含AKT抑制劑和IRE1抑制劑的藥物組合物及其應用的製作方法
2023-12-03 12:03:31
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種含AKT抑制劑和IRE1抑制劑的藥物組合物及其應用。
背景技術：
癌症是僅次於心血管疾病的高死亡率疾病，全球癌症患者和死亡病例都在不斷地增加。新增癌症病例有近一半出現在亞洲，其中大部分在中國，中國新增癌症病例高居世界第一位。尤其是在肝癌、食管癌、胃癌和肺癌等4種惡性腫瘤中，中國新增病例和死亡人數均居世界首位。這些癌症的治療雖然以手術為主，但由於早期患者一般無明顯症狀，在首次被確診的癌症患者中，很多已為中晚期，失去了手術切除的機會，故非手術治療在腫瘤的綜合治療中有著十分重要的地位。其中，化療無論是術前化療、術後輔助化療還是姑息性化療，在綜合治療中佔據舉足輕重的地位。目前常用的化療藥物多以長春瑞濱、紫杉醇、氟尿嘧啶、順鉑、5-氟尿嘧啶為主，其產生的化療反應，如噁心嘔吐較強烈以及對肝腎功能和骨髓損害等，一定程度上限制了其應用。
AKT信號傳導通路是細胞內重要的信號傳導通路之一，它參與調節腫瘤細胞的增殖、存活、遷移、黏附、腫瘤血管生成等過程，並在多種常見腫瘤(如乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌和血液系統腫瘤)中均有高表達。因此，以AKT為靶點的分子靶向治療也逐漸得到人們的重視。其中，MK-2206是一種高度選擇性的AKT1/2/3抑制劑，其主要作用是抑制AKT磷酸化，對250種其他蛋白激酶沒有抑制活性，目前已進入Ⅱ期臨床試驗研究。Perifosine(KRX-0401)是一種新型的AKT抑制劑，為一雜環的烷基磷酸膽鹼，可靶向作用於Akt的pleckstrin同源結構域來抑制AKT的活性，表現出良好的抑制乳腺癌在內的多種實體瘤活性，目前已進入Ⅲ期臨床試驗研究。Ipatasertib(GDC-0068)是一種高選擇性的廣譜AKT抑制劑，靶向作用於AKT1/2/3，比作用於PKA選擇性高620倍，目前已進入Ⅱ期臨床試驗研究。AZD5363作為AKT抑制劑，可有效抑制AKT(AKT1/2/3)的所有亞型，對P70S6K/PKA也具有相似的抑制效果，而對ROCK1/2抑制活性較低，目前已進入Ⅱ期臨床試驗研究。
肌醇需求激酶1(IRE1)是一種定位於內質網膜的跨膜蛋白，參於未摺疊蛋白反應(UPR)信號通路中信息的傳遞。其中，IRE1α/Xbp1通路是UPR的重要傳感通路，IRE1α通過感知內質網壓力，使激酶區域自磷酸化進而激活核酸酶活性，在mRNA水平上剪切其下遊轉錄因子Xbp1，激活一系列的UPR相關基因的轉錄，從而緩解內質網壓力，還可通過非依賴Xbp1的途徑，激活JNK，引發細胞的凋亡。STF-083010是一種特異性IRE1核酸內切酶抑制劑，具有劑量和時間依賴性的細胞抑制能力和細胞毒性，STF-083010可抑制XBP1剪接，抑制IRE1α的核酸內切酶活性，但不影響IRE1α的激酶活性。APY29是IRE1變構調節劑，能抑制IRE1R自磷酸化，並激活IRE1RNase活性。而4μ8C是高效的選擇性IRE1抑制劑，它可阻斷基底(RIDD)接近IRE1的活性部位，並選擇性使Xbp1剪接作用和IRE1介導的mRNA降解失活。目前，關於IRE1α/Xbp1通路的研究多與脂肪代謝調控有關，很少涉及到腫瘤的防治。
隨著腫瘤分子生物學的研究進展，腫瘤分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點，在多種腫瘤的治療中發揮了重要的作用。然而，大部分腫瘤的生物學行為並非由單一信號傳導通路所支配，而是多個信號傳導通路共同起作用的，因此聯合用藥針對多靶點進行靶向治療將不僅旨在減少或延緩耐藥性的出現、降低毒性，而且通過多種藥物對癌細胞殺傷的協同作用取得更好的療效。目前，沒有關於AKT抑制劑和IRE1抑制劑聯合用藥用於抗腫瘤的相關研究報導。
