.5×104cfu/g；羅伊氏乳酸桿菌7.0×104cfu/g；嗜酸乳酸桿菌1.1×105cfu/g；發酵乳酸桿菌3.0×104cfu/g。處理3為基礎日糧添加100mg/kg金黴素。試驗期21天，在試驗開始、7天、14天和21天時稱仔豬體重，記錄每周的日增重、飼料採食量、腹瀉指數以及腹瀉發病率。試驗結果表明益生乳酸桿菌製劑與對照組、金黴素相比，分別可提高仔豬日增重20.3％和9％，提高日採食量15.9％和5.2％，腹瀉率下降46％和13％，腹瀉指數下降69和16。
權利要求
1.一種乳酸桿菌菌種，其特徵在於，該乳酸桿菌菌種為由仔豬胃黏膜中分離選育的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的格氏乳酸桿菌Lactobacillus gasseri，其保減號為CGMCC No.0840。
2.按權利要求1所述的乳酸桿菌菌種，其特徵在於，所述的格氏乳酸桿菌的生物學特性如下1)在pH2.0處理6小時之後的耐酸存活率為133％；2)耐熱存活率為72％；3)耐貯藏存活率為38％；4)該格氏乳酸桿菌在與大腸桿菌混合培養24小時後可使大腸桿菌(K88、K99和987P)下降105個數量級5)該格氏乳酸桿菌在培養後20小時最高生長濃度為1010cfu/ml；
3.一種權利要求1所述的格氏乳酸桿菌的分離選育方法，其分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.4，再用濃鹽酸調pH至4.5；並用Hungates管做成無菌厭氧滾管；取健康斷奶仔豬胃底部黏膜於無菌容器中，用無菌生理鹽水衝洗除去黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，將上述白色針尖大小菌落生物無菌分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物；將上述步驟得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯組分包括10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，蒸餾水1000毫升，並用醋酸調節pH至5.4；二、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌再進行以下選育(一)耐酸選育分別將上述乳酸桿菌24小時的培養物分別按1％接種量(乳酸桿菌與肉湯培養基的體積配比為1∶100)接種在上述肉湯培養基中，選育出接種12-72小時後，在pH3.0的肉湯培養基中可生長的，即使肉湯變渾濁的耐酸乳酸桿菌；所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至3.0；(二)耐高銅選育將上述選育的耐酸乳酸桿菌分別與1克五水硫酸銅加熱溶解後，混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出晾涼後，按1％接種量接種至肉湯培養基中，選育出接種後18-72小時能在該肉湯培養基中生長的同時耐酸和耐高銅的乳酸菌株；所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4；(三)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿；用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直；分別用上述選育出的同時耐酸和耐高銅的乳酸菌18-24小時的培養物將溝填滿，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離；選育出大腸桿菌菌落距離小溝邊緣最遠的同時耐酸、耐高銅和抗大腸桿菌的乳酸桿菌；(四)乳酸濃度為82mg/100ml的格氏乳酸桿菌的選育將上述同時耐酸、耐高銅和抗大腸桿菌的乳酸桿菌培養物按1％接種量接種到肉湯培養基中，培養20小時，離心，取上清液，用超純水稀釋10倍後，在Technicon RA100生化儀上用酶法測定上清液中的乳酸濃度；選育得到一株乳酸濃度為82mg/100ml格氏乳酸桿菌。所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，混合後裝進Hungates管，每管裝適量肉湯，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌。
4.一種乳酸桿菌菌種，其特徵在於，該乳酸桿菌菌種為由仔豬十二指腸黏膜中分離選育的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的羅伊氏乳酸桿菌Lactobacillus reuteri，其保藏號為CGMCC No.0841。
5.按權利要求4所述的乳酸桿菌菌種，其特徵在於，所述的羅伊氏乳酸桿菌的生物學特性如下1)在pH2.0處理6小時之後的耐酸存活率為34.4％；2)耐熱存活率為31％；3)耐貯藏存活率為85％；4)該格氏乳酸桿菌在培養後20小時最高生長濃度為109cfu/ml。
