一種離體培養甜菜再生植株的方法及專用培養基的製作方法

2023-12-05 04:25:11 1

專利名稱：一種離體培養甜菜再生植株的方法及專用培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於組織培養技術領域，具體涉及一種離體培養甜菜再生植株的方法及專
用培養基。
背景技術：
植物組織培養的核心理論依據是植物細胞的「全能性」(Totipotency)。植物細胞 的全能性是指植物的每個細胞都具有該植物的全部遺傳信息，在一定培養條件下離體細胞 具有發育成完整植株的潛在能力。1756年，Duhamel就發現愈傷組織的形成。1838年，施 來登提出植物細胞學說。1839年T. khwarm提出細胞有機體的每一個生活細胞在適宜的外 部環境條件下都有獨立發育的潛能。1878年，Vocbtimg完成切枝經典試驗，奠定了植物組 織培養的基礎。1902年，德國植物學家Haberlandt在細胞學說的基礎上，大膽提出要在試 管中人工培育植物。他預言離體的植物細胞具有發育上的全能性，能夠發育成為完整的植 物體，即任何一個植物細胞都具有形成該植物體的能力。1934年White以番茄為材料，建立 了第一個無限生長的根無性系。1948年，我國植物生理學家崔微和美國科學家合作，用不 同種類和比例的植物激素處理離體培養的菸草莖段，發現腺嘌呤和生長素的比例是控制芽 和根形成的主要條件之一。1958年，美國植物學家F. C. Meward等人用胡蘿蔔韌皮部的細 胞進行培養，終於得到了完整植株，並且這一植株能夠開花結實，證實了 Haberlandt關於 細胞全能性的推斷。甜菜是有名的難以進行組織培養的一種作物，De Greef等(1979)報 道了一種改進的培養基，使一個株系的愈傷組織產生了再生芽。通過器官發生或體細胞胚 的發生來誘導再生植株即離體技術的運用將使大多數植物的再生得到進一步地改善，但由 愈傷組織的器官再生的頻率不高，一些科研工作者已經報導了由愈傷組織直接誘導根的生 成，但完整植株再生成功的例子不多，並且由愈傷組織誘導不定芽再生頻率低、重複性差。甜菜是再生難度較大的植物，再生頻率較其他植物而言相對較低，很難突破10% 以上。目前甜菜生物技術研究工作主要集中在建立高頻率、穩定、簡便可重複的植株再生體 系，從而為開展基因程研究工作奠定堅實的基礎。目前，還未見有關建立高效離體培養甜菜 再生植株及相關培養基的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種離體培養甜菜再生植株的方法及其專用培養基，本發 明簡單易行，操作方便，外植體取材方便，再生植株的再生速度較快，再生頻率較以往的方 法高，可加快甜菜的基因工程育種及開發進度。本發明的技術方案如下一種高效培養離體甜菜再生植株的方法，主要步驟包括A、破除甜菜種子的種殼，選擇並剝出完整無缺、未受傷害、發育飽滿的種子或種 胚；在無菌條件下，種子先用70%乙醇消毒30s，無菌水衝洗2次，再用0. HgC12滅菌 lOmin，用無菌水衝洗5次；將滅菌後的種子或種胚用滅菌濾紙吸乾水份後，接種在1/2MS固體培養基表面，每瓶放10-15粒種子；接種後將種子或種胚放入恆溫培養箱中25°C恆溫暗 培養，待萌發後，在光照培養箱中25°C 2000-30001X繼續光照培養。B、步驟A所得甜菜無菌苗長至1-2片真葉時，將頂芽切下，接種於叢生芽誘導培養 基中繼續光照培養，25°C、20001X、1^!光照培養，2周繼代一次，共繼代2次。C、待頂芽周圍分化出的叢生芽長至34cm時，切下葉柄，接種於專用培養基中繼 續光照培養，25°C、20001X、1^!光照培養，繼代2次，得到再生苗；所述專用培養基按mg/L 或g/L為單位組分及配比如下MS基本培養基+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤 1. Omg/L+吲哚乙酸0. 3mg/L, pH5. 8，加蒸餾水水定容至1L，高壓滅菌；D、將再生苗接種至MS基本培養基繼代培養，直至得到再生植株。甜菜再生植株的專用培養基，按mg/L或g/L為單位組分及配比如下MS基本培養 基+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/L+吲哚乙酸0. 3mg/L, ρΗ5· 8，加蒸餾 水水定容至1L，高壓滅菌。所述的專用培養基在離體培養甜菜再生植株上的應用。所述的高效培養離體甜菜再生植株的方法，所述的甜菜屬糖用甜菜品種或飼用甜 菜品種。所述的高效培養離體甜菜再生植株的方法，所述MS基本培養基:MS有機物+7. 4g/ L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，pH5. 8。所述的高效培養離體甜菜再生植株的方法，所述1/2MS培養基中礦質元素、有機 成分和蔗糖用量為MS培養基的一半，瓊脂用量與MS培養基相同，pH 5. 8。所述的高效培養離體甜菜再生植株的方法，叢生芽誘導培養基:MS基本培養基 +7. 4g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖 +6-苄氨基嘌呤 0. 3mg/L, pH 5. 8。