技術實現要素：
為解決現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供一種藥物組合物及其在製備防治腫瘤的藥物中的應用，具體涉及含有AKT抑制劑和IRE1抑制劑的藥物組合物及其在製備治療肺癌、肝癌、食管癌、腸癌、胃癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的藥物中的應用。
本發明提供一種藥物組合物，其包含有AKT抑制劑和IRE1抑制劑。
其中，所述的AKT抑制劑選自MK-2206、Perifosine(KRX-0401)、Ipatasertib(GDC-0068)或AZD5363。
所述的IRE1抑制劑選自STF-083010、APY29或4μ8C。
優選地，所述的AKT抑制劑為MK-2206。
優選地，所述的IRE1抑制劑為STF-083010。
優選地，所述的藥物組合物包含有MK-2206和STF-083010。
進一步地，所述的藥物組合物中MK-2206和STF-083010的摩爾濃度比為1～20:10～60。
優選地，所述的藥物組合物中MK-2206和STF-083010的摩爾濃度比為5:40。
此外，本發明還請求保護上述的藥物組合物在製備防治腫瘤藥物中的應用，所述的腫瘤包括但不限於肺癌、肝癌、食管癌、腸癌、胃癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌。
優選地，本發明請求保護上述的藥物組合物在製備防治肺癌、肝癌、食管癌藥物中的應用。
進一步地，所述的藥物組合物可配以藥學可接受的添加劑製成注射製劑或口服製劑，優選注射製劑，尤其是靜脈注射製劑。
磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(AKT)所組成的信號通路與腫瘤增殖、凋亡、轉移、侵襲及血管生成密切相關。作為該通路的核心，異常活化的AKT通過磷酸化其下遊分子(如mTOR)促進腫瘤惡性增殖及抵抗凋亡，並參與調節腫瘤對放化療及靶向治療的敏感性。特異性抑制AKT分子活化能有效阻斷PI3K/AKT信號通路，抑制腫瘤增殖，促進凋亡。本發明人以MK-2206單獨處理食管癌細胞株Kyse450、Kyse510、TE-1、Eca-109、EC9706，發現MK-2206對食管癌細胞的生長具有一定的抑制作用，使癌症細胞數明顯減少，並且發現MK-2206通過抑制AKT及mTOR的磷酸化，使p-AKT和p-mTOR的表達顯著下調，從而有效阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路，充分發揮抑制腫瘤增殖，促進凋亡效果。
一方面，本發明人以MK-2206和STF-083010聯合用藥，觀察其對食管癌、肺癌、肝癌細胞和正常血管內皮細胞的影響，結果發現，MK-2206和STF-083010聯合用藥，可顯著抑制癌細胞的存活，減少癌細胞的數量，效果顯著優於單獨使用MK-2206或STF-083010，對食管癌、肺癌、肝癌細胞的抑制效果均顯示出較佳的協同作用，同時，聯合用藥對正常血管內皮細胞的毒性較小。
另一方面，本發明人還考察了MK-2206和STF-083010聯合用藥對食管癌細胞克隆形成的影響，結果顯示，與對照組以及單藥組相比，聯合用藥對細胞克隆形成具有明顯的協同抑制作用，聯合用藥組細胞克隆數量最少，同時體積也最小，表明MK-2206和STF-083010聯合用藥聯合用藥對抑制食管癌細胞克隆具有較佳的協同作用。
與現有技術相比，本發明的優勢在於：