6.一種權利要求4所述的羅伊氏乳酸桿菌菌種的分離選育方法，其分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.0；高壓蒸汽滅菌，並用Hungates管做成無菌厭氧滾管；將取自健康斷奶仔豬十二指腸的黏膜於無菌容器中，先用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述含分離培養基的Hungates無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，在生物無菌操作下，將上述白色針尖大小菌落分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯組分10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，蒸餾水1000毫升，並用醋酸調節pH至5.4；將上述步驟得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；二、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌再進行以下選育(一)耐酸選育分別將上述乳酸桿菌24小時培養物按1％接種在肉湯培養基中，在試驗開始時和第8小時分別用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，計算活菌數，計算存活率。所述肉湯培養基組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先用冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至2.5；存活率的計算公式為S酸＝n8/n0S酸為經過pH2.5處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.5處理前每ml活菌數；n8為pH2.5處理8小時的每ml活菌數。選育出在pH2.5處理8小時後存活率大於18％的乳酸桿菌；(二)耐膽鹽選育製備斜面厭氧瓊脂培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；3克豬膽鹽；1000毫升蒸餾水，用冰醋酸調pH至5.2，將上述培養基溶解完後，分裝在Hungates管，每管裝15ml左右，充1.5％二氧化碳1分鐘，加蓋封口後，高壓滅菌，取出後擺成斜面培養基；分別將上述耐酸性強的乳酸桿菌培養物，用無菌生理鹽水稀釋1000倍後，取0.2ml稀釋液接種到斜面厭氧瓊脂培養基中，輕輕搖蕩使其均勻分散在培養基表面，置37℃培養箱培養18-48小時；選育出能長出菌落的乳酸桿菌；(三)耐高銅選育製備肉湯培養基10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，將上述成分與1克五水硫酸銅分別加熱溶解後，將二者混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出晾涼；按1％接種量將上述能長出菌落的乳酸桿菌培養物接種在上述肉湯培養基中，選育出接種後18-72小時能生長的菌株；(四)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿；用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直；用上述步驟(三)得到的乳酸桿菌培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離；選育出大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌；(五)將步驟(四)得到的離大腸桿菌菌落小溝邊緣最遠的乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養培養24小時後，觀察乳酸桿菌與大腸桿菌的數量變化關係，選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌；其選育方法如下分別取5ml離大腸桿菌菌落小溝邊緣最遠的乳酸桿菌培養物(108cfu/ml)與15ml無菌普通營養肉湯混合，製成含乳酸桿菌培養物的營養肉湯，接種10％大腸桿菌培養物，大腸桿菌的起始濃度為107cfu/ml，起始培養液中乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10倍，用0.1N的NaOH調培養液的pH為7.0，置37℃，2.5％CO2培養箱培養24個小時後，取出培養液，培養液經梯度稀釋後，取0.3ml稀釋液均勻塗布MRS瓊脂培養基上，每個梯度的培養液作3個平行樣，MRS瓊脂培養基置5％CO237℃培養箱培養18-48小時，取菌落數在30-150個的平皿計數，以平均值表示乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中乳酸桿菌的數量；同樣地，在培養24小時後取出培養液稀100倍後，取0.3ml稀釋液置於麥康凱瓊脂上，均勻塗布，做3個平行樣，將麥康凱瓊脂平板置37℃，普通培養箱培養18-48個小時，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示；最後選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的乳酸桿菌為羅伊氏乳酸桿菌。
7.一種乳酸桿菌菌種，其特徵在於，該乳酸桿菌菌種為由健康斷奶仔豬空腸黏膜中分離選育出的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的嗜酸乳酸桿菌Lactobacillus acidophilus，其保藏號為CGMCCNo.0842。