本發明較其它甜菜離體再生培養方法具有以下優點和效果1、由甜菜頂芽誘導出叢生芽，無需經過愈傷組織培養可直接獲得再生植株。2、與傳統方法相比較，再生率提高至14 %，培養方法與培養基配製簡單易操作，再 生周期短。3、取材不受基因型及季節限制，約50d即可獲得再生植株。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施方案1 無菌苗及叢生芽製備在製備無菌苗前先需人工破除甜菜種子粗糙種殼，保證種胚完整。用70%乙醇表 面消毒30s，無菌水衝洗2次；再用0. 1% HgCl2滅菌lOmin，用無菌水衝洗5次。將滅菌後 的種子(或種胚)用滅菌濾紙吸乾水分後，接種在1/2MS固體培養基表面，每瓶放10-15粒 種子。接種後將種子放入恆溫培養箱中25°C恆溫暗培養，待出種子萌發後，在光照培養箱中 250C 2000-30001x繼續光照培養。待甜菜無菌苗長至1-2片真葉時，將頂芽切下，插入叢生芽誘導培養基(MS， 6-BA0.25mg.L-l)中繼續光照培養，2周繼代一次。待頂芽周圍分化出的叢生芽長至34cm 時即可。待分化出的叢生芽長至34cm時，切下叢生芽葉柄，接入添加不同激素及激素不同濃度的培養基(基本培養基為MS培養基)中，在光照培養箱中25°C，光照強度為 2000-30001x，光周期為16/8d，繼續光照培養，約15d左右調查不定芽的再生率，選擇再生 率最高的Bll培養基作為甜菜離體培養再生專用培養基，即該專用培養基配方為MS基本 培養基+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/L+吲哚乙酸0. 3mg/L, ρΗ5· 8 (見 表1)。表1不同激素和濃度組合對再生的影響
權利要求
1.一種離體培養甜菜再生植株的方法，其特徵在於，包括以下步驟A、破除甜菜種子的種殼，選擇並剝出完整無缺、未受傷害、發育飽滿的種子或種胚；在 無菌條件下，先用70 %乙醇消毒30s，無菌水衝洗2次，再用0. 1 % HgCl2滅菌lOmin，用無 菌水衝洗5次；將滅菌後的種子或種胚用滅菌濾紙吸乾水份後，接種在1/2MS固體培養基表 面，每瓶放10-15粒種子；接種後將種子或種胚放入恆溫培養箱中25°C恆溫暗培養，待萌發 後，在光照培養箱中25°C 2000-30001x繼續光照培養；B、步驟A所得甜菜無菌苗長至1-2片真葉時，將頂芽切下，接種於叢生芽誘導培養基中 繼續光照培養，251^20001^1 光照培養，2周繼代一次，共繼代2次；C、待頂芽周圍分化出的叢生芽長至34cm時，切下葉柄，接種於專用培養基中繼續光 照培養，25°C、20001x、16h光照培養，繼代2次，得到再生苗；所述專用培養基按mg/L或g/L 為單位組分及配比如下MS基本培養基+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/ L+吲哚乙酸0. 3mg/L, pH5. 8，加蒸餾水水定容至1L，高壓滅菌；D、將再生苗接種至MS基本培養基繼代培養，直至得到再生植株。
2.如權利要求1所述的離體培養甜菜再生植株的方法，其特徵在於，所述的甜菜屬糖 用甜菜品種或飼用甜菜品種。
3.如權利要求1所述的離體培養甜菜再生植株的方法，其特徵在於，所述MS基本培養 基MS有機物+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5. 8。
4.如權利要求1所述的離體培養甜菜再生植株的方法，其特徵在於，所述1/2MS培養基 中礦質元素、有機成分和蔗糖用量為MS培養基的一半，瓊脂用量與MS培養基相同，pH 5. 8。
5.如權利要求1所述的離體培養甜菜再生植株的方法，其特徵在於，叢生芽誘導培養 基MS基本培養基+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤0. 3mg/L, pH 5. 8。
6.離體培養甜菜再生植株的的專用培養基，其特徵在於，按mg/L或g/L為單位組分及 配比如下MS基本培養基+7. 4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/L+吲哚乙酸 0. 3mg/L, pH5. 8，加蒸餾水水定容至1L，高壓滅菌。
全文摘要
本發明公開了一種高效培養離體甜菜再生植株的方法及專用培養基。本發明的步驟如下A、破除甜菜種子種殼，選擇並剝出完整無缺、未受傷害、發育飽滿的種子或種胚。經滅菌置於1/2MS固體培養基，光照恆溫培養得到無菌苗。B、步驟A所得甜菜無菌苗長至1-2片真葉時，將頂芽切下，接種於叢生芽誘導培養基中，25℃、2000lx、16h光照培養，2周繼代一次，共繼代2次。C、待頂芽周圍分化出的叢生芽長至3-4cm時，切下葉柄，接種於專用培養基中，25℃、2000lx、16h光照培養，繼代2次，得到再生苗，再生頻率高達14％。本發明所使用方法及培養基具有再生頻率高，操作方法及培養基配製簡單易行，操作方便。再生周期短，不受基因型及季節限制。
文檔編號A01H4/00GK102124951SQ20111000872
公開日2011年7月20日 申請日期2011年1月17日 優先權日2011年1月17日
發明者危曉薇, 李建平, 足木熱木, 邵琳, 郝曉燕, 陳勳基, 黃全生 申請人:新疆農業科學院核技術生物技術研究所