本發明提供一種用於防治腫瘤的藥物組合物，具體為將AKT抑制劑和IRE1抑制劑組合使用，更具體為以MK-2206和STF-083010聯合用藥，為腫瘤患者提供一種新的治療方案，所述的MK-2206和STF-083010聯合用藥，可有效抑制腫瘤細胞的生長和細胞克隆形成，效果顯著優於單獨用藥，具有相加或協同效應，同時對正常細胞的毒副作用低，安全性高，可應用於製備抗腫瘤的藥物領域。
附圖說明
圖1MK-2206單獨使用對食管癌細胞生長的影響。
圖2MK-2206單獨使用對食管癌細胞形態的影響。
圖3MK-2206單獨使用對食管癌細胞mTOR/AKT通路的影響。
圖4MK-2206與STF-083010聯合作用對食管癌細胞生長的影響。
圖5MK-2206與STF-083010聯合作用對食管癌細胞形態的影響。
圖6MK-2206與STF-083010聯合作用對食管癌細胞的聯用效果分析。
圖7MK-2206、順鉑、5-氟尿嘧啶與STF-083010聯合作用對腫瘤細胞及正常細胞的影響。
圖8MK-2206與STF-083010聯合作用對食管癌細胞克隆形成的影響。
具體實施方式
以下通過具體實施方式進一步描述本發明，但本發明不僅僅限於以下實施例。
實施例1MK-2206單獨處理後對食管癌細胞生長的影響
首先檢測Kyse450、Kyse510、TE-1、Eca-109、EC9706食管癌細胞對MK-2206單獨使用的藥物敏感性。
1、實驗方法
將腫瘤細胞以每孔4000-6000個細胞的數量接種到96孔板，待細胞貼壁(24h)後，將MK-2206藥物稀釋成一定的梯度濃度，每濃度設5復孔，分為實驗組及調零組加藥。48h後採用MTT法進行細胞活力檢測，每孔加入10μl MTT溶液，繼續培養4h，小心吸除孔內液體，避免接觸孔內結晶物，每孔加入100μl的DMSO，於恆速搖床上避光搖晃。待結晶物充分溶解後，在酶標儀上讀取OD值(波長570nm，參考波長630nm)，測得吸光度A值。
生長抑制率的計算公式為：生長抑制率(％)＝(1-OD實驗組/OD對照組)×100％。根據各濃度的抑制率可作圖得到劑量反應曲線，作圖軟體為Graphpad，採用Logit法精確計算藥物的IC50(half maximal inhibitory concentration)值。具體結果見圖1和圖2。
從圖1可以看出，MK-2206對食管癌細胞株Kyse450、Kyse510、TE-1、Eca-109、EC9706的IC50值分別為14.3、12.4、9.4、7.6和11.5，表明MK-2206對食管癌細胞的生長具有一定的抑制作用。從圖2也可以看出，MK-2206單獨作用於食管癌細胞株Kyse450、Kyse510後，細胞數明顯減少。
實施例2MK-2206單獨使用對食管癌細胞mTOR/AKT通路的影響
利用Western blot方法檢測經MK-2206單獨處理及聯合處理後食管癌細胞Kyse450和Kyse510細胞內mTOR/AKT通路相關蛋白的表達情況。先將Kyse450和Kyse510細胞分別以每孔2×105個細胞的密度接種至6孔板。待細胞貼壁後，按實施例1給藥。處理48h後，分別收取各組細胞全蛋白。先經SDS電泳後，將蛋白轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育所需檢測的蛋白相對應的一抗，4℃孵育過夜。24h回收一抗，用TBST清洗3次，每次5min，之後孵育二抗，室溫孵育1h。後用TBST清洗3次，每次5min，之後ECL顯影，結果見圖3。
從圖3可以看出，在Kyse450和Kyse510細胞中，當用MK-2206單獨處理後，p-AKT和p-mTOR的表達顯著下調，說明MK-2206能夠抑制AKT及mTOR的磷酸化，使p-AKT和p-mTOR的表達顯著下調，從而有效阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路，充分發揮抑制腫瘤增殖，促進凋亡效果。
實施例3MK-2206與STF-083010聯合作用對食管癌細胞生長的影響