8.按權利要求7所述的乳酸桿菌菌種，其特徵在於，所述的嗜酸乳酸桿菌的生物學特性如下1)在pH2.0處理6小時之後的存活率為69.5％；2)耐熱存活率為62％；3)耐貯藏存活率為59％；4)在培養後18小時達到最高生長濃度1011cfu/ml。
9.一種按權利要求7所述的嗜酸乳酸桿菌的分離選育方法，其分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.0；高壓蒸汽滅菌，並在Hungates管做成無菌厭氧滾管；分離方法為取健康斷奶仔豬空腸的黏膜於無菌容器中，先用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器中，搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述含分離培養基的Hungates無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，將上述白色針尖大小菌落生物無菌分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物，將得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯的組分包括10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，1000毫升蒸餾水，並用醋酸調節pH至5.4；一、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌再進行以下選育(一)耐酸選育製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先用冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至2.5；分別將得到的乳酸桿菌培養物按1％接種量接種於上述肉湯培養基湯中，在試驗開始時和第8小時分別用無菌注射器取出1ml進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，計算活菌數，計算存活率；存活率的計算公式為S酸＝n8/n0S酸為經過pH2.5處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.5處理前塗布的每ml活菌數；n8為pH2.5處理8小時的每ml活菌數，選育出在pH2.5處理8小時後的存活率大於18％的乳酸桿菌；(二)耐膽鹽選育製備斜面厭氧瓊脂培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；3克豬膽鹽；1000毫升蒸餾水，用冰醋酸調pH至5.2，將上述培養基溶解完後，分裝在Hungates管，每管裝15ml左右，充1.5％二氧化碳40秒，加蓋封口後，高壓滅菌，取出後擺成斜面培養基，冷卻後待用；將上述步驟選育出的耐酸性強的乳酸桿菌培養物用無菌生理鹽水稀釋1000倍後，取0.2ml稀釋液接種，輕輕搖蕩使乳酸桿菌均勻分散在培養基表面，置37℃培養箱培養18-48小時，選育出能長出菌落的乳酸桿菌；(三)耐高銅選育製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，將上述成分與1克五水硫酸銅分別加熱溶解後，將二者混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出晾涼後待用；將步驟(二)選育出的能長出菌落的乳酸桿菌培養物按1％接種量分別接種在上述肉湯培養基中，選育出接種後18-72小時能生長的菌株；(四)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直；用將上述步驟(三)選育出接種後18-72小時能生長的菌株培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離，選育出大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的乳酸桿菌；(五)將步驟(四)選育出的離大腸桿菌菌落小溝邊緣最遠的乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養24小時後，觀察乳酸桿菌與大腸桿菌的數量變化關係，選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的嗜酸乳酸桿菌Lactobacillus acidophilus。
10.一種乳酸桿菌菌種，其特徵在於，該乳酸桿菌菌種為由健康斷奶仔豬結腸黏膜中分離選育出的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的發酵乳酸桿菌Lactobacillus fermentum，其保藏號為CGMCCNo.0843。
11.按權利要求10所述的乳酸桿菌菌種，其特徵在於，所述的發酵乳酸桿菌的生物學特性如下1)在pH2.0處理6小時之後的存活率為80.9％；2)耐熱存活率為45％；3)耐貯藏存活率分別為78％；4)在培養後24小時達到最高生長濃度為1011cfu/ml。
12.一種權利要求1所述的發酵乳酸桿菌的分離選育方法，其分離選育步驟如下一、分離用Hungates管制備含分離培養基的無菌厭氧滾管分離培養基組分為10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，13克瓊脂，1000毫升蒸餾水，用醋酸調節pH至5.0；高壓蒸汽滅菌，並在Hungates管做成無菌厭氧滾管；取健康斷奶仔豬結腸的黏膜於無菌容器中，先用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mlHEPES緩衝液的容器杯中。搖動5分鐘，洗脫粘附在黏膜上的細菌；取其上清液注入裝有上述含分離培養基的Hungates無菌厭氧滾管中，輕輕滾動使上清液均勻分布在分離培養基表面；再放入5％-8％CO2培養箱，37℃培養24～72小時，出現白色針尖大小菌落；24-72小時之後，將上述白色針尖大小菌落生物無菌分別轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡，37℃培養24-72小時，分別得到使肉湯變渾濁的菌株培養物；所述的厭氧無菌Rogosa肉湯的組分包括10克胰蛋白腖，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸鈉，2克枸椽酸銨，6克磷酸二氫鉀，0.30克無水硫酸鎂，0.12克硫酸錳，0.03克硫酸亞鐵，1克吐溫-80，1000毫升蒸餾水，並用醋酸調節pH至5.4；將上述步驟得到的使肉湯變渾濁的菌株培養物分別進行革蘭氏染色和接觸酶試驗，分離出呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌；一、選育將上述步驟得到的呈革蘭氏陽性和接觸酶試驗為陰性的乳酸桿菌進行以下選育(一)耐酸選育製備肉湯培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；先用冰醋酸調pH至5.2，再將pH用濃鹽酸調至2.5；分別將上述乳酸桿菌培養物按1％接種量接種在肉湯培養基中，在試驗開始時和第8小時分別用無菌注射器取出培養物進行梯度稀釋後，每個梯度取0.3ml稀釋液在MRS瓊脂(pH5.2)上均勻塗布，平皿放置在37℃，8.5％CO2濃度的二氧化碳培養箱中，進行培養24-48小時，計算活菌數，計算存活率，得出在pH2.5處理8小時後的存活率大於18％的乳酸桿菌；存活率的計算公式為S酸＝n8/n0S酸為經過pH2.5處理後的乳酸桿菌存活率；n0為pH2.5處理前每ml活菌數；n8為pH2.5處理8小時的每ml活菌數。選育出在pH2.5處理8小時後的存活率大於18％的乳酸桿菌；(二)耐膽鹽選育製備斜面厭氧瓊脂培養基，其組分為10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；3克豬膽鹽；1000毫升蒸餾水，用冰醋酸調pH至5.2，將上述培養基溶解完後，分裝在Hungates管，每管裝15ml左右，充1.5％二氧化碳1分鐘，加蓋封口後，高壓滅菌，取出後擺成斜面培養基，冷卻後待用；取上述831株耐酸性強的乳酸桿菌培養物0.1ml，用無菌生理鹽水稀釋1000倍後，取0.2ml稀釋液接種，輕輕搖蕩使乳酸桿菌均勻分散在培養基表面，置37℃培養箱培養18-48小時。選擇123株能長出菌落的乳酸桿菌。(三)耐高銅選育肉湯10克胰蛋白腖；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氫二鉀；2克枸椽酸二銨；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸鎂；0.25克四水硫酸錳；5克乙酸鈉；1ml吐溫-80；1000毫升蒸餾水；用冰醋酸調pH至5.4，將上述成分與1克五水硫酸銅分別加熱溶解後，將二者混合裝進Hungates管，趁熱充1.5％CO21分鐘，封口，高壓滅菌，取出涼下來後，按1％接種量分別接種上述123株乳酸桿菌培養物在上述肉湯中，選擇51株接種後18-72小時能生長的菌株。(四)抗大腸桿菌選育製作麥康凱培養基，溶解後高壓滅菌，無菌操作傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌(K88、K99和987P)培養液(4.0×108cfu/ml)於培養基表面，然後在距平皿中線約3.5cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，補底，溝與劃線的培養物垂直。用上述51株乳酸桿菌培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37℃培養18-24小時後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝邊緣的距離。選擇出現大腸桿菌菌落離小溝邊緣最遠的2株乳酸桿菌。(五)乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養的選育。將上述2株乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養24小時後，觀察乳酸桿菌與大腸桿菌的數量變化關係。