將人食管癌細胞Kyse450和Kyse510細胞以每孔4000-6000個細胞的數量接種到96孔板，待細胞貼壁後，加入5μM濃度MK-2206和40μM濃度STF-083010，培養48h後，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，然後棄去培養液每孔加入100μl的DMSO，於恆速搖床上避光搖晃。待結晶物充分溶解後，在酶標儀上讀取OD值(波長570nm，參考波長630nm)，讀取每孔的吸光值，計算兩藥合用後細胞存活率。用CompuSyn軟體進行協同作用綜合因子(Combination Index,CI)分析，結果見圖4。並通過顯微鏡觀察5μM濃度MK-2206和40μM濃度STF-083010聯合作用於食管癌細胞細胞形態變化，結果如圖5。
如圖4所示，5μM濃度MK-2206和40μM濃度STF-083010聯合使用具有很好的聯用效果。從圖5可知，MK-2206與STF-083010兩藥聯用後癌細胞數明顯減少，細胞形態較正常組及單獨用藥組相比無明顯變化。
CI值表示藥物聯合作用時的一個複合指數，CI值小於1、等於和大於1分別表示藥物協同作用、增效作用和拮抗作用。從圖6可以看出，MK-2206和STF-083010對食管癌細胞聯合使用時，其CI值基本都在小於1的範圍內，特別是Kyse450，表明MK-2206和STF-083010在本發明的用量範圍內聯合使用具有很好的協同作用。
實施例4MK-2206、順鉑、5-氟尿嘧啶和STF-083010聯合作用對腫瘤細胞及正常細胞的影響
將Kyse450食管癌、Kyse510食管癌、A549肺癌、HepG2肝癌細胞和HUVEC正常血管內皮細胞以每孔3000-6000個細胞的數量接種到96孔板，待細胞貼壁後，加入對照組、5μM的MK-2206和40μM的STF-083010及聯合用藥組藥物；另鋪細胞Kyse450，按照如下方式進行加藥：對照組、5μM MK-2206、40μM STF-083010、MK-2206+STF-083010、1μg/ml順鉑(CDDP)、順鉑(CDDP)+STF-083010、4μg/ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)+STF-083010，培養48h後，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，然後棄去培養液每孔加入100μl的DMSO，於恆速搖床上避光搖晃。待結晶物充分溶解後，在酶標儀上讀取OD值(波長570nm，參考波長630nm)，讀取每孔的吸光值，計算兩藥合用後的細胞存活及抑制率，結果見圖7。
如圖7所示，YM155和STF-083010在腫瘤細胞中組合使用具有很好的聯合效果，且優於順鉑、5-氟尿嘧啶與STF-083010組合，而對正常HUVEC細胞的毒性較小。
實施例5MK-2206和STF-083010聯合用藥對食管癌細胞克隆形成的影響
將人食管癌細胞Kyse450和Kyse510細胞接種到6孔板，待細胞貼壁過夜後，將細胞分為對照組、MK-2206單藥組、STF-083010單藥組及MK-2206和STF-083010藥物聯合用藥組，分別加入對應的培養基或者藥物溶液，孵育7天，檢測細胞平板克隆形成情況。結果如圖8所示，與對照組以及單藥組相比，聯合用藥對細胞克隆形成具有明顯的協同抑制作用，聯合用藥組細胞克隆數量最少，同時體積也最小。
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護範圍應當以權利要求所限定的範圍為準。對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和範圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。