方法如下分別取5ml乳酸桿菌培養物(108cfu/ml)與15ml無菌普通營養肉湯混合，製成含乳酸桿菌培養物的營養肉湯，接種10％大腸桿菌培養，大腸桿菌的起始濃度為107cfu/ml，起始培養液中乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10倍，用0.1N的NaOH調pH為7.0，置37℃，2.5％CO2培養箱培養24個小時後，取出培養液，培養液經梯度稀釋後，取0.3ml稀釋液均勻塗布MRS瓊脂培養基上，每個梯度的培養液作3個平行樣，MRS瓊脂培養基置5％CO237℃培養箱培養18-48小時，取菌落數在30-150個的平皿計數，以平均值表示乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中乳酸桿菌的數量。同樣地，在培養24小時後取出培養液稀100倍後，取0.3ml稀釋液置於麥康凱瓊脂上，均勻塗布，做3個平行樣，將麥康凱瓊脂平板置37℃，普通培養箱培養18-48個小時，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示；選育出1株能使大腸桿菌數量下降最多且自身數量較高的發酵乳酸桿菌Lactobacillus fermentum。
13.一種權利要求1所述的格氏乳酸桿菌的用途，其特徵在於，該格氏乳酸桿菌與在仔豬十二指腸發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸中發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
14.一種權利要求1所述的羅伊氏乳酸桿菌的用途，其特徵在於，該羅伊氏乳酸桿菌與在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸中發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
15.一種權利要求1所述的嗜酸乳酸桿菌的用途，其特徵在於，該嗜酸乳酸桿菌與在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在十二指腸中發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌和在在結腸中發揮益生作用的發酵乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
16.一種權利要求1所述的發酵乳酸桿菌的用途，其特徵在於，該發酵乳酸桿菌與在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在十二指腸中發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌和在空腸中中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。
17.一種含乳酸桿菌的用於斷奶仔豬飼料中的複合添加劑，其特徵在於，該飼料複合添加劑含在仔豬胃中發揮益生作用的格氏乳酸桿菌、在仔豬十二指腸發揮益生作用的羅伊氏乳酸桿菌、在空腸中發揮益生作用的嗜酸乳酸桿菌和在結腸發揮益生作用的發酵乳酸桿菌；所述格氏乳酸桿菌為由仔豬胃腸道黏膜中分離選育的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的格氏乳酸桿菌Lactobacillusgasseri，其保藏號為CGMCC No.0840；所述的羅伊氏乳酸桿菌為健康斷奶仔豬十二指腸黏膜中分離選育的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的羅伊氏乳酸桿菌Lactobacillus reuteri，其保藏號為CGMCC No.0841；所述的嗜酸乳酸桿菌為健康斷奶仔豬空腸黏膜中分離選育的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的嗜酸乳酸桿菌Lactobacillus acidophilus，其保藏號為CGMCC No.0842；所述的發酵乳酸桿菌為由健康斷奶仔豬結腸黏膜中分離選育出的於2002年12月2日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的發酵乳酸桿菌Lactobacillus fermentum，其保藏號為CGMCC No.0843；所述格氏乳酸桿菌在該飼料複合添加劑的含量為4.0-5.0×104cfu/g；所述羅伊氏乳酸桿菌在該飼料複合添加劑的含量為6.0-8.0×104cfu/g；所述嗜酸乳酸桿菌在該飼料複合添加劑的含量為1.0-1.2×105cfu/g；所述發酵乳酸桿菌在該飼料複合添加劑的含量為2.0-4.0×104cfu/g。
全文摘要
本發明涉及由仔豬胃腸道中分離選育的格氏乳酸桿菌Lactobacillus gasseri，其保藏號為CGMCC No.0840；羅伊氏乳酸桿菌Lactobacillus reuteri，其保藏號為CGMCCNo.0841；嗜酸乳酸桿菌Lactobacillus acidophilus，其保藏號為CGMCC No.0842；和發酵乳酸桿菌Lactobacillus fermentum，其保藏號為CGMCC No.0843；該四種乳酸桿菌組合，用於製備有效防治仔豬斷奶腹瀉和促進生長的複合益生菌製劑，應用於仔豬斷奶後日糧中。可提高仔豬的日增重，解決仔豬斷奶後的腹瀉問題。
文檔編號A61K35/74GK1511945SQ0215975
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優先權日2002年12月30日
發明者李德發, 黃滄海, 譙仕彥, 馬永喜, 邢建軍 申請人:中國農業大學